נתמך על ידי קרן Fazit בוגרת המלגה לס&quot;ס, המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר (BMBF 01 איו 0803) לק&quot;ג והנציבות האירופיים FP7 גרנט PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX, וקרן המחקר הגרמני גרנט SCHA 1442 / המחברים 3-1 לCS אין אינטרסים כלכליים סותרים.

1. בידוד וציפוי של תאים קליפתיים מעורבים בידוד תא קליפת מוח מעורב עבור תרבויות astrocyte יכול להתבצע באמצעות P1 עד P4 גורי עכברים. על מנת להשיג צפיפות astrocyte נכונה יש צורך להשתמש 4 קורטקס סיירי עכבר לבקבוק תרבית רקמת T75. לכן, כרכים בפרוטוקול הבא מחושבים להכנת תאים באמצעות 4 גורי עכברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתתחיל בהליך הנתיחה, 30 מ&quot;ל של prewarm תקשורת תרבות astrocyte (DMEM, רמת סוכר גבוה + 10% חום מומת עוברי סרום שור + 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ראה טבלה) עד 37 ° C. 1 T75 בקבוק מעייל עם 20 מ&quot;ל של פולי-D-ליזין (PDL) בריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר מים בכיתת תרבית תאים ל1 שעות ב 37 ° C בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להליך הנתיחה, להכין את כל החומרים כימיים וחומרים דרושים. יהיה עליך: מספרי כירורגיות, מלקחיים עדינים חלקים, מלקחי קצוות שטוחים, מגבות נייר, שקית אשפה, 70% אתנולד 2 מנות מבתרות (3.5 סנטימטרי קוטר) על קרח מלא עם 2 HBSS מ&quot;ל כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות ולרסס את הראש והצוואר של עכבר הגור עם אתנול 70%. החיה מוקרבת על ידי עריפת הראש באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתך קו אמצע, אחורי לקדמי, יחד הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הגולגולת בזהירות מהצוואר אל האף. שני חתכים נוספים מבוצעים על מנת לאפשר גישה נוספת למוח: החתך הראשון הוא עשה קדמי של נורות חוש הריח, 1 הנח של המוח הקטן לנתק את הגולגולת מבסיס הגולגולת האחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחי הקצוות השטוחים, דשי גולגולתם בעדינות התהפכו לצד והמוח נלקח החוצה והניח למנה הראשונה מלאה עם ביתור HBSS. הנח את הצלחת חזרה על קרח ולהמשיך לקצור את כל 4 המוחין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר הליך הנתיחה מתבצע תחת מיקרוסקופ סטראוסקופי. ראשית, את נורות חוש הריח והמוח הקטן מוסרות באמצעות הקנסמלקחיים מבתרים (1B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאחזר את קליפת המוח, לתפוס את הקצה האחורי של המוח עם מלקחיים העדינים, לבצע חתך קו אמצע בין שני חצאים המוח, להוסיף סט שני של מלקחיים לחורשה שנוצרה ולקלף את המבנה דמוי צלחת של קליפה מ מוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח את קרומי המוח מחצי הקליפה על ידי משיכה עם מלקחיים העדינים (1D איור &#39;). צעד זה ימנע זיהום של תרבות astrocyte הסופית על ידי תאים ופיברובלסטים meningeal. העבר את ההמיספרות קליפה המוכנות למנה השנייה, מלאה HBSS ולהחזיר אותו על גבי קרח. המשך בהתאם עם כל 4 הקורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, חותך כל חצי קליפה לחתיכות קטנות באמצעות להבים חדים (כ 4-8 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים, חתיכות קליפה להעברת צינור אחד 50 מ&quot;ל פלקון ולהוסיף HBSS להיקף כולל של 22.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 מ&quot;ל של טריפסין 2.5%, לערבב ודגירההרקמה באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לערבב מדי פעם על ידי מטלטל כל 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 XG לחתיכות רקמת קליפת גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant ידי decantation. על מנת להימנע מאיבוד רקמת הגלולה שמכאנית עשויים לשמר אותו באמצעות pipet. לנתק את הרקמות לתוך השעית תא בודדה על ידי הוספת מדיום 10 מ&quot;ל astrocyte ציפוי והנמרץ pipetting באמצעות פיפטה פלסטיק 10 מ&quot;ל עד פיסות רקמה הן ניתקו לתוך תאים בודדים (20 עד 30 פעמים). התאם נפח 20 מ&quot;ל באמצעות מדיום הציפוי astrocyte. אתה יכול הוכחת הניתוק של רקמת קליפת המוח לתאים בודדים על ידי ספירה באמצעות hematocytometer. הכנה אחד 4 קורטקס סיירי עכבר אמורה להניב 10-15 x10 6 תאים בודדים ניתקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDL לשאוב מבקבוקון התרבות T75, צלחת השעיה ניתקה התא הבודדה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממת CO 2. </li></ol> 2. קבלת Enrתרבות astrocyte iched <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את 2 ימים הבינוניים לאחר ציפוי של תאים המעורבים של קליפת המוח וכל 3 ימים לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 עד 8 ​​ימים, כאשר האסטרוציטים המיקרוגליאה confluent כיסה לשבת נחשפו בשכבת astrocyte או שהם כבר מנותקים משכבת ​​astrocyte (איור 2), לנער את בקבוק T75 ב 180 סל&quot;ד למשך 30 דקות בהקפה ייקרה להסיר המיקרוגליאה. השלך המיקרוגליאה המכילה supernatant או אם תרצה לתרבות ולבחון מיקרוגליאה, לסובב אותו וצלחת לתרבות 28,29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל הבינוני טריה astrocyte תרבות ולהמשיך בניעור הבקבוק ב 240 סל&quot;ד עבור 6 שעות כדי להסיר תאים מבשרים oligodendrocyte (OPC). מאחר שחלק מOPCs לא להתנתק לגמרי משכבת ​​astrocyte, תמשיך ללחוץ נמרצות ביד במשך דקות 1 כדי למנוע זיהום OPC. בטל supernatant או לסובב אותו כלפי מטה וצלחת, אם אתה רוצה תרבות OPCs 29. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את conflue שנותרשכבת astrocyte nt פעמים עם PBS, לשאוב PBS, מוסיף 5 מ&quot;ל טריפסין-EDTA ולדגור בCO 2 החממה ב 37 ° C. בדקו ניתוק של האסטרוציטים כל 5 דקות ולאכוף ניתוק של האסטרוציטים על ידי להכות את הבקבוק על כף היד שלך (2-3 פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האסטרוציטים מנותקים מבקבוקון התרבות, מוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום התרבות astrocyte, תאי ספין ב 180 XG למשך 5 דקות, לשאוב supernatant ולהוסיף 40 מ&quot;ל בינוני טריה astrocyte ציפוי. בקבוקון תרבות אחת T75 רקמה אמור להניב כ 1x10 6 תאים לאחר פיצול התא הראשון. תאי פלייט בשתי T75 צלוחיות תרבות ולדגור על 37 ° C בחממת CO 2. שינוי הבינוני כל 2 עד 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12-14 ימים לאחר את האסטרוציטים המפוצלים 1 מצופים ב24-48 שעתי ריכוז התא המתאימות לפני ביצוע הניסוי. בקבוקון תרבות אחת T75 רקמה אמור להניב כ 1.5-2 6 תאי X10 לאחר פיצול התא השני. </li></ol>

