מיקרוסקופ בעבודה זו נערך ב מכון של טרנספורמטיבי ביו-מולקולות (WPI-ITbM) של אוניברסיטת נאגויה ו נתמכת על ידי יפן מתקדמת צמח המדע רשת. עבודה זו נתמך על ידי מענקים של יפן ומדעי הטכנולוגיה סוכנות (ERATO פרוייקט תוצרת הארץ, M.U.) ומן החברה יפן הקידום של המדע: מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 ו JP15H05955 M.U., Nos. JP16H06465, JP16H06464 ו JP16K21727 עבור T.H), מענק הסיוע מדענים ומפתחים צעירים (B, Nos. JP24770045 ו JP26840093 עבור M.U.), ואת מענק של הסיוע למחקר גישוש מאתגר (מס ' JP16K14753 על M.U.).

1. הכנה של המדיום תרבות חוץ גופית של ביצית <ol><li>הופכים את המדיום הנוזלי לתרבות ביצית הפרייה (&#34; N5T בינוני &#34;) המכילה 1 x Nitsch הבזליים תערובת, 5% (w/v) טרהלוז וגופרית והרכבו 0.05 % (w/v) 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES)-קו (pH 5.8), ו- 1 x Gamborg &#39; פתרון ויטמין s.</li>
	<li>להתאים את ה-pH ל 5.8 עם קו-</li>
	<li>לחטא המדיום מאת autoclaving זה (121 מעלות צלזיוס, 20 דקות) או סינון זה דרך מסנן 0.22-מיקרומטר. 
	הערה: המדיום סטיריליים שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2-3 חודשים.</li>
</ol> 2. הכנת המכשיר מערך Micropillar PDMS <ol><li>לחתוך את המכשיר micropillar PDMS על ידי סכין, גילוח או מספריים כדי להתאים לתוך החלק זכוכית (φ 14 מ מ) של צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ. 
	הערה: הנוהל המלא של הבנייה התקן PDMS מתואר ניירות הקודם 8 , 9, ולכן הפרטים מושמטים כאן. זכוכית-התחתון מנות עם אמצעי אחסון קטן יותר, כגון לוחות 4-ובכן או 96-ובכן, יכול לשמש עבור הדמיה לטווח קצר בלי המכשיר.</li>
	<li>Sterilize בחלק העליון של המכשיר PDMS תחת אור UV במשך 15 דקות</li>
	<li>הפעל את ההתקן PDMS ליד באמצעות פינצטה קצה מרובע, תשאיר את זה מתחת UV אור למשך 15 דקות לחטא התחתון.</li>
	<li>להעביר את המכשיר PDMS סטיריליים לתוך תבשיל תרבות 35 מ מ ולהוסיף המדיום N5T עד המכשיר לחלוטין טבולים המדיום (כ 5-7 מ"ל).</li>
	<li>לשים את הצלחת לתוך תא ואקום, ולהפחית את הלחץ דגה. לשמור על שואב אבק עבור h 3 ללון עד האוויר במכשיר מוחלף על-ידי מדיום. 
	הערה: המכשיר יכול להיות מנותק על ידי בועות אוויר תחת ואקום חזק.</li>
	<li>לקחת את המכשיר מתוך קערה על ידי החזקתה עם פינצטה קצה מרובע ושים אותו על מגבת נייר כדי להסיר את בינונית נוספת בצד ולמטה. 
	הערה: המדיום על המערך micropillar (משטח עליון) אין להסירו כי הוא ישמש לגידול ביצית.</li>
	<li>להעביר את המכשיר על גבי זכוכית שקופית 76 מ"מ x 26 מ"מ, המבטיח לשמור את החלק micropillar כמו הצד העליון, ולכסות את ההתקן עם 35 מ מ תרבות מאכל המכסה כדי למנוע המדיום ממנו להתייבש במהלך החילוץ ביצית הבאה.</li>
</ol> 3. Silique ניתוח והפקת ביצית <ol><li>לחטא מחט (0.40 מ מ G) עם פינצטה בסדר על ידי מנגב עם 70% אתנול. המחט מתבצע בקלות על ידי הצמדתו מקל מזרק או עץ.</li>
	<li>לבדוק את התפרחת של הצמח ובחר את siliques המתאים לניסוי. Siliques כ 5 מ מ מכילים מופרות, siliques 8-10 מ מ כולל צעירים העוברים הכדוריים.</li>
	<li>לסלק את siliques באמצעות פינצטה, ומניחים אותם על סרט הדבקה דו-צדדי על כוס שקופית 76 x 26 מ מ. אחד silique מכיל על 40-60 ovules, 3-4 siliques (כלומר, ovules 120-240) מספיקים עבור התקן אחד.</li>
	<li>פתח את silique (קיר השחלה) כדי לראות את ovules בתוך באמצעות מחט סטיריליים פינצטה תחת stereomicroscope. לחתוך רק את הקיר השחלה כך ovules אינן פגומות.</li>
	<li>להעביר את silique נפתח אל המדיום N5T במכשיר PDMS (להכין בשלב 2.7), ולשחרר את ovules לתוך האמצעי עם מחט או פינצטה.</li>
	<li>שמה כוס כיסוי קטן (18 מ מ x 18 מ"מ) על גבי המכשיר PDMS כדי לדחוף את ovules לתוך השטחים במערך micropillar.</li>
	<li>תוריד את הזכוכית המכסה על-ידי משיכתו אופקית באמצעות פינצטה או האצבעות כדי להסיר בינונית נוספת.</li>
