Name: isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology at JoVE.com

Yazarlar Nisan Wiles ve Dr. Roger Broderson sırasıyla hayvan nekropsi ve bezi yalıtım, hakkında yardım almak için kabul etmek istiyorum. Bu iş için fon Philadelphia üniversite osteopatik tıp merkezleri tarafından kronik bozuklukları, yaşlanma için destek verdi.

hayvan bireylerde bu iletişim kuralı ile ilgili yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Philadelphia Osteopatik Tıp Fakültesi tarafından onaylanmış ve tüm teknikleri sıkı altında yapılmıştır Etik kurallar.
 1. örnek satın alma ve işleme <ol><li>seçin uygun hayvan konu ve CO 2 odası yerine. Bu deneme için 8-10 hafta kullanan eski dişi nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J ve C57BI/6J.</li>
	<li>Gaz akışı açmak % 30-40. Bir kez hayvan yaklaşık 2 dakika sonra gözle görülür bilinci yerinde değil, ek bir 5 dakika süreyle tam basınç için gaz vanası açık 
	Not: hayvan ölüm (örneğin göğüs hareketi) CO 2 teslim bırakma sonra bir 10 dakika boyunca nefes görünür işaretleri gözlemleyerek onaylayın. Hayvan hala hayatta olsa, geri CO 2 odasında yerleştirilebilir. Servikal yerinden çıkması da kan diseksiyon sonuçları çalışmasına mani meme dokuları çevresinde biriktikçe tavsiye edilmez, ancak kullanılabilir.</li>
	<li>Kurban, ardından pin karkas sırtüstü pozisyonda ve % 70 etanol ile emdirmek.</li>
	<li>Yukarıda forseps kullanarak pubis pelt pinch ve küçük Cerrahi makas ile nick. Makas, döner kesme taşıma ventral orta çizgi boyunca pelt Kaudal kafatası için.</li>
	<li>Daha büyük makas veya bir hemostat ile açık açık subkutan fasya bilateral, karın zarını delmek değil dikkatli kullanarak incelemek. Yatay kenar boşlukları boyunca belgili tanımlık kesme distal her iki uçta da kesti.</li>
	<li>PIN pelt Kapakları açın ve tekrar % 70 etanol ile sprey. 
	Not: her ne kadar % 70 etanol bezi ve çevresindeki subkutan doku arasında daha iyi görsel ayrım açiktir, doku kullanımı Bu çözümün sonucu kurutma önlemek dikkatli olun. Kurutma önlemek için 4 dk aşmayacak şekilde bir zaman dilimi içinde bezi kaldırın. % 70 etanol için alternatif olarak, araştırmacı da doku kuruma önlemek için 1 x PBS gibi genel bir ayrı tutma tampon yerine kullanabilir.</li>
	<li>İlgi, meme dokuları bulma slayt boyunca meme bezi ve ilişkili Kutanöz yağ dermis ücretsiz kesme pelt flep içine #4 neşter blade. 
	Not: 3,5 x cerrahi mikro büyüteçler bezleri daha kolay görsel öğeyi yardımcı olabilir.</li>
	<li>Hemen daldırın konik tüp için 24-48 h % 10 tarafsız tampon formalin 10:1 çözüm-doku hacmi içeren yeni izole bezi 
	Not: paraformaldehyde, genomik çalışmalar ve ticari olarak mevcut RNA arabellekleri korunması için etanol gibi birçok alternatif Fiksajlar çalışma amacı bağlı olarak, kullanılabilir.</li>
	<li>Parafin katıştırma için kurumsal iletişim kuralları izleyin, bize örnek katıştırma, satıcıya işleme ve montaj Dilimleme/slayt. Bölüm 5 mikron, dokulara. 
	Not: aşırı yağ çevreleyen bezi nedeniyle 100-200 µm kesit ve boyama önce doku kaldırmayı düşünün.</li>
</ol> 2. Doku Staining <ol><li>ısı blokta lekeli için immünhistokimya <ol><li>yer slaytlar ayarla, parafin eritmek 1 h için 58 ˚C. 
		Dikkat: parafin balmumu erime slaytın dışına çalışmaya başlayabilir. Yakından izleyin veya yer silme ikinci tur balmumu yakalamak için slaytın altında. 
		Not: Bu adım gerekli değildir ve atlanabilir. Sonuçlar beklendiği gibi değilse, bu adımı geri ekleme sonuçları artırabilir.</li>
		<li>Incubate slaytları bir slayt içeren % 100 Ksilen 30 dk tam batma sağlanması için jar. Bir kez yineleyin. 
