אנו להכיר במימון המועצה האירופית למחקר (האיחוד FP7/260916), את אלכסנדר פון הומבולדט-Stiftung (Sofja Kovalevskaja), פתוח (DE1951 ו- SFB889).

כל הניסויים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות עבור רווחת גרמני.
הערה: ציר הזמן ואת השלבים העיקריים של הפרוטוקול מומחשים באיור1.
1. תכשירים
<ol><li>
הכינו את הפתרונות הבאים.
	<ol>
<li>להכין DMEM + culturing האסטרוציטים MD polygonal: DMEM עם 10% FCS, פניצילין U 100 100 סטרפטומיצין µg/mL.</li>
		<li>להתכונן NB + H culturing האסטרוציטים stellate: neurobasal בינוני עם 5 ננוגרם למ"ל HBEGF, 1 x B-27 תוספת, תוספת גלוטמין x 1, 100 פניצילין U ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL. הערה: Aliquots של ריכוז גבוה של HBEGF יכול להיות מוכן ומאוחסנים ב-20 ° C להתווסף המדיום בכל פעם שיש צורך.</li>
		<li>להכין את המדיום לנתיחה (10 מ מ HEPES ב HBSS).</li>
		<li>להכין את aliquots של 6-7 מ של 0.05% טריפסין-EDTA, 6-7 מ ל 0.25% טריפסין-EDTA צינורות 15 מ"ל. אלה יכול להיות מאוחסן ב-20 ° C, הקרת באמבט מים 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יום לפני תחילת הפרוטוקול, מעיל 10 ס מ שטופלו תרביות רקמה מנות עם 5 מ של 0.04% polyethylenimine (פיי) כל אחד.</li>
	<li>למחרת, הסר את פיי, לשטוף את הכלים במים מזוקקים, יונים פעמיים. להוסיף 12 מ של DMEM + כל צלחת, מראש equilibrate בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך לפחות 30 דקות לפני ציפוי תאים.</li>
	<li>הכנת האזור לנתיחה: תא לנתיחה למינארי, צלחות פטרי 10 ס מ למקום השני מלא בינונית לנתיחה על קרח. עבור כל אזור המוח להיות מבודדים (למשל, קליפת המוח, ההיפוקמפוס), להכין 15-צינור מלא עם 14 מ"ל לנתיחה בינוני ולשמור על קרח. תרסיס כלי חיתוך (מספריים בסדר, דומונט #3 #5 מלקחיים) עם 70% אתנול וביו -מקומה לנתיחה מיקרוסקופ בשכונה.</li>
</ol>2. חולדה או עכבר ניתוח מוחי
הערה: שני עכברים חולדות ויכול לשמש. חיות יותר P8 עשוי לשמש גם מבוגרת (בדקנו עד P12), אבל הסרת קרומי המוח יהפוך יותר ויותר קשה. עוד יותר, התשואה תא ובריאות יתמעט, מאז תאי מוח מחיות מבוגר יצרו תהליכים מסובכים וחיבורים עלול לשבור במהלך דיסוציאציה רקמות, המוביל אל מות תאים מוגברת. ההכנות קורטיקלית מתוארים כאן, אך ניתן להשתמש גם באזורים אחרים במוח.
<ol><li>הצב 0.05% טריפסין-EDTA באמבט מים 37 º C.</li>
	<li>המתת חסד חיות (בהריון חולדות E19 הגורים, או חיות P0-P8) מאת לאט להעלות את ריכוז2 CO, לבודד את השכל. הפעולות הבאות דורשות סטרילי טכניקה.</li>
	<li>
אם עובדים עם מתחלקים, הסר תחילה את העוברים מן הרחם, פתח שקי עובריים ולאחר מכן מיד כרת את ראשם עם מספריים. כאשר כל ראשי נחתכים, להעביר אותם לתוך לנתיחה טרום מקורר בינוני.
	<ol>
