המחברים רוצה להודות Yuliya Naumchuk (אוניברסיטת לויולה שיקגו), כוכבה משעלי Žiniauskaitė (Experimentica בע מ) עבור תמיכה טכנית, videographic מצוינת. תכנית המחקר של ד ר Kaja נתמך על ידי ד ר ג'ון עמ' תרז אי Mulcahy ניחן כפרופסור במכון עיניים ב אוניברסיטת לויולה שיקגו.

כל החיות טופלו לפי המשפט ארוו עבור שימוש של חיות לרפואת עיניים, ומחקר החזון של EC Directive 86/609/EEC לניסויים בבעלי חיים, באמצעות פרוטוקולים אישרה, בפיקוח של חיות ניסוי לוח של פינלנד.
1. לייזר המושרה העכבר CNV דגם 5
<ol><li>לבדוק את העיניים של החיה בעין בלתי מזוינת על חריגות.</li>
	<li>שוקלים את העכבר.</li>
	<li>לחשב ולהכין כמות מספקת של חומרי הרדמה לשימוש, בהתבסס על המשקל של החיה, למשל תערובת של medetomidine (1 מ"ג/ק"ג), קטמין (75 מ"ג/ק"ג), מים מזוקקים (0.9% NaCl פתרון) ביחס של 1:1.5:2.5, או קטמין (40-75 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג), מים מזוקקים (0.9% NaCl פתרון) ביחס של 1:2. 5:1; עכבר 20 גרם, מזריקים 0.1 מ"ל של תערובת.</li>
	<li>להזריק הרדמה intraperitoneally.</li>
	<li>הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב. חכה עד חיה. הוא מורדם. לאשר שהעכבר הוא מורדם כראוי על ידי חוסר רפלקס פדלים.</li>
	<li>להבטיח את השימוש בלייזר בטיחות ציוד מגן אישי.</li>
	<li>הפעל מנורה שסע ואת 532 ננומטר דיודת לייזר.</li>
	<li>הסר את העכבר הכלוב ואת המקום על כרית חימום.</li>
	<li>החל טיפה אחת של Tropicamide עבור התרחבות האישון. המתן 3-5 דקות על התרחבות האישון מלא (3 מ"מ).</li>
	<li>הנח את העכבר על הבמה מנורת סדק.</li>
	<li>במקום טיפה אחת של ג'ל נוזלי עיניים על coverslip כדי applanate הקרנית.</li>
	<li>אוריינט את העין העכבר עם ראש עצב הראייה במרכז.</li>
	<li>להגדיר את עוצמת הלייזר עד 100 מגה-וואט, המשך ל-100 מילישניות, והגודל ספוט 50 מיקרומטר.</li>
	<li>מתמקדים קרן הלייזר אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE).</li>
	<li>עושים שלוש יריות לייזר לתוך עין אחת על ידי הימנעות כלי הדם ברשתית ממוקם באופן אידיאלי ב- 4, 8 ו 12 o ' שעון עמדות סביב עצב הראייה, בהתאמה. בדוק את הפונדוס של העין לאחר כל לייזר יריות להיעדרות מדימום ברשתית. העין contralateral משמש פקד ללא lasered.</li>
	<li>למחוק את העכבר coverslip ומקום חזרה על כרית החימום.</li>
	<li>החל טיפה אחת של פג ג'ל טיפות על שתי העיניים.</li>
</ol>2. SD-אוקטובר 6,7
<ol><li>למקם את העכבר הבמה יישור מכרסמים, לשתק את הראש.</li>
	<li>יישר את העדשה של מערכת SD-אוקטובר (למשל, Envisu R2200 Bioptigen/Leica) להתמודד עם העין עבור ויוו הדמיה באמצעות בקרי X ו- Y-שלב.</li>
	<li>לבצע סריקות SD-OCT כדי לוודא הפסקות של הממברנה של ברוך: לאחר ה-SD-OCT סריקות לעין כל, להעביר באופן ידני את קו הפניה באתרים lasered. הפסקות של הממברנה של ברוך צריך להיות בבירור באזורים lasered (ראה איור 1).</li>
</ol>3. fluorescein מסתמים 7,8,9
<ol><li>להסיר את העכבר עם בעל, ומניחים אותו על מערכת ה-FA (למשל, היידלברג Spectralis HRA2).</li>
	<li>ההתמקדות ב לייזר לצרוב תחומי הפונדוס של העין באמצעות מצב השתקפות אינפרא-אדום עם ראש עצב הראייה באמצע החלון הצפייה.</li>
	<li>מזריקים 0.1 מ"ל של 5% fluorescein מלח נתרן עכבר 20 גרם subcutaneously או intraperitoneally.</li>
	<li>מתמקדים רמת חיבור.</li>
	<li>קחו תמונה רמת המיקוד חיבור.</li>
	<li>מחדש להתמקד ברמת הרשתית, לקחת תמונה.</li>
	<li>המתן 30 s וחזור על צעדים 3.4-3.6.</li>
	<li>להסיר את העכבר ממחזיק והנח אותו על משטח חימום.</li>
