המחברים רוצה להכיר אפריל וויילס, ד ר רוג'ר Broderson לקבלת סיוע עם necropsy בעלי חיים ובידוד בלוטת, בהתאמה. מימון עבור עבודה זו נתמכה על ידי המרכזים פילדלפיה המכללה לרפואה אוסטאופתי עבור כרונית בהפרעות של הזדקנות.

הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים פרוטוקול זה היו נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של פילדלפיה אוסטאופתי לרפואה ואת כל הטכניקות נערכו תחת קפדנית מנחים.
 1. רכש דגימת ועיבוד <ol><li>בחר נושא בעלי חיים המתאימים ומקום לתא 2 CO. עבור ניסוי זה, השתמש בשבוע 8-10 הישן B6 nulliparous הנשי. Cg-Cav1tmMIs/J ו- C57BI/6J.</li>
	<li>הפעל זרימת הגז ל- 30-40%. לאחר החיה בעליל הכרה לאחר כ- 2 דקות, לפתוח את השסתום גז בלחץ מלא עבור 5 דק נוספות 
	הערה: אשר המוות בבעלי חיים על ידי התבוננות סימנים גלויים של נשימה (למשל תנועת החזה) לתקופה של 10 דקות לאחר הפסקת משלוח 2 CO. אם החיה עדיין בחיים, אפשר למקם אותו בחזרה בבית הבליעה 2 CO. נקע בצוואר הרחם עשוי לשמש גם למרות שזה לא מומלץ כי דם עלולים להצטבר סביב בלוטות החלב מתנגש עם דיסקציה של תוצאות.</li>
	<li>בעקבות הקרבה, להצמיד את השלד במצב פרקדן, עיתוני עם אתנול 70%-</li>
	<li>לצבוט את פלט מעל לחיקו באמצעות מלקחיים, ניק עם מספריים כירורגיים קטנים. סיבוב את המספריים, לחתוך הפרווה לאורך הקו האמצעי הגחון נע סימטרית הגולגולת.</li>
	<li>עם מספריים גדולים יותר או עוצר דימום, בוטה לנתח fascia תת עורית דו צדדיים, באמצעות התראה לא ל פנצ׳ר של הצפק. חתך לאורך השוליים האופקיים בשני קצותיו דיסטלי של החתך.</li>
	<li>Pin הפרווה מדפים פתח, לרסס שוב עם אתנול 70%- 
	הערה: למרות השימוש של 70% אתנול מותרת יותר ויזואלי ההבחנה בין בלוטת הרקמה התת עורית שמסביב, להיות זהירים כדי למנוע ייבוש של הרקמה כתוצאה של פתרון זה. כדי למנוע ייבוש, להסיר את בלוטת בתוך מסגרת זמן שלא יעלה על 4 דקות. כחלופה 70% אתנול, החוקר גם להחליף מאגר ולבודד כלליות, כגון 1 x PBS, כדי להימנע לייבוש רקמות.</li>
	<li>באיתור בלוטות החלב של עניין, שקופית להב סכין #4 לאורך החלק הפנימי של המשק פלט, חותכים את בלוטת חלב ואת עורית של אדיפוז המשויך חינם של הדרמיס. 
	הערה: 3.5 x זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי עשויים לסייע ויזואליזציה קל יותר של הבלוטות.</li>
	<li>מיד להטביע בלוטת לאחרונה מבודד צינור חרוטי המכילים 10:1 פתרון-רקמת אחסון של 10% פורמלין במאגר נייטרלי במשך 24-48 ה 
	הערה: הכוונה של המחקר, כתות ומייצבים אלטרנטיביים רבים עשוי לשמש בהתאם כגון paraformaldehyde, אתנול גנומית מחקרים, RNA זמינים מסחרית שמירה על מאגרי.</li>
	<li>בצע פרוטוקולים מוסדיים להטבעת פרפין, לשלוח דוגמאות ליצרן לעיבוד, הטבעה, ושקופית חותך/הרכבה. בסעיף רקמות-5 מיקרומטר. 
	הערה: עקב עודף אדיפוז בלוטת שמסביב, לשקול הסרת מיקרומטר 100-200 של רקמות לפני חלוקתה, מכתים.</li>
</ol> 2. רקמת Staining <ol><li>אימונוהיסטוכימיה <ol><li>המקום שקופיות כדי להיות מוכתם בבלוק חום שוכן בגובה 58 הלעפה תרוטרפמט עבור h 1 להמיס פרפין. 
		התראה: התכה פרפין עשויה לפעול מחוץ לשקופית. לפקח מקרוב או להציב מנגב תחת שקופיות כדי ללכוד נגר שעווה. 
		הערה: שלב זה לא הכרחי, אולי ניתן לדלג. ואם התוצאות לא כמצופה, הוספת הזה צעד אחורה עשוי לשפר את התוצאות.</li>
		<li>Incubate השקופיות שקופית ג'אר קסילן המכיל 100% למשך 30 דקות הבטחת צלילה מלאה. אני חוזר פעם. 