	<li>הפוך את ההתקן PDMS למקם אותו לתוך צלחת זכוכית-התחתון 35 מ מ, מעט הקש את המכשיר על ידי דחיפת באמצעות את הפינצטה מרובע עצה בשביל להקל הזכוכית.</li>
	<li>בינוני N5T שופכים בעדינות לתוך הזכוכית-התחתון צלחת על ידי decanting הבקבוק בינונית עד המכשיר PDMS לחלוטין טבולים המדיום, לאטום את המנה עם סרט פרפין. 
	הערה: המכשיר PDMS ניתן למחזר, אך התקנים ישנים מדי מנותקים בקלות מהחלק התחתון זכוכית. בנוסף, המכשיר יכול לעוף אם זה לא הוא לחלוטין degassed בשלב 2.5 או המדיום הוא שפך מהר מדי.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> איור 2: סכימטי נוהל הכנת הדוגמא. 
לזרימה סכמטית לשלבי 3.5 ל 4.1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 4. time-lapse הדמיה <ol><li>למקם את המנה זכוכית-התחתון זה הוכן בשלב 3.9-מיקרוסקופ הפוכה, ובחר ovules מתאימים כדי להתמקד על. 
	הערה: כי ovules נבדלים הבמה, מיקום, כיוון, ovules מתאים צריך להימצא על-ידי בדיקת קרינה פלואורסצנטית שלהם סמן.</li>
	<li>להתחיל לחיות-ההדמיה על פי היצרן &#39; s ההוראות של מערכת מיקרוסקופ. 
	הערה: פרמטרים וציוד מיקרוסקופ הן מגוונות, ובכך המשתמשים צריך לבחור את ההגדרות המתאימות מתאימים לצורך הניסוי. כדוגמה, ההגדרות המשמשות כתב יד זה מפורטים בטבלה 1-</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>ציוד/הגדרת</td> <td>איור 3 (א) ומשלימה קטעי וידאו 1 ו- 4</td> <td> איור 3 (ב) ו- 2 הסרטונים משלימה</td> <td>משלימה 3 הסרטונים</td></tr> <tr><td>סריקה בלייזר הפוכה מיקרוסקופ (A1R MP)</td> <td>מיקרוסקופ</td> <td>ספינינג-דיסק קונאפוקלית מיקרוסקופ הפוכה (CSU-W1)</td> <td> תיבת סוג הפוכה מיקרוסקופ קונפוקלי המערכת עם תא הדגירה יציב (CV1000)</td></tr> <tr><td>לייזר</td> <td>לייזר הפמטו-שנייה Ti:sapphire</td> <td>לייזרים LD 488 ננומטר, 561-ננומטר</td> <td>לייזר LD 488 ננומטר, 561-nm</td></tr> <tr><td>O עדשה bjective</td> <td>40 X עדשה המטרה טבילה במי (נה = 1.15) טבילה בינונית</td> <td>60 X עדשה המטרה של טבילה שמן סיליקון (NA = 1.30), רכוב על כונן המוקד Piezo</td> <td>40 X עדשה המטרה (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>זיהוי או</td> <td>חיצוניים שאינם descanned PMT חאספ גלאי</td> <td>EMCCD מצלמה</td> <td>מצלמה EMCCD</td></tr> <tr><td>Dichroic מראה</td> <td>DM495, DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>מסנן</td> < td > הלהקה לעבור מסננים; 534/30 nm ו- 578/105 nm</td> <td>הלהקה לעבור מסננים; 520/35 ננומטר, 593/46 ננומטר</td> <td>הלהקה לעבור מסננים; 520/50 ננומטר, 617/73 nm</td></tr> <tr><td>פרוסה לאורך ציר z</td> <td>z-במחסן 31 עם מרווחי 1-מיקרומטר</td> <td>z-במחסן 17 עם 3-מיקרומטר אינטר vals</td> <td>z-במחסן 7 עם 5-מיקרומטר מרווחי</td></tr> <tr><td>מרווח הזמן</td> <td>20 דקות</td> <td>5 דקות</td> <td>10 דקות</td></tr></tbody></table> טבלה 1: מיקרוסקופים ומערכות ההגדרות המשמשות בכתב היד. 
מיקרוסקופים והפרמטרים הן מגוונות, וכך כל משתמש צריך לבחור את המערכת המתאימים לניסוי.
<ol start="3"> <li>לבדוק את רצף תמונות נרכשות, ולהמיר אותו לתבנית סרט כלליות, כגון .avi או .mov למצגת. 
	הערה: אם התוכנה המיקרוסקופ לא פלט את התמונות כתבנית סרט, זה אפשרי לשמור את התמונות. tif ולאחר מכן לפתוח אותם ב- ImageJ, תוכנית קוד פתוח בהשראת התמונה NIH, כדי לשנות את סוג הקובץ. ImageJ הינה מסופקת במלון: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ יכול לשמש גם כדי להפוך Z-sטאק הסרט, כגון התחזית בעוצמה מקסימלית, כפי שמתואר ב: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כתב יד זה מציג פשוט במבחנה ביצית טיפוח פרוטוקול זה יעיל לשימוש ההדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות עוברי.
העיצוב של המכשיר PDMS עשוי להזדקק אופטימיזציה לפי השלב העובר. המכשיר המפותח הראשון היה מערך microcage כדי להתאים את הכיוון וכדי לתקן את המיקום של ovules9ולאחר מכן...