<li>לאחר ראשי טובע בתוך המדיום, לפתוח את העור ואת הגולגולת (שתיהן רך מאוד בבעלי חיים צעירים) עם מלקחיים, גונבת את המוח הקטן. בזהירות ידית שאר המוח יוצא את הגולגולת. הערה: שניים עד ארבעה E19 עוברי תשואה מספיק רקמה עבור מנות 10 ס מ לפחות שמונה האסטרוציטים קורטיקלית מצופה ב תאים 500,000 לכל מאכל ביום של ניתוח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור הגורים היילוד ומעלה, כרת את ראשם עם מספריים, לבודד את המוח על ידי medially חיתוך העור בקו ישר מן הצד האחורי של הראש עד הקצה של האף. משוך את העור בצד ובזהירות תחתוך את הגולגולת שמאלה ימינה ואז להרים עצם הגולגולת. לחתוך את המוח הקטן, מנוף שאר המוח יוצא את הגולגולת. הערה: שלושה P0-P8 הגורים תשואה מספיק רקמה עבור מנות 10 ס מ לפחות שמונה האסטרוציטים קורטיקלית מצופה ב תאים 500,000 לכל מאכל ביום של ניתוח.</li>
	<li>להפריד בין קליפת המוח לבין במבנה המוח האמצעי המשמש כבסיס. מקום המלקחיים בתוך פיסורה האורך בין ההמיספרות, ולאחר מכן להעביר המלקחיים בין המבנים ואת קליפת המוח האמצעי של והזיז חצי אחד (בניצב פיסורה האורך) לצבוט את האונה כל חינם.</li>
	<li>עם המלקחיים, להסיר כל קרומי המוח של האונה כל (וגם ההיפוקמפוס שלה), ואז להפריד את hippocampi. אם נדרשים האסטרוציטים בהיפוקמפוס, להעביר כל ההיפוקמפוס לתוך צינור 15 מ"ל מלא עם 14 מ"ל בינוני לנתיחה על קרח.</li>
	<li>הסר עוד אזורים קליפת של האונה כל אם אזורים ספציפיים הדרושים (למשל, החזיתית). חותכים כל רקמות קורטיקלית כדי לשמש ליצירת האסטרוציטים לחתיכות יותר מ- 1 מ מ3. לאסוף את כל החלקים של רקמות קורטיקלית בשפופרת 15-mL נפרדים מלא בינוני לנתיחה על קרח.</li>
</ol>3. רקמות לעיכול, דיסוציאציה
<ol><li>לאחר כל החלקים רקמות נאספים, לחכות להם להתיישב לתחתית הצינור ולאחר מכן תשאף בינוני רב ככל האפשר.</li>
	<li>להוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין 0.05%-באמצעות פיפטה סרולוגית של EDTA, דגירה הצינורות בתוך אמבט מים 37 º C למשך 20 דקות. הערה: שחרור כל טריפסין-EDTA מ פיפטה במהירות כדי לערבב את חתיכות רקמה אפשר להתיישב שוב.</li>
	<li>בזהירות וארוקן את טריפסין-EDTA, להשאיר חתיכות רקמה כמו נוזל מעט ככל האפשר, בחלק התחתון של הצינור.</li>
	<li>הוסף 5 מ של דיסקציה טרום מקורר בינוני כדי לשטוף את הנותרים של טריפסין-EDTA. פיפטה לצד של החלק העליון של הצינור כדי להשיג ערבוב של החלקים רקמות.</li>
	<li>תשאף המדיום לנתיחה, ולהשאיר את השברים רקמות כמו נוזל מעט ככל האפשר. חזור על שלב זה כביסה לנתיחה טרום מקורר בינונית עוד פעמיים.</li>
	<li>לאחר השלב הסופי כביסה, להוסיף 1 מ"ל של DMEM + (להתחמם לטמפרטורת החדר) שימוש 1,000 µL פיפטה עצה, triturate הרקמה על ידי pipetting למעלה ולמטה בלי היכרות עם בועות. הערה: חשוב להימנע לייצור בועות, כמו זה עשוי לשנות את ה-pH של התמיסה, שאליו האסטרוציטים רגישים למדי.</li>
	<li>מניחים מסננת תא 100 מיקרומטר בפתיחה של שפופרת 50-mL, טרום רטוב את המסנן עם 4.5 מ של טרום מקורר DMEM +.</li>