<ol>
	<li>Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+for+astrocytes:+redefining+the+functional+architecture+of+the+brain.">New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain.</a> Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).</li><li>Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energy+metabolism:+focus+on+astrocyte-neuron+metabolic+cooperation.">Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabolic cooperation.</a> Cell Metab. 14, 724-738 (2011).</li><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience:+Glia+-+more+than+just+brain+glue.">Neuroscience: Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457, 675-677 (2009).</li><li>Ballas, N., Lioy, D. T., Grunseich, C., Mandel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell+autonomous+influence+of+MeCP2-deficient+glia+on+neuronal+dendritic+morphology.">Non-cell autonomous influence of MeCP2-deficient glia on neuronal dendritic morphology.</a> Nat. Neurosci. 12, 311-317 (2009).</li><li>Jacobs, S., Nathwani, M., Doering, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+astrocytes+induce+developmental+delays+in+dendrite+maturation+and+synaptic+protein+expression.">Fragile X astrocytes induce developmental delays in dendrite maturation and synaptic protein expression.</a> BMC Neurosci. 11, 132 (2010).</li><li>Kaneko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+clear+the+path+of+astrocytic+processes+for+their+rapid+migration+in+the+adult+brain.">New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain.</a> Neuron. 67, 213-223 (2010).</li><li>Min, R., Nevian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+signaling+controls+spike+timing-dependent+depression+at+neocortical+synapses.">Astrocyte signaling controls spike timing-dependent depression at neocortical synapses.</a> Nat. Neurosci. , (2012).</li><li>Eroglu, C., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+synaptic+connectivity+by+glia.">Regulation of synaptic connectivity by glia.</a> Nature. 468, 223-231 (2010).</li><li>Sasaki, T., Matsuki, N., Ikegaya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action-potential+modulation+during+axonal+conduction.">Action-potential modulation during axonal conduction.</a> Science. 331, 599-601 (2011).</li><li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+the+development+of+the+migration-promoting+vasculature+scaffold+in+the+postnatal+brain+via+VEGF+signaling.">Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via VEGF signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 .</li><li>Alvarez, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hedgehog+pathway+promotes+blood-brain+barrier+integrity+and+CNS+immune+quiescence.">The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence.</a> Science. 334, 1727-1731 (2011).</li><li>Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier.">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 41-53 (2006).</li><li>Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+junctions+of+brain+endothelium+in+vitro+are+enhanced+by+astroglia.">Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia.</a> J. Neurosci. 7, 3293-3299 (1987).</li><li>Gordon, G. R., Choi, H. B., Rungta, R. L., Ellis-Davies, G. C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+metabolism+dictates+the+polarity+of+astrocyte+control+over+arterioles.">Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles.</a> Nature. 456, 745-749 (2008).</li><li>Silver, J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+beyond+the+glial+scar.">Regeneration beyond the glial scar.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 146-156 (2004).</li><li>Schachtrup, C., Moan, N. L. e., Passino, M. A., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+stellate+cells+and+astrocytes:+Stars+of+scar+formation+and+tissue+repair.">Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair.</a> Cell Cycle. 10, 1764-1771 (2011).</li><li>Schachtrup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+triggers+astrocyte+scar+formation+by+promoting+the+availability+of+active+TGF-beta+after+vascular+damage.">Fibrinogen triggers astrocyte scar formation by promoting the availability of active TGF-beta after vascular damage.</a> J. Neurosci. 30, 5843-5854 (2010).