	<li>הפוך הרדמה על ידי α2-אנטגוניסט עבור medetomidine, atipamezole (0.5 מ"ג/ק"ג, i.p.) או לחכות בעלי חיים ההתאוששות מן ההרדמה.</li>
	<li>חזור ב vivo SD-אוקטובר ו- FA הדמיה בבעלי חיים ומורדמת בימים מעקב 5, 10 ו- 14.</li>
</ol>4. CNV לדירוג
<ol><li>כיתה הנזק של הממברנה של ברוך OCT תמונות ותמונות פא חיבור נלקח מיד לאחר lasering ביום 0 כדלקמן: 0 - הממברנה של ברוך לא נפגע 1 - נזק מוצלח של הממברנה של ברוך</li>
	<li>ציון הנוכחות של CNV מאתרי lasered שהיה זליגת כפי שנצפה על ידי השוואת הדינמיקה של האות fluorescein בסדרה של תמונות פא ברשתית להלן: 0 - מראה נורמלי של הרשתית 0.5 - להתעלף מכתים של דליפה 1.0 - אזורים CNV דולפים הערה: השתמש ההדמיה OCT לאישור נוסף של CNV או בספק פא היכן הנוכחות של נוזל intraretinal בתמונות OCT מציע CNV לדירוג.</li>
</ol>5. מדידות עובי הרשתית
<ol><li>השתמש תוכנה פילוח אוטומטיות עבור מדידות עובי הרשתית. להבטיח כי נחשב את עובי הרשתית הכולל, כמו העובי של כל השכבות משכבת סיבי עצב RPE (מידה בריאה אתרים), או קו דמיוני המחבר RPE סביב האתר של נזק (אתרים lasered) (ראה גם איור 7).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+experimental+choroidal+neovascularization+in+the+rat.">A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat.</a> Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).</li><li>Tobe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+neovascularization+in+mice+with+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+photoreceptors.">Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).</li><li>Seo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+inhibition+of+retinal+and+choroidal+neovascularization+by+oral+administration+of+a+kinase+inhibitor.">Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor.</a> Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).</li><li>Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+choroidal+and+retinal+neovascularization.">Animal models of choroidal and retinal neovascularization.</a> Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> J Vis Exp. (106), e53502 (2015).</li><li>Giani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+evaluation+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+using+spectral-domain+optical+coherence+tomography.">In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+Image-Guided+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization+Model+in+Mice.">Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice.</a> PloS One. 10, e0132643 (2015).</li><li>Sheets, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotectin+D1+attenuates+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+mouse.">Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse.</a> Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).</li><li>Hoerster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+characterization+of+laser-induced+choroidal+neovascularization+variability+in+mice.">In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).</li><li>Sulaiman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Optical+Coherence+Tomography+Quantification+Method+for+Choroidal+Neovascularization.">A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization.</a> J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).</li></ol>