	<li>Pipette 1 מ"ל של רקמות הפומבית השעיה על גבי מסננת התא ולהוסיף עוד 4.5 מ ל טרום מקורר DMEM + לשטוף את התאים דרך מסננת התא.</li>
</ol>4. תאי ציפוי אסטרוציט העשרה על-ידי Passaging
<ol><li>לספור את התאים, למשל, על ידי דילול µL 10 של התליה תא עם 10 µL trypan blue pipetting את התערובת על גבי hemocytometer.</li>
	<li>צלחת 500,000 תאים ב- mL 12 DMEM + לכל מנה ס מ-10. הערה: DMEM + הוא מועיל לצמיחה astrocytic, יותר כך נוירונים או מיקרוגלייה. במהלך רועדת, כוחות פיזיים על coverslips זכוכית דקה בתוך בארות הם הרבה יותר חזקים מאשר אלה על המנות 10-ס מ (ללא coverslips). אם תאים שיש לחיצות על לוחות 24-. ובכן, הם הופכים לא בריא או למות. רק צלחת האסטרוציטים על לוחות 24-ובכן לאחר רועדת.</li>
	<li>לשמור תרביות תאים בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך שבעה ימים.</li>
	<li>יום 6, יום לפני רועדת, passaging תאים, להכין את הלוחות מצופים פיי התרבות כפי שמתואר בשלב 5.</li>
</ol>5. passaging תאים
<ol><li>
יום לפני passaging, מעיל תא צלחות תרבות עם 0.04% פיי.
	<ol>
<li>עבור immunocytochemistry, התמרה חושית ויראלי או פלסמיד תרביות תאים, השתמש 24-טוב או טוב 6 צלחות (המכילים כל אחד של 12 מ"מ מעוקר או coverslip זכוכית 25 מ מ, בהתאמה).</li>
		<li>לחטא את coverslips זכוכית דקה על ידי דגירה אתנול 70% לפחות שעה ולאחר מכן לשטוף את שלוש פעמים במים מזוקקים, יונים לפני הצבת coverslips את הבארות.</li>
		<li>הוסף לפחות 70 µL 0.04% פיי לכל 12-מ מ coverslip ב- 24-ובכן צלחות, פיי 0.04% µL 600 לכל 25 מ מ coverslip ב 6-ובכן צלחות.</li>
		<li>תספיג חלבון או RNA-Seq ניתוח, כלים 10 ס מ כבר המכילות את התאים לאחר הקרע יכול להמשיך להשתמש בו. מנות רק צריך להיות מזועזע, אז התאים עם 1 x PBS שטופים שטופלו NB + H (להעביר מנות חדשות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>על יום במבחנה (DIV) 7 לאחר הקרע, למקם את הכלים ס מ-10 עם תאים DMEM + על מטרף מעבדה בחממה וללחוץ על כל המנות של 110 סל ד במשך 6 שעות.</li>
	<li>לשטוף את פיי מ coverslips מצופה עם מים מזוקקים יונים פעמיים. להוסיף NB + H בינוני הלוחות (500 µL לכל טוב עבור לוחות 24-ובכן, 2 מ לכל טוב עבור לוחות 6-טוב). מראש equilibrate הלוחות בחממה 37 ° C ו- 5% CO2 בזמן המנות 10 ס מ רועדות, או למשך 30 דקות לפחות.</li>
	<li>20-30 דקות לפני תום 6-אייץ ' טלטול, לחמם 1 x PBS, DMEM +, NB + H ו- 0.25% טריפסין-EDTA עד 37 ° C באמבט מים.</li>
	<li>אחרי 6 שעות של טלטולים, תוריד את הכלים תרבות ניעור ולהחליף מיד המדיום (המכיל ניערו את הנוירונים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה) עם 10 מ"ל מראש חימם PBS x 1 לכל תבשיל. הערה: חשוב לרוקן מיד המדיום הישן המכיל תאים מנותקת כדי למנוע את התאים הלא-astrocytic חיבור מחדש.</li>
	<li>להסיר את PBS ולהוסיף מראש ומחוממת 3 מ"ל טריפסין-EDTA לכל תבשיל. דגירה כל מנה במשך 4 דקות בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2. הערה: אם מכינים דגימות תספיג או RNA-Seq, אינם מוסיפים טריפסין-EDTA. במקום זאת, החלף PBS ב 12 mL חימם מראש NB + H, לאחר מכן ניתן למקם תרבויות בחזרה בחממה.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל DMEM מראש ומחוממת + עד 3 מ"ל טריפסין EDTA בכל צלחת, pipette את התאים את המנה בעזרת פיפטה סרולוגית 5 מ ל, ולאסוף התליה תא בשפופרת 50 מ. הערה: פיפטה ישירות מהחלק התחתון של המנה - הרצפה של המנה צריך להיות ברור יותר כמו לנתק התאים. רק להשתמש בסרום המכילות בינוני (במקום DMEM +), סרום חלבונית טריפסין.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא ב g x 3,220 ב 20 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע וחיממתי resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל מראש NB + H.</li>
</ol>6. תאי ציפוי עבור תרבויות אסטרוציט הסופי
<ol><li>לספור את התאים.</li>
	<li>צלחת 20,000 תאים לכל טוב טוב 6 צלחות (ב מ ל 2 NB + H בינוני לכל טוב) או תאים 5,000 לכל טוב ב- 24-ובכן הצלחות (500 µL NB + H בינוני לכל טוב).</li>
	<li>לשמור על תרביות תאים בחממה ב- 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 עד להמשך הטיפול או הניתוח.</li>
	<li>להחליף חצי המדיום פעם בשבוע. הערה: בסביבות תזונתי נמוך, האסטרוציטים עוצרים מתרבים אבל כל מיקרוגלייה הנותרים ותתנהל (למרות מניסיוננו, אין מיקרוגלייה הופיע בתרבויות AWESAM). החלפת חצי המדיום פעם בשבוע מונע העשרה של כל מיקרוגלייה פוטנציאל הנותרים8, monocultures להישאר בריא לפחות שלושה שבועות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li><li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+calcium+oscillation+in+astrocytes+by+growth+factors+and+pro-inflammatory+cytokines+via+the+mitogen-activated+protein+kinase+cascade.">Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade.</a> J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).</li><li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+cells+in+astroglial+cultures:+a+cautionary+note.">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).</li><li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage.">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55 (2), 165-177 (2007).</li><li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ארבעה שלבים בתוך הפרוטוקול הן קריטיות: 1) הכנת ריכוז HBEGF כדי בדיוק 5 ng/mL, מאז עליות קטנות הריכוז יכול להוביל תרבויות לא בוגר, למשל10 ננוגרם למ"ל HBEGF de-להבדיל האסטרוציטים4; 2) בועות הימנעות בפתרונות מכילים רקמה או תאים, אשר ניתן לשנות את ה-pH, לעכב אסטרוציט בריאות; 3) מראש equilibrating מד?...