</li><li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains.">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> J. Neurosci. 22, 183-192 (2002).</li><li>Ogata, K., Kosaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+quantitative+analysis+of+astrocytes+in+the+mouse+hippocampus.">Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus.</a> Neuroscience. 113, 221-233 (2002).</li><li>Dabir, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+glutamate+transport+in+a+mouse+model+of+tau+pathology+in+astrocytes.">Impaired glutamate transport in a mouse model of tau pathology in astrocytes.</a> J. Neuroscience. 26, 644-654 (2006).</li><li>Wisniewski, H. M., Wegiel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+relationships+between+astrocytes+and+classical+plaque+components.">Spatial relationships between astrocytes and classical plaque components.</a> Neurobiol. Aging. 12, 593-600 (1991).</li><li>Shin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mutant+huntingtin+in+glial+cells+contributes+to+neuronal+excitotoxicity.">Expression of mutant huntingtin in glial cells contributes to neuronal excitotoxicity.</a> J. Cell Biol. 171, 1001-1012 (2005).</li><li>Wakabayashi, K., Hayashi, S., Yoshimoto, M., Kudo, H., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NACP/alpha-synuclein-positive+filamentous+inclusions+in+astrocytes+and+oligodendrocytes+of+Parkinson's+disease+brains.">NACP/alpha-synuclein-positive filamentous inclusions in astrocytes and oligodendrocytes of Parkinson's disease brains.</a> Acta Neuropathol. 99, 14-20 (2000).</li><li>Lioy, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+glia+in+the+progression+of+Rett's+syndrome.">A role for glia in the progression of Rett's syndrome.</a> Nature. 475, 497-500 (2011).</li><li>Quinlan, R. A., Brenner, M., Goldman, J. E., Messing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP+and+its+role+in+Alexander+disease.">GFAP and its role in Alexander disease.</a> Exp. Cell Res. 313, 2077-2087 (2007).</li><li>Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+damage+in+the+central+nervous+system:+a+multifaceted+role+for+vascular-derived+TGF-beta.">Vascular damage in the central nervous system: a multifaceted role for vascular-derived TGF-beta.</a> Cell Tissue Res. 347, 187-201 (2012).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li><li>Siao, C. J., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+plasminogen+activator+mediates+microglial+activation+via+its+finger+domain+through+annexin+II.">Tissue plasminogen activator mediates microglial activation via its finger domain through annexin II.</a> J. Neurosci. 22, 3352-3358 (2002).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+database+for+astrocytes,+neurons,+and+oligodendrocytes:+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function.">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J. Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li><li>Anthony, T. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+folate+metabolic+enzyme+ALDH1L1+is+restricted+to+the+midline+of+the+early+CNS,+suggesting+a+role+in+human+neural+tube+defects.">The folate metabolic enzyme ALDH1L1 is restricted to the midline of the early CNS, suggesting a role in human neural tube defects.</a> J. Comp. Neurol. 500, 368-383 (2007).</li><li>Skoff, R. P., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+astroblasts+and+oligodendroblasts+in+postnatal+rodent+brain:+evidence+for+separate+astrocyte+and+oligodendrocyte+lineages.">Division of astroblasts and oligodendroblasts in postnatal rodent brain: evidence for separate astrocyte and oligodendrocyte lineages.</a> Glia. 4, 165-174 (1991).</li><li>Molofsky, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+disease:+a+neurodevelopmental+perspective.">Astrocytes and disease: a neurodevelopmental perspective.</a> Genes Dev. 26, 891-907 (2012).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71, 799-811 (2011).</li><li>Jungblut, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+living+primary+astroglial+cells+using+the+new+GLAST-specific+monoclonal+antibody+ACSA-1.">Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1.</a> Glia. 60, 894-907 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה המתוארת כאן מבוססת על הכנת תרבות astrocyte ממוח של ילוד מכרסם, שתואר לראשונה על ידי מקארתי ודה Vellis בשנת 1980 27. השיטה השונה של הבידוד והתרבות של האסטרוציטים קליפת המוח מP1 לאחר הלידה למוח עכבר P4 מוצגת כאן הוא מהיר, תשואות האסטרוציטים ראשוניים וטהורים וניתן לשחזור ביותר. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מועברת לבודד את האסטרוציטים ממינים אחרים, כגון מחולדה או חזיר ומאזורים אחרים במוח, כמו חוט השדרה. בעוד בידוד astrocyte מוליד תא ממוח ילוד ידי מקארתי ושיטת deVellis מייצר תאי שגשוג מאוד, התפשטות התאים וההתפשטות של האסטרוציטים בודדים של גורים לאחר לידת P1-P4 עכבר הוא מוגבלת. לאחר פיצול האסטרוציטים פעם ב7 ימים במבחנה (DIV), הם יגדלו לconfluency ובוגר. בחי, התפשטות astrocyte ביותר היא במידה רבה על ידי שלמה P14 32. הואמחדש, אנו ממליצים להשתמש האסטרוציטים לניסויים ב21-28 DIV (האיור 2F) היום כדי להבטיח את הפנוטיפ הבוגר של האסטרוציטים מבודדים. בשל האיפוק הפנימי להתרבות תרבויות astrocyte לא צריך להיות splitted יותר מ 3 פעמים. צעדים קריטיים בשיטת הבידוד תארה הם את מערכת העיכול של קליפת מוח והטחינה הדקה הבאה של הרקמה מתעכלת לקבלת השעית התא הבודדה. לכן, יש צורך לייעל את ריכוז טריפסין וזמן עיכול על מנת לקבל השעית תא בודדה לאחר טחינה דקה של רקמת קליפת המוח במשך 20-30 פעמים. כדי למזער טריפסין וריאציה יש aliquoted ומחזורי הקפאת הפשרה יש להימנע. ההליך המתואר מסתמך על ציפוי תאי קליפת המוח המעורבים על צלוחיות תרבות PDL מצופות, אשר מבטיחים את הכריכה של האסטרוציטים ומקדם שכבת astrocyte confluent מספר ימים לאחר ציפוי. בעוד PDL הציפוי אינו הכרחי עבור מ astrocyteaintenance לאחר פרידתם מהמיקרוגליאה וoligodendrocytes, ייתכן שהוא בצע עבור יישומים במורד זרם מסוימים, כגון צביעת immunofluorescene. תזמון טוב של פיצול התא הראשון הוא חשוב לשלמות תא ואת התשואה. אם האסטרוציטים מתורבתים מעבר הגיעו confluency, אתה עלול לאבד את הרוב של תאים עקב ניתוק מספק במהלך פיצול התא הראשון. זה לא ניתן להתגבר על ידי הגדלת הזמן לניתוק, משום שזמן דגירה נרחבת עם טריפסין שלילי משפיע על שלמות תא. לעומת זאת, ציפוי השעית תא קליפת המוח גם בקושי יביא להיווצרות מספקת של שכבת תאי astrocyte confluent. הזמן הטוב ביותר לפיצול התא הראשון הוא בגיל 7 עד 8 ימים לאחר ציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים, כאשר האסטרוציטים confluent ותאי מיקרוגליה לשבת על העמדה העליונה ביותר של שכבת astrocyte. בתרבית התאים בקליפת המוח שתואר, האסטרוציטים להראות ההטרוגניות סלולרית (&lt;חזק&gt; איור 3), כפי שכבר תאר להאסטרוציטים in vivo 33,34. עם זאת, הגדרת מורפולוגיה astrocyte מגוונת ופונקציונלי כבר הקשה על ידי המספר המוגבל של סמנים כדי לזהות ולהבחין בין תת astrocyte פוטנציאלי הטרוגניות. סמן מאופיין היטב מסיבי בוגרים והאסטרוציטים תגובתי הוא GFAP. עם זאת, כמעט ואינו בא לידי ביטוי GFAP ידי האסטרוציטים protoplasmic בוגרים, המגביל את השימוש בו כסמן לכל האסטרוציטים וזה בא לידי הביטוי גם על ידי תאי RG במהלך פיתוח ועל ידי תאי B במבוגרים, המגביל את השימוש בו כסמן שלב ספציפי. סמנים אחרים של האסטרוציטים, כולל GLAST, ALDH1L1 או BLBP, באים לידי הביטוי גם על ידי האסטרוציטים לא בשלים, ולכן לא רק אל תסמנו האסטרוציטים בוגרים. לבסוף, סמני astrocyte בוגרים כמו GFAP, Aquaporin-4, וS100B (איור 3) הם יותר ויותר מוסדרים מעלה במהלך התבגרות לאחר לידה. בידות שלנו, ASTתרבויות rocyte בגיל 4 שבועות יש מאפיינים של האסטרוציטים בוגרים in vivo. שימוש בתרבויות astrocyte העיקריות שאנחנו יכולים לזהות את המנגנון המולקולרי כיצד פיברינוגן חלבון הדם נולד גורם הפעלת astrocyte 17. המחקרים שלנו הראו כי פיברינוגן הוא הנשאית של TGF-β הסמוי. טיפול של האסטרוציטים עיקריים עם פיברינוגן הוביל להיווצרות TGF-β הפעיל וההפעלה של מסלול איתות TGF-β/Smad בהאסטרוציטים 17,26. תוצאות אלה אושרו באמצעות זריקות פיברינוגן in vivo. יתר על כן, האסטרוציטים לשלוט סוגי תאים אחרים על ידי הפרשת חומרים, אשר יכול להיות מנותח על ידי איסוף בינוני astrocyte ממוזג והחלה בינונית מותנית זו לסוגי תאים אחרים. אנחנו השתמשנו בעבר בינוני astrocyte ממוזג לנתח בבדיקה פונקציונלית איך מזגן בינוני של האסטרוציטים פיברינוגן טופל משפיע תולדת neurite. האסטרוציטים תגובתי מפורש ומפרישיםחלבונים של המשפחה, שמעכבים CSPG תולדת neurite 16. ואכן בינוניים, מזגן מהאסטרוציטים פיברינוגן טופל ירידה משמעותית גם באורך neurite ואחוז התאים מראים תולדת neurite 17. הבידוד והתרבות של האסטרוציטים קליפת המוח שתוארו בפרוטוקול זה מספק כלי רב עצמה לחקר ביולוגית astrocyte, מאחר יכולת הניהול שלהם ביישומים שונים יכולה להשלים את חקירתם בגוף חי מאוד. עם זאת, יש לזכור כי האסטרוציטים שהושגו כבר בתרבית במבחנה ותוך שהן משקפות תכונות astrocyte רבות, הם גם שונים מהאסטרוציטים vivo. לכן, שיטות אחרות של בחירה ישירה ובידוד של האסטרוציטים ידי immunopanning בידוד 35 או נוגדן מבוסס FACS 36 מייצגות אפיקים חדשים נוסף כדי לחקור את התכונות הבסיסיות של האסטרוציטים.