המחבר, Symantas Ragauskas, Ph.d. הוא עובד (מדען מחקר) מניות של Experimentica בע מ מציע החוזה שירותי מחקר העסקת המודל CNV פרה להשתמש במאמר זה.
הסופר אווה Kielczewski הוא עובד (מהנדס מחקר יישומי, OCT) של Microsystems לייקה מפיקה מערכות SD-אוקטובר להשתמש במאמר זה.
הסופר ג'וזף ונס הוא עובד (OCT נה מנהל מכירות) של Microsystems לייקה מפיקה מערכות SD-אוקטובר להשתמש במאמר זה. ג'וזף ונס היא גם נשיא, מנכ של Spective, LLC.
הסופר סיימון Kaja, Ph.d. הוא יועץ והמדען הראשי ובעל מניות של Experimentica בע מ, פרה חוזה מחקר ארגון אשר מציע חוזה שירותי מחקר, כולל דגם CNV פרה להשתמש במאמר זה. סיימון Kaja, Ph.d. הוא גם מנכ של K & מדעי P, LLC, מדעי החיים לייעוץ, ומשמש ד ר ג'ון פ ואת תרז אי Mulcahy ניחן פרופסור ברפואת עיניים Stritch הספר לרפואה, אוניברסיטת לויולה שיקגו. תנאי ההסדר הזה יש כבר נבדקו ואושרו על-ידי אוניברסיטת לויולה שיקגו בהתאם למדיניות שלה ניגוד אינטרסים.
המחבר, Giedrius Kalesnykas, Ph.d. הוא עובד (מנכ"ל) מניות של Experimentica בע מ מציע החוזה שירותי מחקר העסקת המודל CNV פרה להשתמש במאמר זה.

הדמיה עם מודאלים מרובים מציע כלי רב ערך עבור הערכה פתולוגיה CNV. כאן הצגנו פרוטוקול הדמיה המורכב של הפא, SD-אוקטובר, פילוח אוטומטית על הערכה מהירה, לשחזור ואמין של הפתולוגיה CNV. הפסקה של הממברנה של ברוך לאחר לייזר הניהול אושר. בנוסף, השימוש SD-אוקטובר בשלב זה מותר גם מיידית החזיית אפשרי שטפי intrare...

הניסיון המוצלח הראשון לחקות הפתולוגיה של האדם CNV בחולדות הודגם לפני כמעט שלושה עשורים עם לייזר קריפטון לונג-אוונס חולדות1. לאחר מכן, שימש לייזר קריפטון לפרוץ קרום של ברוך המתח העכבר הפופולרי ביותר,3,2,C57BL/6J4. שיעור ההצלחה של אינדוקציה CNV אומתה עם הפא וכתמים היסטולוגית. התפתחות מהירה של שיטות הדמיה לא פולשנית, כגון OCT, תמכה את הצמיחה של השדה של מכרסמים במודלים פרה. היכולת לעקוב אחרי שינויים מורפולוגיים הרשתית בנקודות זמן מרובים בעיניים אותו משמעותית תורם צמצום הניצול של בעלי החיים ומגביר את יעילות במחקרים ניסיוני. הערכה היסטולוגית של נגעים CNV הוא די פשוט, ודורש תיוג צמיחת כלי דם נורמלי סביב האתר של המינהל לייזר, ייבוא תמונות/שטח בנפח הערכה באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה. לעומת זאת, אין ויוו שיטות הדמיה להציג ניתוחים מורכבים יותר של פתולוגיה CNV והפרשנות שלה.
כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה יחסית כיתה אינדוקציה, התקדמות של רגרסיה של CNV באמצעות הפא, SD-אוקטובר, ואת שיטת פילוח אוטומטית העכבר לייזר המושרה CNV מודל.