		הערה: בשלב זה, בדיקה ויזואלית צריכה להתבצע כדי להבטיח כי קטעי רקמה חופשית של רקמת שומן, פרפין. אם רקמת שומן נוספים או שעווה ניכרת, השקופית צריך להיות מחדש שקועים קסילן. שימוש באזהרה כדי למזער חשיפה נוספת קסילן כמו זה יכול לגרום התכווצות של הרקמות.</li>
		<li>נוזלים ברקמות בצנצנת השקופית המכילה 100% אתנול במשך 10 דקות חוזר פעם.</li>
		<li>להעביר את השקופיות צנצנת השקופית שמכילה אתנול 95% במשך 10 דקות חוזר פעם.</li>
		<li>להעביר את השקופיות שקופיות צנצנת המכילה 75% אתנול עבור 5 דק.</li>
		<li>להעביר את השקופיות שקופיות צנצנת המכילה 50% אתנול עבור 5 דק.</li>
		<li>להרתיח הפתרון סודיום ציטרט 10 מ מ (pH 6.0) צלחת חמה או מיקרוגל ויוצקים לתוך צנצנת Coplin. 
		התראה: לפקח על פתרון תוך חימום ובזהירות לטפל כדי למנוע לרתיחה מעל. מיכל יהיה חם מאוד. השימוש הגנה כדי למנוע כוויות.</li>
		<li>לאט המקום מגלשות לתוך Coplin צנצנת, הבטחת צלילה מלא, ו דגירה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לאחזר epitopes. הסר ויבשה בקפידה שקופיות.</li>
		<li>צייר מחסום מסביב רקמות עם סמן הידרופובי. הוסף מספיק אנזים אנדוגני חוסמי (מימן על-חמצני, אזיד הנתרן, זמינים מסחרית) לכסות את רקמות, תקופת דגירה של 10 דקות</li>
		<li>השקופיות Submerge פוספט x 1 buffered תמיסת מלח (PBS) במשך 10 דקות</li>
		<li>להוסיף סרום מספיק חמור 10% ב- PBS 1 x כדי לכסות את רקמת תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified. 
		הערה: הניסוי ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון השקופיות בבית הבליעה humidified ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בזמן חמור בסרום נמצאה להניב תוצאות אופטימליות מוכתמים, ייתכן החוקר רוצה לבדוק סרה שונים כגון אלבומין שור (BSA), סרום עז או סרום סוס כדי לקבוע תוצאות אופטימליות. אם משתמש BSA, החוקר צריך להכין טרי זה לפני השימוש.</li>
		<li>Decant חוסם עודף משקופיות ולהוסיף נוגדן ראשוני כראוי מדולל בנסיוב 1% ישירות על השקופיות להבטיח כי הרקמה באופן שווה מכוסה פתרון. תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך תא humidified. 
		הערה: שלב זה עשוי להיות המשך עבור משכי זמן ארוכים עם לח תא המאוחסנים ב-4 ° C. הקפידו לכלול שקופיות שליטה שלילי (כגון שקופית עם אין נוגדן ראשוני, ידוע רקמות אנטיגן-שלילי, וכו ') בשלב זה.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות מאת זורם בערך 1 מ"ל של לשכפל 2 O על רקמות ובזהירות דגירה בשינוי 1 ל- PBS x 1 עבור 5 דק.</li>
		<li>Decant PBS עודף ולהוסיף תווית peroxidase מספיק חזרת כדי לכסות את רקמת תקופת דגירה של 30 דקות בתוך תא humidified. 
		הערה: בשלב זה, החוקר הרוצים להמשיך פלורסנט מכתים באמצעות נוגדנים משניים fluorescently מצומדת. אם זה רצוי, השלבים הבאים תיאר צריך להיות שונה בהתאם.</li>
		<li>לשטוף את השקופיות מאת זורם בערך 1 מ"ל של לשכפל 2 O על רקמות ובזהירות דגירה בשינוי 1 ל- PBS x 1 עבור 5 דק.</li>
		<li>להפוך diaminobenzidine (DAB) פלוס chromogen פתרון על פי היחס המוצע היצרן ומערבבים על ידי מערבולת. 
		הערה: הרבה ערכות מוכנות מראש הם זמינים מסחרית מלבד שימוש בפרוטוקול זה.</li>
		<li>Decant עודף מאגר משקופיות ולהוסיף 2-3 טיפות (10-50 µL) של chromogen כתם ישירות לרקמות ו תקופת דגירה של 5 דקות בחדר לחים. בזהירות משתלטת השקופיות על-ידי זורמים כ 1 mL לשכפל 2 O רקמות. 
		התראה: DAB-chromogen הוא רעיל מאוד. להימנע ממגע ישיר של כתם בתזרים העור ומסייעים לאסוף את-פסולת מסוכנת.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxylin ואאוזין (H &#38; E) <ol><li>לאחר השטיפה הסופית לאחר דגירה chromogen, להטביע שקופיות ב hematoxylin האריס עבור 2-2.5 דקות שקופיות יש לשטוף בעדינות תחת ברז מים במשך 1-2 דקות 