האסטרוציטים להשפיע על תפקוד המוח באמצעות תמיכה עם מחלות, זרימת הדם, איתות סינפטית, פלסטיות ותקשורת המערכת - כל אלה הם מנגנונים מרכז סביב התהליכים astrocytic דק. פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן מאפשר חקר תהליכים אלו ללא הפרעה בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד, אשר הוא שימושי למשל, כי הביטוי של חלבונים רבים ו- Ca2 + איתות אפילו חופפים מעבר לתא מוח סוגי. עוד יותר, שיטה זו גוברת על המגבלות של טכניקות זמינים בעבר. בפרט, פרוטוקול שלנו מספק ויוו-כמו מורפולוגיה (stellate האסטרוציטים עם תהליכים דק), ביטוי גנים, מהיר, קל, ואופן זול.
מורפולוגיה תאים, ביטוי גנים רבים תהליכים רגולטוריים אחרים מושפעים ישירות הסביבה. בקערה תרבות, זה מתייחס לגורמים שפורסמו על ידי התאים שמסביב, אלא גם המדיום שבו התאים גדלים. עבור האסטרוציטים, HBEGF דווחה בעבר לזירוז stellate מורפולוגיה1 אבל נמצאה גם מבטל את להבדיל האסטרוציטים2. עם זאת, ריכוז נמוך יותר של HBEGF שימשו מאוחר יותר ליצירת עוד ויוו-כמו האסטרוציטים כפי שזוהו באמצעות רצפי RNA שני פרוטוקולים שונים3,4. יתר על כן, מורפולוגיה אסטרוציט משתנה להרכב בינוני, ללא קשר פרוטוקול4: Neurobasal בינוני עם ריכוז נמוך של HBEGF הוא אופטימלי לגידול האסטרוציטים stellate, בעוד אחרים יצירות בינונית (למשל, סרום-המכיל DMEM) מייצר תאים מצולע (אפילו ב האסטרוציטים טרי מבודדת על ידי immunopanning).
פרוטוקול AWESAM גוברת על החסרונות של טכניקות הקודם לגידול אסטרוציט monocultures4. שיטות קודמות לגידול אסטרוציט monocultures יש חסרונות הבאים: מורפולוגיה מצולע, וזה דיי האסטרוציטים stellate ויוו (שיטת MD)5; האורך ואת העלות של פרוטוקול (הכנת האסטרוציטים מ pluripotent המושרה בתאי גזע לוקח שלושה חודשים ודורש נוגדנים רבים, לרבות גורמי גדילה יקר)6; כמויות נמוכות של חומר (שיטת immunopanning)3; את הבידול והתבקשתי של האסטרוציטים, הדרישה של מטריצה תלת-ממד (Puschmann et al.) 1 , 2. לעומת זאת, פרוטוקול AWESAM מספק: ויוו-כמו מורפולוגיה (האסטרוציטים stellate עם תהליכים דק); מהר, לאט, ושיטת זולים; כמויות גדולות של חומר; הכי אין ויוו-כמו ביטוי גנים לעומת immunopanned ו MD האסטרוציטים. בנוסף, תרבות דו-מימדית מאפשרת לצורך המחקר של איתות2 + Ca, מיחזור תהליכים דק, וכן אירועים קרוב הקרום שלפוחית (למשלמיקרוסקופ TIRF בלתי אפשרי בתרבויות תלת-ממד).
השיטה MD שימש בהרחבה מאז פרסומו ב- 19805, מציעה טכניקה פשוטה ומהירה עבור monocultures אסטרוציט מצולע. בקיצור, השיטה MD כרוך תאי המוח מעורבות גוברת בנסיוב עגל עוברית (FCS)-המכיל DMEM, ואחריו רועד צעדים להעשיר עבור האסטרוציטים (כמו כל שאר סוגי לנתק מתוך קערה לתא מוח), תרבות נוספת במדיום אותו. DMEM בתוספת FCS משמש עבור שאר סוגי תאים רבים, החל fibroblasts adipocytes שורות תאים סרטן שונים, צמודות המבנה מצולעים הוצגו על ידי MD האסטרוציטים בתרבות. עד בתחילת שנות האלפיים7, היה קצת מחשבה בהתחשב מדיה המותאמים האסטרוציטים, במיוחד את האמונים שלהם מורפולוגיה stellate טיפוסי נמצאו vivo בתוך. פרוטוקול אחד שפורסם בשנת 2011 להשיג כזה מורפולוגיה stellate: קראו את שיטת immunopanning, היא מעסיקה בינונית ללא סרום אופטימיזציה עבור culturing האסטרוציטים3. באמצעות שיטה זו, תאי מוח טרי מבודד חשופים סדרה של מנות מצופה נוגדנים יעד ייחודיים לסוג התא חלבונים פני שטח התא, להעשיר עבור האסטרוציטים. למרות ה יותר ויוו-כמו פרופיל ביטוי ומורפולוגיה של immunopanned האסטרוציטים, הרוב המכריע של מחקרים במבחנה עדיין מסתמכים על השיטה אסטרוציט MD. השיטה MD היא פשוטה ומהירה, בעוד השיטה immunopanning כוללת יותר מורכב ולגזול צעדים ביום הראשון של תרבות (כגון אנזים עיכול תקופות ארוכות יותר, זהיר שכבות של פתרונות של צפיפות שונה, immunopanning עצמה, ו מספר צנטריפוגה שלבים - הכל לפני ציפוי). עם זאת, באמצעות מדיום יותר מיוחדים, שיטת AWESAM מציע שני את המהירות של השיטה MD ו ה ויוו-כמו מורפולוגיה של הפרוטוקול immunopanning.
בסך הכל, פרוטוקול AWESAM שימושית ללמוד יותר ויוו-כמו האסטרוציטים ב- 2D monocultures מבודדת בין נוירונים אחרים עכשיו, דונלד (כפי שנעשה בעבר4 על ידי immunostainings, immunoblots, רצפי RNA). זה מאפשר לחקר תהליכים astrocytic דק, וכן מספקת נגישות מעולה להמחשת ספונטנית של Ca2 + איתות ואירועים בקרבת הקרום (למשל, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ TIRF).