<table><tbody><tr><td>Medetomidine (commercial name Domitor)</td><td>Orion</td><td>Vnr 01 56 02</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr 51 14 85</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>0,9% NaCl</td><td>B Braun</td><td>357 0340</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Xylazine (commercial name Rompun vet)</td><td>Bayer</td><td>vnr 14 89 99</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Tropicamide</td><td>Santen</td><td>Vnr 04 12 36</td><td>Mydriatic agent</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>Vnr 44 54 81</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>Systane</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;-</td><td>Lubricant</td></tr><tr><td>5% Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6377-100G</td><td>Fluoresent agent</td></tr><tr><td>Atipamezole (commercial name Antisedan)</td><td>Orion</td><td>Vnr 47 19 53</td><td>Anesthesia</td></tr></tbody></table>

in vivo multimodal imaging and analysis of mouse laser-induced choroidal neovascularization model

לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית (CNV) היא דוגמנית ומבוססת לחקות את צורת רטוב הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD). ב פרוטוקול זה, אנו שואפים מדריך את הקורא לא פשוט על-ידי השיקולים הטכניים של יצירת נגעים לייזר המושרה להנעת תהליכים neovascular, אבל מעדיף להתמקד במידע רב עוצמה ניתן להשיג יחידנית או משולבת האורך אין ויוו הדמיה לאורך כל תקופת המעקב.
עכבר לייזר המושרה CNV המודל נוצר על ידי המינהל לייזר דיודה. עם מודאלים מרובים ויוו טכניקות הדמיה שימשו כדי לפקח CNV אינדוקציה, התקדמות, רגרסיה. ראשית, תחום ספקטרלי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (SD-אוקטובר) בוצע מיד לאחר lasering כדי לוודא הפסקה של הממברנה של ברוך. לאחר מכן ויוו הדמיה באמצעות fluorescein מסתמים (FA) אישר נזק מוצלחת של הממברנה של ברוך מתמונות טורי רכשה באותה רמת חיבור. מעקב האורך של התפשטות CNV ו רגרסיה בימים 5, 10 ו- 14 לאחר lasering בוצעה באמצעות הפא ו- SD-אוקטובר. פשוטה ואמינה לדירוג של דולף leasions CNV מתמונות פא מוצג. פילוח אוטומטיים למדידת עובי הרשתית הכולל, בשילוב עם קליבר ידנית יישום למדידת עובי הרשתית באתרים CNV, לאפשר הערכה לא משוחדת של הנוכחות של בצקת. לבסוף, אימות היסטולוגית של CNV מתבצעת באמצעות isolectin GS-IB4 מכתים על flatmounts חיבור. ההכתמה היא thresholded, אזור isolectin-חיוביות מחושבת עם ImageJ.
פרוטוקול זה שימושי במיוחד לימודי הרפוי הדורשים דמויי תפוקה גבוהה הקרנת CNV פתולוגיה, שכן היא מאפשרת מהר, עם מודאלים מרובים, סיווג אמין של בצקת רשתית לפתולוגיה CNV. בנוסף, רזולוציה גבוהה SD-OCT מאפשר ההקלטה של המחפשים פתולוגיים אחרים, כגון הצטברות נוזלים subretinal או intraretinal. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת אפשרות להפיכת ניתוח אמצעי האחסון CNV מתמונות SD-אוקטובר, אשר חייב להתבצע באופן ידני.

בועה או subretinal דימום מיד לאחר lasering אינו תמיד גלוי. לכן, SD-אוקטובר חשוב במיוחד לוודא נזק של הממברנה של ברוך. איור 1 מראה דוגמה של OCT הדמיה בנקודות זמן שונות לאחר לייזר המינהל.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56173/56173fig1.jpg"> <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model at JoVE.com

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

כאן, אנו מציגים את התועלת של האורך ויוו הדמיה מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית בעכברים.

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

in-vivo-multimodal-imaging-analysis-mouse-laser-induced-choroidal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

9.0K Views.  Experimentica Ltd.. כאן, אנו מציגים את התועלת של האורך ויוו הדמיה מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית בעכברים.

