Mikroskopie in dieser Arbeit wurde durchgeführt an das Institut der transformativen Biomoleküle (WPI-ITbM) der Universität Nagoya und von Japan Advanced Plant Science Network unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der Japan Science and Technology Agency (ERATO Projekt, t.h. und M.U.) und der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften: eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 und JP15H05955 für M.U. und Nos. JP16H06465, JP16H06464 und JP16K21727 für T.H), eine Beihilfe für den wissenschaftlichen Nachwuchs (B, Nos. JP24770045 und JP26840093 für M.U.), und eine Beihilfe für anspruchsvolle Pionierforschung (No. JP16K14753 für M.U.).

1. Vorbereitung des Kulturmediums In vitro- Ovulum <ol><li>machen das flüssige Medium für die in-vitro- Kultur von Ovulum (&#34; N5T Medium &#34;) mit 1 X Nitsch basale Salzgemisch, 5 % (w/V) Trehalose Dihydrat, 0,05 % (w/V) 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES)-KOH (pH-Wert 5,8), und 1 X Gamborg &#39; s Vitamin Lösung.</li>
	<li>Einstellen den pH-Wert 5,8 mit KOH.</li>
	<li>Sterilisieren dem Medium durch Autoklavieren (121 ° C, 20 min) oder durch einen 0,22-µm-Filter filtern. 
	Hinweis: Das sterilisierte Medium kann bei 4 ° C für ca. 2-3 Monate gespeichert werden.</li>
</ol> 2. Vorbereitung des Geräts PDMS Micropillar Array <ol><li>schneiden die PDMS Micropillar Gerät durch ein Messer, Schere, passen in das Glasteil (14 mm φ) ein 35 mm Glasboden Teller oder Rasierklinge. 
	Hinweis: Das gesamte Verfahren der PDMS-Gerätekonstruktion ist in früheren Papiere 8 , 9 beschrieben und somit die Details sind hier weggelassen. Glasboden Gerichte mit kleineren Stückzahlen, z. B. 4-Brunnen oder 96-Well-Platten, können für kurzfristige Bildgebung ohne das Gerät verwendet werden.</li>
	<li>Sterilisation der Oberseite des Geräts PDMS unter UV-Licht für 15 min.</li>
	<li>PDMS Gerät durch quadratische Spitze Pinzette, und halten Sie es unter UV-Licht für 15 min auf die Unterseite zu sterilisieren.</li>
	<li>Übertragen die sterilisierte PDMS-Gerät in einer Kulturschale 35 mm und das N5T Medium hinzufügen, bis das Gerät vollständig in das Medium (ca. 5-7 mL) getränkt ist.</li>
	<li>Setzen Sie die Schale in eine Vakuumkammer und reduzieren Sie den Druck zu entgasen. Halten Sie für 3 h über Nacht, bis die Luft in das Gerät durch Medium ersetzt wird Staubsaugen. 
	Hinweis: Das Gerät kann durch Luftblasen unter einen starken Unterdruck abgenommen werden.</li>
	<li>Bringen Sie das Gerät aus der Schale, indem Sie es mit einer Pinzette quadratische Spitze halten und legte es auf ein Papiertuch, das zusätzliche Medium auf der Seite und unten entfernen. 
	Hinweis: das Medium im Micropillar-Array (Oberseite) sollte nicht entfernt werden, da dies für das Ovulum Anbau verwendet werden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gerät auf eine 76 mm x 26 mm Folie Glas, Gewährleistung den Micropillar Teil als die Oberseite zu halten und decken Sie das Gerät mit 35 mm Kultur Schale Deckel um das Medium vor dem Austrocknen während der folgenden Ovulum Extraktion zu verhindern.</li>
</ol> 3. Schote Dissektion und Ovulum Extraktion <ol><li>sterilisieren eine Nadel (0,40 mm G) und feinen Pinzette durch Abwischen mit 70 % Ethanol. Die Nadel ist leicht durch Anhängen an eine Spritze oder Holz-Stick behandelt.</li>
	<li>Der Blütenstand der Pflanze zu überprüfen, und wählen Sie die richtige Siliques für das Experiment. Die ca. 5 mm Siliques enthalten Zygoten, und 8-10 mm Siliques junge Kugelsternhaufen Embryonen.</li>
	<li>Verbrauchsteuern des Siliques mit Hilfe einer Pinzette und legen Sie sie auf doppelseitigem Klebeband auf das Glas der Folie 76 x 26 mm. Eine Schote enthält etwa 40-60 Samenanlagen und 3-4 Siliques (d. h. 120-240 Eizellen) sind ausreichend für ein Gerät.</li>
	<li>Öffnen Sie die Schote (Eierstock Wand) um zu sehen, die Eizellen im Inneren mit den sterilisierten Nadel und Pinzette unter einem Stereomikroskop. Nur die Eierstock Wand geschnitten, so dass die Eizellen nicht beschädigt werden.</li>
	<li>Übertragen die geöffneten Schote in das N5T Medium auf dem PDMS-Gerät (in Schritt 2.7 vorbereitet), und lassen Sie Ovula in das Medium mit der Nadel oder Pinzette.</li>
	<li>Setzen ein kleines Cover-Glas (18 x 18 mm) auf das PDMS-Gerät, drücken Sie die Eizellen in die Räume im Micropillar-Array.</li>
	<li>Das Deckglas abzunehmen, ziehen sie horizontal mit Fingern oder Pinzette, um zusätzliche Mittel zu entfernen.</li>