<table><tbody><tr><td>0.05% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X stock</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X stock</td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>without L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m nylon cell strainer</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory shaker</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&amp;nbsp;</td><td>use inside cell culture incubator</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

AWESAM ( הלאוw-עלות easy stellate strocyte מ'ethod) פרוטוקול כרוך דרך מהירה, פשוטה וזולה להפקת כמויות גדולות של in vivo-כמו עכבר, חולדה monocultures אסטרוציט : תאי המוח ניתן לבודד אזורים שונים במוח, אחרי שבוע של תרבית תאים, התאים הלא-astrocytic הם ניערתי מעליי על-ידי הצבת הכלים תרבות על מטרף עבור 6-אייץ ' בחממה. האסטרוציטים הנותרים הם passaged ואז לוחות חדשים בינונית אסטרוציט ספציפיים (הנקרא NB + H). NB + H מכיל ריכוזים נמוכים של הפארין מחייב EGF פקטורי גדילה דמויי (HBEGF), אשר משמש במקום סרום בינוני. לאחר גידול ב- NB + H, AWESAM האסטרוציטים יש תכונה תהליכים בסדר ומורפולוגיה stellate. יתר על כן, האסטרוציטים אלה יש יותר ויוו-כמו ביטוי גנים מאשר האסטרוציטים שנוצר על ידי שיטות שפורסמו בעבר. Ca2 + הדמיה, שלפוחית dynamics ואירועים אחרים בקרבת הקרום שניתן ובכך יהיה לחקור את התהליכים astrocytic בסדר במבחנה, למשל, באמצעות וידאו בשידור חי התא או מיקרוסקופ TIRF. ראוי לציין, AWESAM האסטרוציטים גם התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות דומה האסטרוציטים ויוו.