Video: In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Medicine

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, difficulties in observing posterior choroidal melanoma in vivo limit tumor location and growth evaluation in real-time. The approach described here optimizes techniques for establishing choroidal melanoma in mice via a multi-step sub-choroidal B16LS9 cell injection procedure. To enable precision in injecting into the small dimensions of the mouse uvea, the complete procedure is performed under a microscope. First, a conjunctival peritomy is formed in the dorsal-temporal area of the eye. Then, a tract into the sub-choroidal space is created by inserting a needle through the exposed sclera. This is followed by the insertion of a blunt needle into the tract and the injection of melanoma cells into the choroid. Immediately after injection, noninvasive optical coherence tomography (OCT) imaging is utilized to determine tumor location and progress. Retinal detachment is evaluated as a predictor of tumor site and size. The presented method enables the reproducible induction of choroid-localized melanoma in mice and the live imaging of tumor growth evaluation. As such, it provides a valuable tool for studying intraocular tumors.

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

The present protocol describes the implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid utilizing optical coherence tomography.

השתלה והערכה של מלנומה בכורואיד מורין באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Cancer Research

A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

מודל עכבר לneovascularization Choroidal מושרה לייזר

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

פלטפורמת מיקרוסקופי מרובה-פוטונים מותאמת אישית להדמיה חיה של קרנית עכבר ולחמית

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Bioengineering

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. Innate immune cells, specifically mononuclear phagocytes, express overlapping cell surface markers, which makes identifying these populations a challenge. Multi-parameter flow cytometry allows for the simultaneous, quantitative analysis of multiple cell surface markers in order to differentiate monocytes, macrophages, microglia, and dendritic cells in mouse eyes. This protocol describes the enucleation of whole mouse eyes, ocular dissection, digestion into a single cell suspension, and staining of the single cell suspension for myeloid cell markers. Additionally, we explain the proper methods for determining voltages using single color controls and for delineating positive gates using fluorescence minus one controls. The major limitation of multi-parameter flow cytometry is the absence of tissue architecture. This limitation can be overcome by multi-parameter flow cytometry of individual ocular compartments or complimentary immunofluorescence staining. However, immunofluorescence is limited by its lack of quantitative analysis and reduced number of fluorophores on most microscopes. We describe the use of multi-parametric flow cytometry to provide highly quantitative analysis of mononuclear phagocytes in laser-induced choroidal neovascularization. Additionally, multi-parameter flow cytometry can be used for the identification of macrophage subsets, fate mapping, and cell sorting for transcriptomic or proteomic studies.

This protocol provides a method to digest whole eyes into a single cell suspension for the purpose of multi-parameter flow cytometric analysis in order to identify specific ocular mononuclear phagocytic populations, including monocytes, microglia, macrophages, and dendritic cells.

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

Immunology and Infection

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון לניטור גיוס לויקוציטים במהלך דלקת עורקים במודל מורין גפיים אחוריות

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural changes. These diseases affecting the fundus always exhibit typical abnormalities in certain cell types in the retina, including photoreceptor cells, retinal ganglion cells, cells in the retinal blood vessels, and cells in the choroidal vascular cells. Noninvasive, highly efficient, and adaptable imaging techniques are required for both clinical practice and basic research. Image-guided optical coherence tomography (OCT) satisfies these requirements because it combines fundus photography and high-resolution OCT, providing an accurate diagnosis of tiny lesions as well as important changes in the retinal architecture. This study details the procedures of data collection and data analysis for image-guided OCT and demonstrates its application in rodent models of choroidal neovascularization (CNV), optic nerve crush (ONC), light-induced retinal degeneration, and experimental autoimmune uveitis (EAU). This technique helps researchers in the eye field to identify rodent retinal structural changes conveniently, reliably, and tractably.

The protocol presented here details the procedures of data collection and data analysis for image-guided optical coherence tomography (OCT) and demonstrates its application in multiple rodent models of ocular diseases.

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural ...