טביעת אצבע של דנ"א היא כלי נפוץ במדעי הביולוגיה ומיושם בבדיקות אבהות, כמו גם במחקרים משפטיים או פילוגנטיים. פרוטוקול זה נועד לספק לתלמידים לתואר ראשון את העקרונות הבסיסיים של טביעת אצבע DNA בשיעורי מעבדה. הוא מבוסס על לוקוס D1S80 האנושי, מספר משתנה של אזור חוזר טנדם, אשר אללים יכולים להיות שונים באורך בין אנשים.
מיצוי DNA, PCR, אלקטרופורזה ג'ל, וניתוח עוקב יכול להיות מסובך לבצע, במיוחד אם נעשה בפעם הראשונה. ההדגמה החזותית של כל הצעדים מאפשרת לצופים להתבונן בפרקטיקה כללית, בפרטים ובאמצעי זהירות שיש לנקוט בעת ביצוע פרוטוקול חזק זה. כדי לחלץ DNA מתאי אפיתל רירית buccal, להתחיל על ידי קצירת התאים באמצעות ספוגית אוראלי סטרילית.
השתמש ספוגית לשפשף במרץ על החלק הפנימי של הלחי במשך 30 עד 40 שניות. מניחים את קצה ספוגית האוסף לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי שכותרתו ולשבור את אורך הפלסטיק המשתרע מעבר לקצה, ולסגור את הצינור. מחממים בלוק חימום ל-65 מעלות ומכינים את כל המאגרים והפתרונות הנדרשים.
הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון lyse לספוגית, לוודא כי המדגם הוא שקוע לחלוטין בתמיסת lyse ומערבולת המדגם לפחות חמש שניות. דגירה את המדגם במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס ומערבולת מדי פעם. לאחר הדגירה, להסיר את ספוגית על ידי לחיצה עליו על קיר הצינור כדי לקבל נפח מדגם מקסימלי.
הוסף 100 מאגר denaturation microliter לתאי lyse ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך הצינור עד משקע לבן הופך גלוי. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז צנטריפוגה המדגם במשך חמש דקות ב 17, 950 G.Transfer 450 microliters של supernatant לתוך נקי, 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה צינור. לאחר מכן להוסיף 450 מיקרוליטר של iso 2-propanol ומערבבים ביסודיות על ידי היפוך הצינור כדי לזרז את ה- DNA.
דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה במשך חמש דקות. להשליך את supernatant להפוך את הצינור על מגבת נייר נקייה לייבש את גלולה. לשטוף את ה-DNA עם 500 מיקרוליטר של 70% אתנול, צנטריפוגה זמן קצר לדקה אחת, ולהשליך את supernatant.
כדי לייבש את גלולה לחלוטין, דגירה את המדגם במשך חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. לבסוף, להוסיף 30 microliters של חיץ elution ודגרת במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס כדי להשבית את sys ה-DNA. הכן את התערובת הראשית על-ידי הוספת מאגר PCR ירוק, DNTPs, פריימרים, מים ופולימראז לצינור מיקרו-צנטריפוגה.
תווית צינורות PCR עם מספרי מדגם aliquot 45 microliters של תערובת PCR הראשי לכל צינור PCR. לאחר מכן, הוסף חמישה מיקרוליטרים DNA, או, עבור פקד ללא תבנית, להוסיף מים. סגור את צינורות PCR וצנטריפוגה אותם לזמן קצר.
הנח את הצינורות במחזור התרמי והפעל את תוכנית PCR. לאחר השלמת התוכנית, אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. מכינים ג'ל 1.5% agarose על ידי שקילה 1 1/2 גרם של אבקת agarose ומערבבים אותו עם 100 מיליליטר של פתרון חיץ TAE בבקבוק.
מחממים את תערובת agarose בזהירות במיקרוגל מערבולת את התערובת בין עד agarose הפך מומס לחלוטין. שים לב כי עיכובים רותחים עלולים להתרחש. לאחר קירור קצר של תערובת agarose, להוסיף שני microliters של ירוק Pec.