	<li>Der PDMS-Gerät umdrehen, legen Sie sie in eine 35 mm Glasboden Schale und leicht drücken Sie das Gerät durch Drücken der quadratische Spitze Pinzette, um es auf das Glas kleben.</li>
	<li>Pour N5T Medium sanft in den Glasboden Schale durch die mittlere Flasche umfüllen, bis das PDMS-Gerät komplett in das Medium eingeweicht wird, und versiegeln Sie die Schale mit Paraffin Film. 
	Hinweis: Das PDMS-Gerät kann recycelt werden, aber Geräte, die zu alt sind werden einfach losgelöst von den Glasboden. Darüber hinaus kann das Gerät schweben wenn es nicht völlig im Schritt 2.5 entgast ist oder das Medium ist zu schnell gegossen.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Abbildung 2: Schematische Vorgehensweise zur Probenaufbereitung. 
Diese schematische Strömung entspricht Schritte 3,5 bis 4,1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
 4. Time-Lapse Imaging <ol><li>die Glasboden Gericht, das vorbereitet wurde in Schritt 3,9 auf einem inversen Mikroskop, und wählen Sie geeignete Eizellen zu konzentrieren auf. 
	Hinweis: Da die Eizellen im Stadium, Position und Richtung variieren, geeignete Eizellen gefunden werden sollte durch die Überprüfung ihrer Marker Fluoreszenz.</li>
	<li>Starten Sie den live-Imaging nach Angaben des Herstellers &#39; s Anweisungen des Mikroskops Systems. 
	Hinweis: Die Mikroskop-Ausrüstung und Parameter sind vielfältig, und so sollten die Benutzer wählen die richtigen Einstellungen, die dem Experiment Zweck passen. Als Beispiel, die Einstellungen in dieser Handschrift sind in Tabelle 1 aufgeführten.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>Ausstattung/Einstellung</td> <td>Abbildung 3 (A) und ergänzende Videos 1 und 4</td> <td> Abbildung 3 (B) und ergänzende Video 2</td> <td>zusätzliche Video-3</td></tr> <tr><td>Mikroskop</td> <td>Laserscanning - Mikroskop (A1R MP) invertiert</td> <td>rotierende Festplatten konfokale inversen Mikroskop (CSU-W1)</td> <td> kastenförmigen invertiert confocal Mikroskop-System mit einer stabilen Inkubation Kammer (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>Femtosekundenlaser Puls Exklusivrepräsentation</td> <td>488 nm und 561 nm LD Laser</td> <td>488 nm und 561 nm LD Laser</td></tr> <tr><td>O Bjective Objektiv</td> <td>40 X Objektiv eintauchen in Wasser (NA = 1,15) mit Immersion Medium</td> <td>60 X Silikon-Öl-Immersion-Objektiv (NA = 1,30), montiert auf einem Piezo Fokustrieb</td> <td>40 X Objektiv (NA = 0,95)</td></tr> <tr><td>erkennen oder</td> <td>externen nicht descanned GaAsP PMT Detektor</td> <td>EMCCD Kamera</td> <td>EMCCD Kamera</td></tr> <tr><td>dichroitischen spiegeln</td> <td>DM495 und DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>Filter</td> < td > Bandpass-Filter; 534/30 nm und 578/105 nm</td> <td>Bandpass-Filter; 520/35 nm und 593/46 nm</td> <td>Bandpass-Filter; 520/50 nm und 617/73 nm</td></tr> <tr><td>Scheibe Achse</td> <td>31 Z-Stapel mit Abständen von 1 µm</td> <td>inter 17 Z-Stapel mit 3 µm Vals</td> <td>7 Z-Stapel mit Intervallen von 5 µm</td></tr> <tr><td>Zeitintervall</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> Tabelle 1: die Mikroskopsysteme und Einstellungen in diesem Manuskript verwendet. 
Die Mikroskope und Parameter sind vielfältig, und so sollte jeder Benutzer wählen das passende System für das Experiment.
<ol start="3"> <li>die erworbenen Bildsequenz zu überprüfen, und wandelt es in die allgemeine Film-Format wie AVI oder MOV für Präsentation. 
	Hinweis: Wenn die Mikroskop-Software die Bilder als Filmformat ausgeben kann, ist es möglich, die Bilder als TIF speichern und öffnen Sie sie dann in ImageJ, ein open Source Programm inspiriert von NIH Image, um den Dateityp zu ändern. ImageJ versehen ist: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kann auch verwendet werden, um ein Z-s zu machenFilm, wie die maximale Intensität Projektion, verstauen, wie beschrieben: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Manuskript stellt eine einfachen in Vitro Ovulum Anbau-Protokoll, die effizient für den Einsatz in live Cell Imaging Zygoten und Embryonen zu entwickeln ist.
Das Design des Geräts PDMS ggf. Optimierung nach dem Embryonalstadium. Das erste entwickelte Gerät war ein Microcage Array die Ausrichtung anpassen und die Position der Eizellen9zu fixieren, und dann ein Micropillar Gerät wurde gebaut, um Eizellen effizienter trap8. Darü...