		הערה: לטפל כדי למנוע סילון ישירה של מים על גבי רקמות.</li>
		<li>Submerge שקופיות עבור 2-3 s בפתרון בידול (0.25 מ"ל חומצה הידרוכלורית 100 מ של 70% אתנול). לשטוף את השקופיות בעדינות תחת ברז מים במשך כ- 1-2 דקות</li>
		<li>להטביע שקופיות בסוכן כחול (4.5 מ"ג סידן פחמתי ב- 100 מ ל מי ברז, pH להתאים ל- 9.4) עבור שקופיות שטיפה ס' 60 ב 95% אתנול ל 30 ס</li>
		<li>השקופיות Submerge אלכוהוליים אאוזין Y עבור 2-3 דקות</li>
		<li>מייבשים רקמות 2 שינויים של אתנול 95% 1 דקות.</li>
		<li>רקמת Dehydrate 1 שינוי של אתנול 100% עבור מינימלית 1</li>
		<li>יבש בזהירות שקופיות עם מגבון נטולת מוך. החלת טיפה 1 (כ 100-200 µL) של סינתטיים, הלא-מימית, שרף המבוססת על טעינת מדיה שקופית ולהחיל coverslip. 
		הערה: אם נבחר מכתימים שיטה שונה, באמצעי התקשורת הרכבה שונים עשוי להידרש. למשל, אם החוקר בוחר נוגדנים משניים מצומדת פלורסנט, הר מימית יהיה יותר אידיאלי.</li>
		<li>לאפשר שקופיות להגדיר ללילה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li> <li>Staining Picrosirius אדום (הפי) <ol><li>בחר שקופיות כדי להיות מוכתם ופעל אימונוהיסטוכימיה פרוטוקול דרך שלב 6 (50% אתנול להשרות).</li>
		<li>השקופיות Submerge הפי כתם על ה' 1</li>
		<li>להטביע שקופיות ב- 0.5% חומצה אצטית עבור s 1-2, פעמיים כדי להבדיל בין הכתם.</li>
		<li>מייבשים רקמות 2 שינויים של אתנול 95% 1 דקות.</li>
		<li>רקמות Dehydrate 1 שינוי של אתנול 100% עבור מינימלית 1</li>
		<li>ברור שקופיות על ידי בקצרה השוקע ב- 100% קסילן עבור ס' 3-4</li>
		<li>יבש בזהירות שקופיות עם מגבון נטולת מוך. החלת טיפה 1 (כ 100-200 µL) של סינתטיים, הלא-מימית, שרף המבוססת על טעינת מדיה שקופית ולהחיל coverslip.</li>
	</ol></li></ol> 3. לטעום ניתוח <ol><li>ניתוח Ductal <ol><li>בחר שקופיות צבעונית עבור α-SMA. באמצעות מיקרוסקופ אור מצויד יעד רכוב מצלמה, לאסוף להחליפן בתמונות בהגדלה X 20-</li>
		<li>שימוש ImageJ (NIH), להבדיל ולספור צינורות לכל תמונה. אלה יכולים להיות ספירה ידנית או אחד יכולות להקצות תוצאה מספרית צינורות בודדים. כדי להקצות תוצאה מספרית, פתח ImageJ ובחר תוספים. לאחר מכן בחרו נתח ובחרו מונה תא מתוך התפריט הנפתח. לחץ על אתחל ולאחר מכן לסמן את סוג 1 כדי להתחיל תיוג צינוריות. בסיום, בחר תוצאות כדי להציג את הספירה ductal. 
		הערה: לטפל כדי לוודא מבנים הם ductal ואת כלי הדם לא.</li>
		<li>ב &#39; מדידה להגדיר &#39; אופציות, בדוק &#39; היקפית &#39; ו- &#39; אזור &#34;.</li>
		<li>בעזרת הכלי מצולע ביד חופשית, לצייר קו סביב כל צינור-תא myoepithelial (ראות שנעזר α-SMA כתם). בחר &#39; מידה &#39; ולהקליט את ההיקף ואת אזור.</li>
		<li>שוב בעזרת הכלי מצולע ביד חופשית, לצייר קו לאורך הצד הפסגה של האפיתל ductal בתוך החלק הפנימי של לומן. בחר &#39; מידה &#39; ולהקליט את ההיקף ואת אזור.</li>
		<li>להחסיר את ההיקף של תא luminal מן ההיקף של תא myoepithelial על מנת לקבל את היקף ductal האפיתל. להחסיר את האזור של תא luminal מהאזור של תא myoepithelial כדי להשיג את האזור של האפיתל ductal.</li>
	</ol></li> <li>אימונוהיסטוכימיה ניתוח <ol><li>להעלות תמונות brightfield תוכנה אנליטית, כגון ImageJ או סוויטה פיג'י. 
		הערה: פרוטוקול זה מתאר את השלבים עבור צביעת ניתוח באמצעות ImageJ והתוסף בארגז הכלים IHC.</li>
		<li>לפתוח את ארגז הכלים IHC ' מתפריט ' תוסף. ב &#34; בחר דגם &#34; תיבה משולבת שנפתח, בחר הכתם המתאים (קרי H-DAB, הפי, וכדומה). בחר &#34; צבע &#34; אפשרות לבודד את הכתם. פעולה זו תפתח חלון התוצאה. 
		הערה: שיטה זו מתאימה, אם חלבון עניין ממוקם ברווחים חוץ-תאית או cytosolic, או מאוגד קרום פלזמה. אם החלבון עניין הגרעין, בחירת &#34; גרעינים &#34; יבקש את התוסף על מנת לנתח את התמונה עבור גרעין חיובי מוכתם.</li>
		<li>השתמש השקופית בוחר צבע כדי להבטיח בידוד נאות של הכתם ללא רקע הכללה או אי הכללה הכתם מופרז. 
		הערה: אם מצב אוטומטי אינו מסוגל לזהות את הכתם או לא תגרום תמונות מקובל, צייר ריבוע אזור של הריבית (ROI) מעל מזוהה צבעונית באזור. בחלון IHC בארגז הכלים, בחר &#34; הרכבת &#34; לכוון את התוסף המתאים ליעד.</li>
		<li>להמיר את התמונה ל- 16 סיביות. עבור אל התמונה &#8594; סוג &#8594; 16 bit.</li>
		<li>סף התמונה. עבור אל התמונה &#8594; להתאים את &#8594; אוטומטי הסף.</li>
		<li>קבע את קנה המידה של התמונה על ידי ציור קו רועי ישירות מעל הבאר סולם בתמונה מכן הקצאת האורך. כדי להגדיר את סרגל קנה מידה, ללכת ניתוח &#8594; לקבוע קנה מידה- קלט מספר פיקסלים לכל יחידת הרצויה אורך (למשל 120 פיקסלים לכל 50 מיקרומטר).</li>
		<li>למדוד את השטח תוצאות ואני מתכוון ערך אפור. ללכת נתח &#8594; להגדיר מידות לאסוף את המדידה על-ידי לחיצה על ניתוח &#8594; מידה.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+cancer+cell-derived+extracellular+matrix+in+tumor+progression.">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li><li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+biology+and+implications+for+treatment.">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin,+fibronectin,+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer:+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression.">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting.">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li><li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+tumor/stromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients.">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li><li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts.">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li><li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers.">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li><li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2009).</li><li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation.">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li><li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands.">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).</li><li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation.">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li><li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland.">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעיתון תארנו טכניקה כדי לבודד את העכבר ללא פגע בלוטות מוגדלות עבור ניתוחים היסטולוגית במורד הזרם של מורפולוגיה ductal וביטוי ECM. לגבי ניתוחים של מורפולוגיה ductal, מתודולוגיה זו מאפשרת חקירת ארכיטקטורת ductal מבוסס את סעיפים מוכתמים היסטולוגית מהירה. שיטות אחרות של ניתוחים ductal להסתמך על זריקות של...