האסטרוציטים הם סוג תא נפוץ מאוד במערכת העצבים המרכזית (CNS). היחס של האסטרוציטים לנוירונים הוא 1:03 בקליפת המוח של עכברים וחולדות, ואילו יש 1.4 האסטרוציטים לנוירון ב1 קליפת אדם. ריבית בתפקוד astrocyte גדלה באופן דרמטי בשנים האחרונות. תפקיד מרכזי של האסטרוציטים הוא תפקידם במתן תמיכה מבנית לנוירונים וטבולים 2,3. תפקידים חדשים שהתגלו להאסטרוציטים לכסות ספקטרום רחב של פונקציות. אלה כוללים מנחים ההגירה של האקסונים המתפתחים וneuroblasts המסוים במהלך הפיתוח 4-6, פונקציות בהעברה הסינפטית, כוח סינפסה ועיבוד מידע על ידי מעגלים עצביים 7-9, תפקידים במחסום דם מוח (BBB) ​​היווצרות 10 ויושרה 11-13 ורגולציה של 14 טון כלי הדם במוח. תכונה בולטת נוספת של האסטרוציטים היא תגובתם לפציעה. תחת תנאי astrocyt פתולוגיes להיות תגובתי ועוד upregulate הביטוי של חלבון ביניים נימת גליה fibrillary חומצי (GFAP) ומטריצת החלבונים תאיים מעכבים (ECM) 15,16. האסטרוציטים תגובתי לתחום את הפגיעה באתר מהרקמה בריאה על ידי יצירת צלקת גלייה, המורכבת בעיקר מחלבונים מופרשים ECM astrocyte של סולפט כונדרואיטין משפחת גליקן (CSPG), הגורמים העיקריים המעכבים התחדשות axonal לאחר פציעת CNS 15-17. האסטרוציטים מקורן תאי גלייה רדיאלי (RG) במהלך התפתחות עוברת מאוחר וחיים לאחר לידה מוקדמים. לאחר מפרט astrocyte התרחש, מבשרי astrocyte להגר למצבם הסופי, שבו הם מתחילים בתהליך של בידול מסוף. בחי, האסטרוציטים להיראות בוגר שלושה עד ארבעה שבועות לאחר לידה כפי שצוינו על ידי המורפולוגיה האופיינית 18,19. תת אוכלוסיות של תאי RG להמיר לתוך האסטרוציטים אזור subventricular (סוג B תאים). Both, RG ותאים מסוג B לתפקד כתאי astrocyte דמוי גזע עצביים (NSCs) במהלך התפתחות ובמבוגרים, בהתאמה. כמו האסטרוציטים, RG ותאים מסוג B גם להביע טרנספורטר astrocyte הספציפי גלוטמט (GLAST), חלבון מוח שומנים מחייבים (BLBP), וGFAP, המציין כי סמנים אלה לא ניתן להשתמש באופן בלעדי במיוחד כדי לתייג את האסטרוציטים בוגרים. בניגוד להאסטרוציטים parenchymal מבוגרים, שאינם מחלקים במוח, RG הבריא ופוטנציאל הסוג B תאי תערוכת תאי גזע כגון יכולת עצמית לחדש. Dysregulation של האסטרוציטים היה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל מחלת אלצהיימר 20,21, מחלת הנטינגטון 22, מחלת פרקינסון 23, 24 רט התסמונת ומחלתו של אלכסנדר 25. יתר על כן, האסטרוציטים להגיב לכל העלבונות של מערכת העצבים המרכזיים, מה שמוביל להפעלת astrocyte והיווצרות צלקת גלייה astrocytic 16,26. צלקת גלייה astrocytic שיוצרת מוח tr הבאפגיעה בחוט שדרה או auma נחשבת למכשול העיקרי המונע התחדשות תאי עצב 15. הפיתוח של שיטות אמינות לבודד ולשמור על אוכלוסיות מטוהרות של תאים היה חיוני להבנה של מערכת העצבים שלנו. עבודתו החלוצית של מקארתי ודה Vellis מאפשרת לחוקרים למועד להכין תרבויות כמעט טהורות של האסטרוציטים מרקמות חולדת יילודי 27. רב כבר למד על ביולוגית astrocyte שימוש בשיטה זו, המוצגת כאן בצורה שונה מעט לבידוד האסטרוציטים קליפת המוח של עכברים. משלימים במחקרי vivo, האסטרוציטים, כמו גם מדיום מותנה הושג באמצעות תואר בתרבות מבחנה, הם כלים חשובים נוספת להבנה הטובה של פונקציות astrocyte.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של פתרון עובד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> תקשורת התרבות astrocyte </td></tr><tr><td> DMEM, רמת סוכר גבוה </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 31966-021 </td><td></td></tr><tr><td> FBS, חום מומת </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 10082-147 </td><td> ריכוז סופי: 10% </td></tr><tr><td> פניצילין סטרפטומיצין </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 15140-122 </td><td> ריכוז סופי: 1% </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> פתרון לעקיצת רקמת המוחestion </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 14170-088 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5% טריפסין </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 15090-046 </td><td> ריכוז סופי: 0.25% </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> אחר </td></tr><tr><td> 70% אתנול (כרך / כרך) </td><td> רוט </td><td> 9065.2 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-D-ליזין </td><td> Millipore </td><td> -003-E </td><td> 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> מים </td><td> Paa </td><td> S15-012 </td><td> כיתת תרבית תאים </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Paa </td><td> H15-002 </td><td> כיתת תרבית תאים </td></tr><tr><td> 0.05% נסוpsin-EDTA </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45 סינון סטרילי מיקרומטר </td><td> סארטוריוס </td><td> 16555 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 צלחת פטרי סנטימטר </td><td> BD פלקון </td><td> 353001 </td><td></td></tr><tr><td> 15 מיליליטר צינור פלקון </td><td> BD פלקון </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל פלקון צינור </td><td> BD פלקון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 75 בקבוק התרבות 2 סנטימטר רקמות </td><td> BD פלקון </td><td> 353136 </td><td></td></tr><tr><td> מלקחיים, בסדר </td><td> דומון </td><td> 2-1032; 2-1033 </td><td> # 3 ג; # 5 </td></tr><tr><td> מלקחיים, קצה שטוח </td><td> KLS מרטין </td><td> 12-120-11 </td><td></td></tr><tr><td> 13 סנטימטר מספרי כירורגיות </td><td> Aesculap </td><td> BC-140-R </td><td></td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td> ליקה </td><td></td><td> MZ7.5 </td></tr><tr><td> סטראו + מצלמה </td><td> ליקה </td><td></td><td> MZ16F; DFC320 </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ + מצלמה </td><td> Zeiss; Canon </td><td></td><td> פרימו רט; A650 IS PowerShot </td></tr><tr><td> סרכזת </td><td> אפנדורף </td><td> 5805000.017 </td><td> Centrifuge5804R </td></tr><tr><td> Orbital אכר </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKE 4450-1CE </td><td> MaxQ 4450 </td></tr><tr><td> אמבט מים </td><td> Julabo </td><td></td><td> SW20; 37 מעלות צלזיוס </td></tr></tbody></table>