האסטרוציטים תרבותי משותף עם נוירונים, גדל ב- NB + בינוני מופיעים stellate לאחר 2 שבועות של תרבות (איור 2). בנוסף NB + בינוני, האסטרוציטים תרבותי משותף נחשפים גם לא ידוע נגזר נוירון גורמים שתורמים סביר שלהם הישרדות, מורפולוגיה. לעומת זאת, MD האסטרוציטים גדלו ב DMEM + כמו ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol at JoVE.com

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

culturing-vivo-like-murine-astrocytes-using-fast-simple-inexpensive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.4K Views.  University of Oxford. פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.

Video: Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Live-imaging of Mitochondrial System in Cultured Astrocytes

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and function in astrocytes are implicated in cognition. This article describes the method for time-lapse imaging of astrocyte cultures equipped with a mitochondrial biosensor: MitoTimer. MitoTimer is a powerful and unique tool to assess mitochondrial dynamics, mobility, morphology, biogenesis, and redox state. Here, the different procedures for culture, image acquisitions, and subsequent mitochondrial analysis are presented.

This article describes the method for mitochondrial time-lapse imaging of astrocyte cultures equipped with MitoTimer biosensor and the resulting multiparametric analysis of mitochondrial dynamics, mobility, morphology, biogenesis, redox state, and turnover.

הדמיה חיה של מערכת מיטוכונדריאלית באסטרוציטים מתורבתים

While much attention has been given to mitochondrial alterations at the neuronal level, recent evidence demonstrates that mitochondrial dynamics and ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

תרביות ראשוניות של אסטרוציטים ומיקרוגליה של חולדות והשימוש בהן בחקר טרשת אמיוטרופית צידית

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

בידוד ותכנות מחדש ישיר של נוירונים של אסטרוציטים של עכברים

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Generating a Primary Culture of Astrocytes from a Rat Pup Brain

Source: Mili&#263;evi&#263;, K., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63483">Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J. Vis. Exp. (2022)
The video demonstrates a technique for culturing primary astrocytes from the rat cortex. The cortex is mechanically dissociated to obtain a homogeneous glial cell suspension, which is then plated on polypeptide-coated plates to promote selective proliferation of astrocytes. Subsequently, the astrocytes are enzymatically dissociated from the plates and transferred to fresh media, allowing the culture of pure astrocytes.

יצירת תרבית ראשונית של אסטרוציטים ממוחו של גור חולדה

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Primary cell culture preparation

...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

Source: Wolfes, A. C., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56092">Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

טכניקה פשוטה לבידוד ותרבית אסטרוציטים מורינים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Rat or Mouse Brain Dissection
...

Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes into Neurons

Source: Hersbach, B. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64175">Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (2022) 
This video showcases the direct reprogramming of astrocytes expressing transforming factors into neurons. Transformation factors trigger a cascade of molecular events facilitating astrocyte-to-neuron conversion. The process is further supported by supplying specific agents and supplements through a neuronal differentiation medium.

תכנות מחדש עצבי ישיר של אסטרוציטים עכבריים לתאי עצב

1. Seeding of astrocytes for reprogramming
NOTE: The following steps have to be performed under a biological safety cabinet with a safety level 1 (SL1).

	...

Advanced Neuronal Models

An In Vitro Method to Generate Astrocyte Scaffolds within Hydrogel Micro-columns

Source: Katiyar, K. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55848">Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates a method to generate three-dimensional astrocyte scaffolds within hydrogel micro-columns. The inside of the microcolumns are coated with collagen. Astrocytes are introduced, which adhere to collagen and, with further incubation, self-assemble into a three-dimensional scaffold.

שיטת In Vitro ליצירת פיגומים אסטרוציטים בתוך מיקרו-עמודות הידרוג'ל

1. Development of the Agarose Hydrogel Micro-columns

	Make an agarose 3% weight/volume (w/v) solution by weighing 3 g of agarose and transferring it to a ...