יוצקים את הג'ל ומשתמשים במסרק עם מספיק בארות לדגימות. לאחר פולמור מלא של ג'ל agarose, לטעון את בארות עם 10 microliter של כל דגימות PCR ולהוסיף תקן משקל מולקולרי לבארות האגף. הפעל את הג'ל ב 150 וולט במשך כ 40 דקות.
כדי לדמיין את מוצרי PCR, דמיין את הג'ל באמצעות אור אולטרה סגול. לניתוח האללים המוגברים של D1S80, הניחו סרגל ליד תקן המשקל המולקולרי החל מהבארות בתמונת ג'ל הצילום. מדוד את המרחק עבור כל רצועה של תקן העובי והקלט את האורכים בתוכנית חישוב טבלה.
לאחר מכן, קבע את הלוגריתם של כל גודל קטע של תקן המשקל. הכנס פיזור באמצעות גדלי שברים שעברו המרת יומן, סטנדרטיים במשקל, ואת המרחקים הנמדדים מהג'ל שלך. התאם קו מגמה והצג את משוואת הרגרסיה ואת ערך הריבוע R.
בטבלה חדשה, הכנס את מרחקי האמצעים מאמפליקונים PCR לבארות. כדי לקבוע את גודל אמפליקונים אלה, השתמש במשוואת הרגרסיה מתוך הרגרסיה הליניארית וחשב את האנטילוג כדי להשיג את גודלי הקטעים בזוגות הבסיס מהאמפליקונים. לבסוף להקצות את היחידות החוזרות של 16 זוגות בסיסים לכל amplicon נמדד.
מיצוי הדנ"א וההגברה של לוקוס D1S80 היה מוצלח עבור כל האנשים שנחקרו, והבקרה ללא תבנית בנתיב 10 לא הראתה אמפרליקונים. מניתוח אורך הקטע, האנשים סווגו בהיותם הומוזיגים או הטרוזיגים עם שני אללים. מספר היחידות החוזרות של החזרות הדו-מושביות היה ברור שניתן להתייחס אליו, וכעת הוא יכול לשמש לניתוח נוסף.
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה וחסכונית ליישום טביעת אצבע מולקולרית בשיעורים מעשיים לתואר ראשון. ניתן להשלים את ההליך כולו בתוך יום עבודה אחד, והוא כולל ארבעה שלבים שונים. בשלב הראשון, תבנית הדנ"א מוכנה.
תאי אפיתל Buccal נקצרים על ידי דגימת ספוגית. ספוגיות אוראליות הן כלי אמין כדי לספק כמות ואיכות מספקת של תאים להפקת DNA. יתר על כן, פרוטוקול מיצוי ה- DNA אינו משתמש בממסים אורגניים, וזה יתרון במחלקות מעבדה לתואר ראשון.
ניתן להשלים את השלב הראשון תוך 90 דקות או פחות. בשלב השני, לוקוס D1S80 מוגבר על ידי PCR. תנאי PCR המוצגים כאן הם חזקים גם במקרה של איכות ירודה של תבנית ה- DNA.
שלב זה ניתן להשלים תוך שעתיים וחצי. מוצרי PCR מנותחים לאחר מכן על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. אלקטרופורזה ג'ל Agarose יש יתרונות רבים בהשוואה לטכניקות אחרות, כגון הימנעות של רכיבים מסוכנים טכניקת הכנה פשוטה.
ניתוח זה ניתן להשלים בתוך 90 דקות. לאחר האלקטרופורזה, ניתן לנתח את תוצאות אורך הקטע תוך 90 דקות על ידי ניתוח רגרסיה ליניארית, המבוצע באמצעות תוכנית חישוב טבלה, או באמצעות מחשבון פשוט. לסיכום, ניתן להשתמש בשיטת טביעת האצבע המוצגת במעשים מעשיים כדי ללמד את השימוש בסמנים מולקולריים ואת יישומו במדע הביולוגי.