Der Grundkörper Plan eines Organismus entwickelt sich aus einem einzelligen Zygote. Bei den meisten Blütenpflanzen erzeugt zygotic Division eine apikale und eine basale Zelle, die zu dem Shooting und Wurzel, bzw.1zu entwickeln. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie der Pflanzenkörper in der Embryogenese gebildet wird, aber es wurde kein wirksames Instrument, um die Dynamik des lebendigen Zygoten und Embryonen direkt zu beobachten, weil sie tief in der Blüte entwickeln. Eine in-vitro- Befruchtung-Methode wurde in mehreren Monocot Arten, wie Mais und Reis etablierten2,3. Bei dieser Methode isolierten Spermien und Eizellen sind verschmolzen, elektrisch oder chemisch, und die generierten Zelle in eine fruchtbare Pflanze entwickeln kann. In Dicot Pflanzen ist jedoch keine in-vitro- Befruchtung Methode, die richtige Embryonen, vermutlich aufgrund der nicht synchronisierten Zellzyklus von männlichen und weiblichen Gameten4,5produzieren kann. Darüber hinaus spielt das Embryo umgebenden Gewebe (Endosperm) eine wichtige Rolle im Embryo Entwicklung6.
In einem Modell Dicot Arten, A. Thaliana, wurde eine in-vitro- Kultivierung Methode entwickelt, durch die Konzentration auf das ganze Ovulum, das den Embryo und Endosperm7enthält. Dieses System wurde erfolgreich verwendet, um die Auswirkungen der verschiedenen chemischen Reagenzien auf Embryogenese analysieren, aber es ist nicht geeignet für Zeitraffer-imaging, weil es eine geringe Überlebensrate hat. Daher wurde eine neuartige in-vitro- Ovulum Anbausystem entwickelt, um so früh wie die Zygote Bühne und fruchtbaren Pflanzen in einem hohen Verhältnis8zu produzieren. Nach verschiedenen Studien wurde festgestellt, dass Nitsch-Medium und Trehalose erheblich verbessert die Überlebensrate der Eizellen8. Da das Ovulum erweitert wird, wie es wächst und so häufig bewegt sich weg vom Feld der Beobachtung des Mikroskops, wurde darüber hinaus ein PDMS Gerät entwickelt, um das Ovulum im mittleren9zu beheben. Das PDMS-Gerät aktiviert die langfristige Imaging für 3-4 Tage, die ausreicht, um die Entwicklung von einer Zygote zu einem Herz-Bühne Embryo zu verfolgen. Mit dieser Methode wird es möglich, die Dynamik der Zygote Polarisation und Embryo-Strukturierung, nicht nur unter normalen Bedingungen, aber auch in Anwesenheit von chemische Inhibitoren oder in verschiedenen mutierten Hintergründe8,10 visualisieren ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung der spezifischen fluoreszierenden Marker verwendet, um zu visualisieren Zygoten und Embryonen durch das Ovulum. Die Arabidopsis Zygote entwickelt sich ein Embryo in das Ovulum, die tief im Inneren der Blume erzeugt wird. In dieser in-Vitro -Anbausystem der Zygote und Embryo durch das Ovulum eingehalten werden, und so ist es wichtig, bestimmte fluoreszierende Marker zu verwenden, die nicht in anderen Ovulum Geweben ausgedrückt werden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Nitsch basal salt mixture</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>trehalose dihydrate</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg&amp;rsquo;s vitamin solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35-mm glass-bottom dish</td><td>Matsunami Glass</td><td>D111300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &amp;times; 26 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &amp;times; 18 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>needle (gauge 0.40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Immersion medium Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Electric</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