isolation and culture of mouse cortical astrocytes

האסטרוציטים הם סוג תא בשפע במוח של היונקים, עדיין נותרים הרבה מה ללמוד על המאפיינים המולקולריים ופונקציונליים שלהם. במערכות סלולריות תרבות astrocyte מבחנה יכול לשמש כדי ללמוד את הפונקציות הביולוגיות של תאי גליה אלה בפירוט. פרוטוקול וידאו זה מראה כיצד להשיג האסטרוציטים טהורים על ידי בידוד והתרבות של תאי קליפת מוח המעורבים של גורי עכברים. השיטה מבוססת על העדר נוירונים קיימא וההפרדה של האסטרוציטים, oligodendrocytes ומיקרוגלים, שלוש האוכלוסיות העיקריות גליה התאים של מערכת העצבים המרכזית, בתרבות. תמונות מייצגות בימים הראשונים של התרבות להדגים את נוכחותה של אוכלוסיית תאים מעורבת ומצביעות timepoint, כאשר האסטרוציטים הופכים confluent וצריך להיות מופרדים מהמיקרוגליאה וoligodendrocytes. יתר על כן, אנו מדגימים טוהר ומורפולוגיה astrocytic של האסטרוציטים תרבית באמצעות stainings immunocytochemical למבוסס היטב ותאר חדש סמני astrocyte. מערכת זו התרבות יכולה לשמש בקלות להשיג האסטרוציטים עכבר טהורים ובינוני astrocyte ממוזג ללימוד היבטים שונים של ביולוגית astrocyte.

על הבידוד של מוח העכבר השלם (איור 1 א), המוח הקטן ואת נורות חוש הריח יש להסיר (1B איור). הקורטקס הם קלפו של גזע מוח העכבר (התרשים 1C) וקרומים של קליפת הפרט (1D איור &#39;) הם הוציאו בזהירות (האיור 1E). קרום המוח הוא ברור על ידי מערכת עורק קרום המוח ותוצאות הסרה חלקיות בזיהום של תרבות astrocyte הסופית על ידי תאים ופיברובלסטים meningeal. לאחר הציפוי של השעית תא קליפת המוח המעורבת, כמה האסטרוציטים כבר לצרף לבקבוק התרבות בתוך 24 שעות (איור 2 א). עם זאת, את supernatant תרבות התא יכיל פסולת תא ונוירונים גוססים במשך 3 עד 5 הימים הראשונים (איור 2A-C), כמדיום התרבות מעדיף הישרדות וצמיחה של תאי גליה. ברגע האסטרוציטים confluent והמיקרוגליאה יושבת חשופה על astrocytשכבת דואר, בדרך כלל ביום 7 אחרי הבידוד של תאי קליפת מוח מעורבים, האסטרוציטים צריך להיות מופרדת מהמיקרוגליאה וOPCs ידי רועד (האיור 2D). 2 ימים לאחר התאים המפוצלים 1 מראים מורפולוגיה astrocyte. בצפיפות astrocyte שלב זה הוא נמוך והאסטרוציטים הם משופעים (2E איור, חצים שחורים מסמן תא אחד). התשואה הצפויה בשלב זה היא נמוכה בכ 04-06 מאי תאי X10 לבקבוק תרבית רקמת T75. עם זאת, התאים עדיין יתרבו ולהתבגר בתרבות בtimepoint זה. האסטרוציטים בדרך כלל משמשים לניסויים ביום 21 עד 28 (האיור 2F) כדי להבטיח פנוטיפ בוגר של האסטרוציטים מבודדים. בשלב זה התשואה הצפויה היא כ 1.5-2 6 תאי X10 לבקבוק תרבית רקמת T75. טוהר תרבות astrocyte התאפיין מחקרי אלקטרון מיקרוסקופיה מורפולוגיים, ביטוי סמן תא והיענות תרופתית 27. זיהוםתרבות strocyte ניתן לבחון באמצעות סמן להמיקרוגליאה (רשות שידור-1) וOPCs (O4). הטוהר הושג astrocyte התרבות ובגרות יש לבחון על ידי בדיקת immunocytochemical באמצעות נוגדן נגד חלבון GFAP. צפוי כי רוב התאים להראות אות אינטנסיבית, פילמנטיות (איור 3). שיטת הבידוד והתרבות שלנו של האסטרוציטים קליפת המוח הביאה לטוהר astrocyte של יותר מ 98%, חשפה באמצעות נוגדן נגד חלבון GFAP (איור 3). אם ההליך היה מוצלח, תאים מזהמים הם נדירים (&lt;2%) ומכילים המיקרוגליאה וOPCs, שאפשר לצבוע באמצעות רשות שידור-1 וO4, בהתאמה. אם תרצו ניתוח, נוסף של סמני astrocyte אחרים, כגון Aquaporin-4, BLBP, S100B וGLAST עשוי לשמש. בנוסף לGFAP, סמנים אלה באו לידי ביטוי בכל 28 ימי תרבויות astrocyte הישנות. הפרופיל של התבטאות הגנים האחרון של מטוהר אוכלוסיות astrocyte חשף AST פוטנציאל החדשסמני rocyte, כגון החומצה פולית אנזים המטבולי ALDH1L1 30,31, שבאו לידי ביטוי גם על ידי רוב של האסטרוציטים קליפת המוח המבודדים (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig1.jpg" /> איור 1. נתיחה של קליפה לאחר לידה (P3) עכבר.) כל מוח. B) מוח לאחר הסרת פקעות והמוח קטן ריח. ג) בידוד של קליפת מוח על ידי קילוף המבנה דמוי צלחת של הקליפה מהמוח. ד,) קורטקס &#39;ד מאתר גחון והגבה עם קרומי מוח (חיצים שחורים מצביעים על עורקי meningeal). E) Cortex ללא קרומי מוח. סרגל קנה מידה, 1.5 מ&quot;מ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig2.jpg" /> איור 2. סקירה מורפולוגי של תאים בודדים מעורבים בקליפת מוח ותרבות astrocyte הטהורה בנקודתי זמן שונים לאחר בידוד.א) ביום 1 לאחר ציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. האסטרוציטים ראשונים מצורפים לתחתית הבקבוק (חיצים שחורים) ונוירונים גוססים נמצאים בsupernatant. ב) 3 ימים לאחר הציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. שכבת astrocyte היא להרכיב (חיצים שחורים). הנוירונים הם כמעט נעדרים. ג) 5 ימים לאחר הציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. המיקרוגליאה ראשונה וOPCs על גבי שכבת astrocyte (חיצים שחורים). ד) 7 ימים לאחר הציפוי של תאי קליפת מוח מעורבים. שכבת astrocyte לחלוטין confluent. ה) לאחר הסרת המיקרוגליאה וOPCs ידי טלטול נמרץ ו2 ימים לאחר פיצול, תאים מצורפים מראים מורפולוגיה astrocyte עם צפיפות נמוכה (חצים מציינים תא אחד). F) שכבת astrocyte מראה צפיפות גבוהה 2 שבועות לאחר הפיצול הראשון. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50079/50079fig3.jpg" /> איור 3. טוהר תרבות astrocyte העיקרית. Immunolabeling של מבוי סתום astrocyte עכבר העיקריtures עם סמני GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 וBLBP (כולו הירוק) חשף תרבות astrocyte הראשונית טהורה. גרעיניהם מגואלות ב4 &#39;, 6&#39;-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes at JoVE.com