התוכנית גוף בסיסי של אורגניזם מתפתח זיגוטה חד־תאיות. ברוב הצמחים פורחים, חטיבת zygotic מחוללת על הפסגה של התאים הבזליים, אשר לפתח לתוך לירות ואת שורש, בהתאמה1. לכן, חשוב להבין איך נוצר בגוף הצמח במהלך מופרה, אך לא היה כלי יעיל כדי לצפות ישירות את הדינמיקה של החיים מופרות, עוברי כי הם מפתחים עמוק בתוך הפרח. מספר מינים monocot, כגון תירס, אורז, שיטת הפריה במבחנה כבר הוקמה2,3. בשיטה זו, מבודד זרע ותאי ביצה הם התמזגו חשמלית או כימית, התא שנוצר יכול להתפתח צמח פורה. עם זאת, בצמחים dicot, יש אין במבחנה שיטת הדישון יכול לייצר עוברי תקין, ככל הנראה מפאת מצב בלתי-מסונכרנות מחזור התא של זכר ונקבה גמטות4,5. בנוסף, הרקמה שמסביב העובר (האנדוספרם) משחק תפקידים חשובים העובר פיתוח6.
במינים dicot מודל, לבנה א, שיטת טיפוח במבחנה פותחה על-ידי התמקדות כל ביצית, אשר מכיל העובר ואת האנדוספרם7. מערכת זו שימשה בהצלחה כדי לנתח את ההשפעות של ריאקטיבים כימיים שונים על מופרה, אבל היא לא מתאימה הדמיה בצילום מואץ כי יש לו סיכויי הישרדות נמוכה. לכן, הרומן במבחנה ביצית טיפוח מערכת פותחה על מנת להתחיל מוקדם ככל השלב זיגוטה ולייצר צמחים פורייה-יחס גבוה8. לאחר ניסויים שונים, זה היה למצוא אותה מדיום Nitsch, טרהלוז לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של ovules8. בנוסף, כי שלייה מתרחב כפי שהוא גדל ולכן לעתים קרובות יוצא מהשדה תצפית במיקרוסקופ, מכשיר PDMS פותחה כדי לתקן את ביצית ב בינוני9. המכשיר PDMS איפשרה ההדמיה לטווח ארוך 3-4 ימים, וזה מספיק כדי לעקוב אחר ההתפתחות זיגוטה העובר בשלב הלב. באמצעות שיטה זו, הוא הופך להיות אפשר לדמיין את הדינמיקה של קיטוב זיגוטה, העובר תכנים, לא רק בתנאים רגילים, אבל גם בנוכחות מעכבי כימי או שונים רקעים מוטציה8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
איור 1: תרשים סכמטי של הסמנים פלורסנט ספציפיים המשמשים מופרות באופן חזותי של עוברי דרך ביצית. הזיגוטה תודרנית מתפתח העובר בתוך ביצית, אשר נוצר בתוך הפרח. ב במבחנה שיטת הטיפוח הזאת, זיגוטה את ואת העובר הם נצפו דרך להפרייה, ולכן חשוב להשתמש מסוים סמנים פלורסנט אינם מבוטאים ברקמות אחרות ביצית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch basal salt mixture</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>trehalose dihydrate</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s vitamin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35-mm glass-bottom dish</td><td>Matsunami Glass</td><td>D111300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &amp;times; 26 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &amp;times; 18 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>needle (gauge 0.40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Immersion medium Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Electric</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