סרטן השד מאופיין על ידי מידה ניכרת של רקמות פיברוזיס1,2,3,4. מכונה ECM, הישות-סלולר זו הוא נמצא בדרגות ברקמות כל, מורכבת בעיקר meshwork מורכבים של collagens fibrillar ו- fibrillar, אלסטין glycoproteins בנוסף מולקולות איתות שונים כי הם רע מטריצה זו. בתנאים homeostatic, התצהיר והשפלות של ECM מפוקחת. 5 במהלך tumorigenesis השד, האיזון של התצהיר ECM והשפלה משובשת. ככזה, גידולים בשד דווחו לבטא שופע ECM חלבונים כגון collagens, fibronectin, tenascin-C בין השאר. 6 הביטוי לא תקין של חלבונים אלה בנוסף דפוסים מוגברת של מטריקס crosslinking תועד כדי לקדם את השד הגידול התקדמות, גרורות, טיפול ההתנגדות1,3, 4,-7,-8,-9.
כדי להעריך הרכב ECM ו מורפולוגיה ductal, בוצע בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע. כאן, אנחנו המשמש עכברים nulliparous נקבה לקויה caveolin-1, חלבון ממברנלי אינטגרלי אשר נקשר אגרסיבי השד הגידול החתימה10,11,12, שליטה נשית B6 nulliparous עכברים. צביעה של רקמות אלה ועיבוד היסטולוגית מותר זיהוי חלבונים שונים ECM עם אפיון ductal מורפולוגיה.
בסך הכל, בידודו של בלוטות מוגדלות שלם, שלם נותן חוקרים ההזדמנות לחקור את רקמת מורפולוגיים או הסלולר שינויים המתרחשים כתגובה גורמים אקסוגניים או אנדוגני. החסרונות של הטכניקה משויכות ניתוחים של 2 סעיפים רקמות מימד (2D) לעומת מבט תלת-ממד, אשר יניב תמונה שלמה יותר של המורפולוגיה מורכבים של העץ ductal. לאור המורכבות של אינטראקציות תא התא, התא-ECM המתרחשים בבלוטת החלב, בידודו של בלוטות שלם, תקין יש יתרון לניתוח ביעילות ductal מורפולוגיה וחלבונים ביטוי באזורים שונים מאתר החלב בלוטת.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Light Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Entry software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5x-R Surgical Micro Loupes</td>
			<td>Rose Micro Solutions</td>
			<td></td>
			<td>Magnification at researcher&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Medline</td>
			<td>DYND04035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>Size appropriate for tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K400611-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picrosirius Red Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y, alcoholic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT110132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HHS16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes, Reagent Grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792780</td>
			<td>suitable for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S279-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>202932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S1964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt&#39;s Mounting Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB23750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tenascin-C antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB108930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB124964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Envision Dual Link System HRP</td>
			<td>Dako</td>
			<td>K4065</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology

המטרה של הליך זה היה כדי לקצור #4 בטן בלוטות מוגדלות של עכברים nulliparous הנשי כדי להעריך ביטוי ECM ואדריכלות ductal. . הנה, כיס קטן מתחת לעור נוצר באמצעות מספריים מאיו, ומאפשר פרידתה של הבלוטות בתוך רקמת השומן התת עורית הצפק המשמש כבסיס. ויזואליזציה של הבלוטות נעזרה השימוש 3.5 x-R זכוכיות מגדלת מיקרו כירורגי. הפרווה היה. הפוך, נצמיד המאפשר זיהוי של הידיות שומן החלב ללא פגע. אחד של בלוטות בטן #4 היה בוטה מבותרים על-ידי הזזה הלהב האזמל רוחבית בין השכבה התת עורית הבלוטות. מיד לאחר הקציר, בלוטות הונחו בפורמלין במאגר נייטרלי 10% עבור עיבוד רקמות עוקבות. כריתה של בלוטת כולו הוא יתרון, כי זה בעיקר מבטלת את הסיכון של אי-כלילת חשוב רקמות ברוחב אינטראקציה בין תאים אפיתל ductal אוכלוסיות אחרות microenvironmental הסלולר שלא יכול להיות בביופסיה חלקית. חסרון אחד של המתודולוגיה הוא השימוש סעיפים טורי רקמות קבוע אשר מגביל את ניתוח של הביטוי מורפוגנזה וחלבון ductal במיקומים נפרדים בתוך בלוטת. ככזה, שינויים בביטוי חלבונים ואדריכלות ductal 3 מימד (3D) אינה השגה בקלות. בסך הכל, הטכניקה ישימה ללימודים הדורשים עטין מאתר שלם כל החקירות במורד הזרם כגון התפתחותית ductal מורפוגנזה או השד סרטן.

עכברים נקבה יש 5 זוגות של בלוטות מוגדלות. באופן ספציפי, יש זוג אחד של בלוטות צוואר הרחם (#1), שני זוגות של בלוטות בית החזה (#2 ו- #3), זוג אחד של בטן בלוטות (#4), 1 זוג בלוטות במפשעה (מס ' 5) (איור 1א'). כאן, אנחנו מבודדים הבלוטות #4 כפי שהם לזיהוי בקלות. בנסיבות מס?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology at JoVE.com

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  University of Nebraska Medical Center. כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

Video: Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

שינויים במורפולוגיה בלוטת החלב ואת הסיכון לסרטן השד אצל חולדות

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

הערכת התפתחות בלוטת החלב פונקציה ועל מודלים עכבר

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

הזרקת intraductal עבור משלוח סמים מקומיים לעכבר החלב בלוטת

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence עקיף על סעיפים קפואים של עכבר בלוטת החלב

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...