		Not: Bu noktada, doku bölümlerde yağ dokusu ve parafin serbest olduğundan emin olmak için görsel muayene yapılmalıdır. Ek yağ dokusu veya balmumu belirgin ise, slayt Ksilen içinde yeniden ve sular altında. Bu doku büzülme neden olabilir gibi eklenen Ksilen maruz en aza indirmek için dikkatli olun.</li>
		<li>% 100 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz rehydrate dokularda bir kez yineleyin.</li>
		<li>Hareket slaytlar % 95 etanol 10 dakika süreyle içeren bir slayt kavanoz için bir kez yineleyin.</li>
		<li>Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 75 etanol 5 dakika süreyle hareket</li>
		<li>Slaytları bir slayt kavanoz içeren % 50 etanol 5 dakika süreyle hareket</li>
		<li>Kaynatın 10 mM sodyum sitrat çözüm (pH 6.0) sıcak bir tabak veya mikrodalga ve Coplin kavanoza dökün. 
		Uyarı: Dikkatli bir şekilde çözüm Isıtma sırasında izlemek ve üzerinde kaynatın önlemek için dikkat ediniz. Konteyner çok sıcak olacak. Yanık önlemek için koruma kullanın.</li>
		<li>Yavaş yavaş Coplin yer slaytlara jar, tam batma, sağlanması, epitopları almak 10 dk 100 ° C'de kuluçkaya. Kaldırmak ve dikkatle slaytlar kuru.</li>
		<li>Bir engel etrafında doku hidrofobik bir marker ile çizin. Yeterli endojen enzim engelleyici ekleyin (hidrojen peroksit ve sodyum azid, mevcut ticari olarak) ve doku kapağı için 10 dk. kuluçkaya</li>
		<li>10 dakika süreyle saline (PBS) Submerge slaytları 1 x fosfat tamponlu</li>
		<li>Eklemek yeterli % 10 eşek serum ve doku kapsayacak bir oksijen odası oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya 1 x PBS içinde. 
		Not: Deneme burada slaytları oksijen Odası 4 ° C'de gecede depolayarak duraklatılmış. Eşek serum en iyi boyama sonuç vermeye bulundu iken, araştırmacı sığır serum albumin (BSA), keçi serum veya en iyi sonuçları belirlemek için at serum gibi farklı sera sınamak isteyebilirsiniz. BSA kullanıyorsanız, araştırmacı bu taze kullanmadan önce hazırlamalıdır.</li>
		<li>Aşırı engelleyici slaytlardan dikkatle boşaltmak ve düzgün seyreltilmiş birincil antikor doğrudan slaytlara doku eşit olarak çözümde kaplıdır sağlanması % 1 serum eklemek. Oksijen odası oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. 
		Not: Bu adımı uzun zaman süreleri için nemli Odası 4'te depolanmış devam ° C. bu adımda doğru negatif kontrol slaytlar (örneğin bir slayt ile bilinen antijen-negatif doku, vb hiçbir birincil antikor) eklemek emin olun.</li>
		<li>Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya</li>
		<li>Aşırı PBS dikkatle boşaltmak ve doku kapak ve 30 dk içinde oksijen odası için kuluçkaya için yeterli horseradish peroksidaz etiket ekleyin. 
		Not: Bu adımda, araştırmacı fluorescently konjuge ikincil antikorları kullanarak boyama floresan için devam etmek isteyebilirsiniz. Bu isterseniz, açıklanan sonraki adımları uygun şekilde değiştirilmesi.</li>
		<li>Dikkatle diH 2 O doku üzerinde yaklaşık 1 mL akan tarafından slaytlar yıkama ve 1 x PBS 5 dakika süreyle 1 değişiklik kuluçkaya</li>
		<li>Yapmak diaminobenzidine (DAB) Kromojen çözüm üretici önerilen oranı göre artı ve mix gönderen vortex. 
		Not: Birçok hazır kitleri piyasada bulunan bu protokol için kullanılan bir kenara.</li>
		<li>Decant fazla tampon slaytlardan ve 2-3 damla Kromojen leke (10-50 µL) doğrudan dokuların ekleyin ve nemli odasında 5 min için kuluçkaya. Dikkatle doku üzerinde slayt akan yaklaşık 1 mL diH 2 O tarafından yıkayın. 
		Dikkat: DAB-Kromojen çok zehirli. Tehlikeli atık içinde kapalı leke cilt ve toplamak akışı ile doğrudan temas önlemek.</li>
	</ol></li> <li>Hematoksilen ve Eozin (H &#38; E) <ol><li>son durulama Kromojen kuluçka sonra takip daldırın Harris Hematoksilen musluk suyu 1-2 dakika süreyle yavaşça altında 2-2,5 dk. durulama slaytlar için slaytlar 
		Not: su doku üzerine doğrudan jet önlemek için dikkat ediniz.</li>
		<li>Submerge farklılaşma çözüm (100 ml % 70 etanol hidroklorik asit 0.25 mL) 2-3 s için slaytlar. Slaytları musluk suyu yaklaşık 1-2 dakika süreyle yavaşça altında durulayın</li>
		<li>% 95 etanol için 30 60 s. durulama slaytlar için slaytlar mavi Agent (100 mL musluk suyundaki 9.4 için ayarlanır pH 4.5 mg kalsiyum karbonat) daldırın s.</li>
		<li>Alkollü Eozin Y 2-3 dakika süreyle Submerge slaytları</li>
		<li>% 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokusunda kurutmak.</li>
		<li>% 100 etanol 1 dk. değiştirmek Dehydrate doku 1</li>
		<li>Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma. 