In den meisten Blütenpflanzen die Zygote und Embryo sind tief in das Gewebe der Mutter versteckt, und so es ist seit langem ein Rätsel wie sie dynamisch entwickeln; z. B. polarisiert wie die Zygote um Körperachse und wie der Embryo gibt verschiedene Zelle Schicksale während Orgel Bildung zu schaffen. Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Kultur-Methode ausführen live Cell Imaging Zygoten und Embryonen von Arabidopsis Thalianazu entwickeln. Das optimierte Anbau Medium ermöglicht Zygoten oder frühen Embryonen bis zu fruchtbaren Pflanzen heranwachsen. Durch die Kombination mit einem poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Micropillar Array Gerät, wird das Ovulum in das flüssige Medium in der gleichen Position gehalten. Diese Fixierung ist entscheidend für die gleichen Eizelle unter dem Mikroskop für mehrere Tage aus der zygotic Division Spätstadium Embryo zu beobachten. Das resultierende live-Cell Imaging kann verwendet werden, um die Echtzeit-Dynamik der Zygote Polarisation, wie nukleare Migration und Cytoskelett Neuordnung, und auch das Timing der Zellteilung und Zelle Schicksal Spezifikation beim Embryo Musterung zu überwachen. Darüber hinaus sind diese Ovulum Anbausystem mit Inhibitor Behandlungen, die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf die Entwicklung des Embryos zu analysieren und mit optischen Manipulationen wie z. B. Laser-Unterbrechung, die Rolle der Zell-Zell-Kommunikation zu untersuchen kombinierbar.

Durch die Verwendung dieser Ovulum Anbausystem, kann diese Methode die lebendige Dynamik der Zygote Polarisation und Embryo Musterung zurückverfolgen. Dies ist eine Leistung, denn bisher gab es keine Technik zu visualisieren das Echtzeitverhalten der Zygote und Embryo, die tief in das Gewebe der Mutter versteckt sind. Abbildung 3A und ergänzenden Video 1 zeigen, dass die Mikrotubuli (MTs) in die junge Zygote als transversale Ring in der sub...