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

isolation-and-culture-of-mouse-cortical-astrocytes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

91.0K Views.  University of Freiburg. האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

Video: Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

לקטינים מבוססי בידוד תרבות Motoneurons עכבר עובריים

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar משותף התרבות של נוירונים בקליפת המוח עכברוש ראשי גליה

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Human Fungiform Taste Papillae Cells

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple stimuli and complex chemical molecules contained in foods. In human, individual fungiform papillae contain from zero to as many as 20 taste buds. There is no established protocol for culturing human taste cells, although the ability to maintain taste papillae cells in culture for multiple cell cycles would be of considerable utility for characterizing the molecular, regenerative, and functional properties of these unique sensory cells. Earlier studies of taste cells have been done using freshly isolated cells in primary culture, explant cultures from rodents, or semi-intact taste buds in tissue slices1,2,3,4. Although each of these preparations has advantages, the development of long-term cultures would have provided significant benefits, particularly for studies of taste cell proliferation and differentiation. Several groups, including ours, have been interested in the development and establishment of taste cell culture models. Most attempts to culture taste cells have reported limited viability, with cells typically not lasting beyond 3-5 d5,6,7,8. We recently reported on a successful method for the extended culture of rodent taste cells9. We here report for the first time the establishment of an in vitro culture system for isolated human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability. Cells displayed many molecular and physiological features characteristic of mature taste cells. Gustducin and phospholipase C &beta;2, (PLC-&beta;2) mRNA were detected in many cells by reverse transcriptase-polymerase chain reaction and confirmed by sequencing. Immunocytochemistry analysis demonstrated the presence of gustducin and PLC-&beta;2 expression in cultured taste cells. Cultured human fungiform cells also exhibited increases in intracellular calcium in response to appropriate concentrations of several taste stimuli indicating that taste receptors and at least some of the signalling pathways were present. These results sufficient indicate that taste cells from adult humans can be generated and maintained for at least eight passages. Many of the cells retain physiological and biochemical characteristics of acutely isolated cells from the adult taste epithelium to support their use as a model taste system. This system will enable further studies of the processes involved in proliferation, differentiation and function of mammalian taste receptor cells in an in vitro preparation.
Human fungiform taste papillae used for establishing human fungiform cell culture were donated for research following proper informed consent under research protocols that were reviewed and approved by the IRB committee. The protocol (#0934) was approved by Schulman Associates Institutional Review Board Inc., Cincinnati, OH. Written protocol below is based on published parameters reported by Ozdener et al. 201110.

We aimed to develop a reproducible protocol for isolating and maintaining long-term cultures of human fungiform taste papillae cells. Cells from human fungiform papillae obtained by biopsy were successfully maintained in culture for more than eight passages (12 months) without loss of viability.

בידוד והתרבות של האדם בחוש הטעם תאים Fungiform גבשושיות

Taste cells are highly specialized, with unique histological, molecular and physiological characteristics that permit detection of a wide range of simple ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

בידוד של נוזל השדרתי מעוברים מכרסמים לשימוש עם explants מוחות קליפתיים גזור

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; In-Vitro</em&gt; איסכמיה

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.