רוב הצמחים פורחים, זיגוטה את ואת העובר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא, ובכך כבר זמן רב המסתורין של איך הם מפתחים באופן דינאמי; לדוגמה, איך הזיגוטה קוטביות (ניגודים) להקים את ציר הגוף, איך העובר מציין הגורלות תא שונים במהלך היווצרות האיברים. כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית תרבות שיטה לבצע הדמיה לחיות תאים של פיתוח מופרות, העוברים של תודרנית לבנה. המדיום טיפוח ממוטבת מאפשר מופרות או עוברי מוקדם כדי לגדול לתוך צמחים פורייה. על ידי שילוב זה עם מכשיר מערך של micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), ביצית מתקיים המדיום הנוזלי באותה תנוחה. הקיבעון הזה חיוני להתבונן באותה ביצית תחת מיקרוסקופ במשך מספר ימים ממחלקת zygotic לבמה העובר מאוחר. ההדמיה לחיות תאים וכתוצאה מכך ניתן לנטר את הדינמיקה בזמן אמת של קיטוב זיגוטה, כגון העברה גרעינית ו שחלוף שלד התא, וגם לעיתוי חלוקת התא תא מפרט הגורל במהלך העובר המתבנת. יתר על כן, שיטת הטיפוח הזאת ביצית יכול להיות משולב עם טיפולים מעכב כדי לנתח את השפעת גורמים שונים על התפתחות העובר, ועם מניפולציות אופטי כמו שיבוש לייזר כדי לבחון את תפקידה של תקשורת.