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Anbaumethode, die live Cell Imaging von Arabidopsis Zygoten und Embryonen ermöglicht. Diese Methode wird genutzt, um die intrazellulären Dynamik während der Zygote Polarisation und die Zelle Schicksal Spezifikation bei der Entwicklung von Embryonen zu visualisieren.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

in-vitro-ovule-cultivation-for-live-cell-imaging-zygote-polarization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

10.8K Aufrufe.  Nagoya University. Dieses Manuskript beschreibt eine in-vitro- Ovulum Anbaumethode, die live Cell Imaging von Arabidopsis Zygoten und Embryonen ermöglicht. Diese Methode wird genutzt, um die intrazellulären Dynamik während der Zygote Polarisation und die Zelle Schicksal Spezifikation bei der Entwicklung von Embryonen zu visualisieren.

Serie: In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) and the moment of the radiation of Angiosperms. This led to the hypothesis that alterations in GMF polarity may play a role in plant evolution. Here, we describe a method to test this hypothesis by exposing Arabidopsis thaliana to artificially reversed GMF conditions. We used a three-axis magnetometer and the collected data were used to calculate the magnitude of the GMF. Three DC power supplies were connected to three Helmholtz coil pairs and were controlled by a computer to alter the GMF conditions. Plants grown in Petri plates were exposed to both normal and reversed GMF conditions. Sham exposure experiments were also performed. Exposed plants were photographed during the experiment and images were analyzed to calculate root length and leaf areas. Arabidopsis total RNA was extracted and Quantitative Real Time-PCR (qPCR) analyses were performed on gene expression of CRUCIFERIN 3 (CRU3), copper transport protein1 (COTP1), Redox Responsive Transcription Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), a cytosolic Ascorbate Peroxidase1 (APX1), and NADPH/respiratory burst oxidase protein D (RbohD). Four different reference genes were analysed to normalize the results of the qPCR. The best of the four genes was selected and the most stable gene for normalization was used. Our data show for the first time that reversing the GMF polarity using triaxial coils has significant effects on plant growth and gene expression. This supports the hypothesis that GMF reversal contributes to inducing changes in plant development that might justify a higher selective pressure, eventually leading to plant evolution.

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Entwicklung und Genexpression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses with an egg cell or a central cell. Thus, two independent fertilization events take place almost simultaneously. The fertilized egg cell and central cell develop into zygote and endosperm, respectively. Therefore, precise control of double fertilization is essential for the ensuing seed development. Double fertilization occurs in the female gametophyte (embryo sac), which is deeply hidden and covered with thick ovule and ovary tissues. This pistil tissue construction makes observation and analysis of double fertilization quite difficult and has created the present situation in which many questions regarding the mechanism of double fertilization remain unanswered. For the functional evaluation of a potential candidate for fertilization regulator, phenotypic analysis of fertilization is important. To judge the completion of fertilization in Arabidopsis thaliana, the shapes of fluorescence signals labeling sperm nuclei are used as indicators. A sperm cell that fails to fertilize is indicated by a condensed fluorescence signal outside of the female gametes, whereas a sperm cell that successfully fertilizes is indicated by a decondensed signal due to karyogamy with the female gametes&#8217; nucleus. The method described here provides a tool to determine successful or failed fertilization under in vivo conditions.

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

We demonstrate a method to determine successful or failed fertilization on the basis of sperm nuclear morphology in Arabidopsis double fertilization using an epifluorescence microscope.

Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biologie

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Live-Bildgebung der Arabidopsis-Pollensondenaufnahme und Doppelbefruchtung mit der Semi-In-vitro-Cum-Septum-Methode

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

Zusammenfassung

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Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Bewertung des Düngezustands durch Rückverfolgung der Sperma-Kernmorphologie in Arabidopsis Doppeldüngung

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in

Live-Bildgebung der Arabidopsis-Pollensondenaufnahme und Doppelbefruchtung mit der Semi-In-vitro-Cum-Septum-Methode