באמצעות שיטת הטיפוח הזאת ביצית, שיטה זו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה החיים של קיטוב זיגוטה, העובר המתבנת. זה הישג כי בעבר היה שום טכניקה כדי להמחיש את אופן הפעולה בזמן אמת של הזיגוטה ואת העובר, אשר מוסתרים עמוק בתוך רקמת אמא. איור 3A ו- 1 וידאו משלימה לה...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K Views.  Nagoya University. כתב יד זה מתאר במבחנה ביצית טיפוח שיטה המאפשרת הדמיה לחיות תאים של תודרנית מופרות, העוברים. בשיטה זו הוא מנוצל כדי להמחיש את הדינמיקה תאיים במהלך זיגוטה קיטוב מפרט הגורל תא בפיתוח עוברי.

Video: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) and the moment of the radiation of Angiosperms. This led to the hypothesis that alterations in GMF polarity may play a role in plant evolution. Here, we describe a method to test this hypothesis by exposing Arabidopsis thaliana to artificially reversed GMF conditions. We used a three-axis magnetometer and the collected data were used to calculate the magnitude of the GMF. Three DC power supplies were connected to three Helmholtz coil pairs and were controlled by a computer to alter the GMF conditions. Plants grown in Petri plates were exposed to both normal and reversed GMF conditions. Sham exposure experiments were also performed. Exposed plants were photographed during the experiment and images were analyzed to calculate root length and leaf areas. Arabidopsis total RNA was extracted and Quantitative Real Time-PCR (qPCR) analyses were performed on gene expression of CRUCIFERIN 3 (CRU3), copper transport protein1 (COTP1), Redox Responsive Transcription Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), a cytosolic Ascorbate Peroxidase1 (APX1), and NADPH/respiratory burst oxidase protein D (RbohD). Four different reference genes were analysed to normalize the results of the qPCR. The best of the four genes was selected and the most stable gene for normalization was used. Our data show for the first time that reversing the GMF polarity using triaxial coils has significant effects on plant growth and gene expression. This supports the hypothesis that GMF reversal contributes to inducing changes in plant development that might justify a higher selective pressure, eventually leading to plant evolution.

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; ביטוי פיתוח וג&#39;ין

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses with an egg cell or a central cell. Thus, two independent fertilization events take place almost simultaneously. The fertilized egg cell and central cell develop into zygote and endosperm, respectively. Therefore, precise control of double fertilization is essential for the ensuing seed development. Double fertilization occurs in the female gametophyte (embryo sac), which is deeply hidden and covered with thick ovule and ovary tissues. This pistil tissue construction makes observation and analysis of double fertilization quite difficult and has created the present situation in which many questions regarding the mechanism of double fertilization remain unanswered. For the functional evaluation of a potential candidate for fertilization regulator, phenotypic analysis of fertilization is important. To judge the completion of fertilization in Arabidopsis thaliana, the shapes of fluorescence signals labeling sperm nuclei are used as indicators. A sperm cell that fails to fertilize is indicated by a condensed fluorescence signal outside of the female gametes, whereas a sperm cell that successfully fertilizes is indicated by a decondensed signal due to karyogamy with the female gametes&#8217; nucleus. The method described here provides a tool to determine successful or failed fertilization under in vivo conditions.

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

We demonstrate a method to determine successful or failed fertilization on the basis of sperm nuclear morphology in Arabidopsis double fertilization using an epifluorescence microscope.

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biology

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקולים לקבלת Zygotic וסומטי עוברים ללימוד תקנה של פיתוח העובר מוקדם בקטניות הדגם

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות

גאומגנטית שדה (GMF) וצמח אבולוציה: לחקור את ההשפעות של ביטול GMF ב

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

הערכה של מדינת הדישון באמצעות מורפולוגיה גרעינית של הזרע בערידופזיס הפריה כפולה

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב

הדמיה חיה של קליטת צינור אבקה Arabidopsis והפריה כפולה בשיטת Semi-in vitro cum septum