		Not: farklı bir boyama yöntemi seçildi, farklı montaj medya gerekli olabilir. Örneğin, araştırmacı bir floresan Birleşik ikincil antikor seçerseniz, sulu bir Dağı daha ideal olurdu.</li>
		<li>Gecede oda sıcaklığında ayarlamak slayt izin.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius kırmızı (PSR) Staining <ol><li>lekeli ve immünhistokimya Protokolü (% 50 etanol emmek) adım 6 ile takip için slaytları seçin.</li>
		<li>PSR Submerge slaytları için 1 h. leke</li>
		<li>%0,5 Asetik asit 1-2 s, iki kez leke ayırt etmek için slaytları daldırın.</li>
		<li>% 95 etanol 1 dk. için 2 değişiklik dokularda kurutmak.</li>
		<li>Dehydrate dokularda % 100 etanol 1 dk. değiştirmek 1</li>
		<li>Temizleyin slaytlar kısa bir süre için % 100 Ksilen içinde hakkında batış tarafından 3-4 s.</li>
		<li>Hav bırakmayan bir bezle dikkatlice kuru slaytlar. 1 damla uygulamak (yaklaşık 100-200 µL) sentetik, sulu olmayan, reçine tabanlı slayt ve coverslip uygulamak için ortam takma.</li>
	</ol></li></ol> 3. Örnek analiz <ol><li>Duktal analizi <ol><li>seçin slaytlar lekeli α-SMA için. Kamera monte objektif ile donatılmış bir ışık mikroskop kullanarak toplamak temsilcisi imge vasıl 20 X büyütme.</li>
		<li>Kullanma ImageJ (NIH), ayırt etmek ve kanalları her görüntüde saymak. Bunlar el ile numaralandırılan veya bir sayısal puanı için bireysel kanalları devredebiliriz. Bir sayısal puan atamak için ImageJ açın ve eklentileri seçin. Analiz seçin ve açılır menüsünden hücre sayacı seçin. Başlat'ı tıklatın sonra tip kanalları etiketleme başlamak için 1 vurgulayın. Ne zaman tamamlanmak, duktal sayısı görüntülemek için sonuçları seçin. 
		Not: duktal ve değil vasküler yapılardır doğrulamak için dikkat ediniz.</li>
		<li>İçinde &#39; ölçüm ayarla &#39; seçenekleri, kontrol &#39; çevre &#39; ve &#39; alan &#34;.</li>
		<li>Bir serbest Çokgen aracını kullanarak myoepithelial yuvası (α-SMA leke tarafından destekli görünürlük), her kanal etrafında bir çizgi çizin. Seçin &#39; ölçü &#39; ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.</li>
		<li>Tekrar bir serbest Çokgen aracını kullanarak duktal epitel apikal tarafında bir satır Lümen içi içinde çiz. Seçin &#39; ölçü &#39; ve çevre ve alan kaydedebilirsiniz.</li>
		<li>Myoepithelial bölme luminal bölmesinin gelen çevre çevre duktal epitel çevresi elde etmek için çıkarma. Duktal epitel alanı elde etmek için myoepithelial bölme alan luminal bölme alan çıkarma.</li>
	</ol></li> <li>İmmünhistokimya analizi <ol><li>Upload aydınlık alan görüntüleri bir analitik yazılım, ImageJ veya FIJI Suite gibi. 
		Not: Bu protokol analiz ImageJ ve IHC Toolbox eklentisi kullanarak boyama için özet bilgiler.</li>
		<li>IHC araç kutusu eklenti menüsünden açın. İçinde &#34; Model Seç &#34; açar, uygun leke seçin açılan kutu (Yani H-DAB, PSR, vb). Seçin &#34; renk &#34; leke yalıtmak için seçeneği. Bu bir sonuç penceresi açılacaktır. 
		Not: Bu yöntem ilgi bir proteinin hücre dışı veya sitozolik alanlarda yer alan veya plazma zarı bağlı uygundur. Faiz protein nükleer ise, seçme &#34; çekirdeği &#34; olumlu lekeli çekirdekler için görüntü analiz etmek için eklenti isteyecektir.</li>
		Renk Seçici'yi slayt kullanmak uygun yalıtım olmadan arka plan içerme veya dışlama aşırı leke leke emin olmak için <li>. 
		Not: otomatik mod leke tespit edemiyor veya kabul edilebilir Albümdeki yol açmaz, bir kare bölgesi faiz (ROI) üzerinde tanımlanan bir bölge lekeli çizin. IHC Toolbox penceresi seçin &#34; tren &#34; uygun hedef eklentisine yönetecek.</li>
		<li>16-bit için resmi dönüştürün. Gidin görüntü &#8594; türü &#8594; 16 bit.</li>
		<li>Eşik görüntü. Gidin görüntü &#8594; ayarlamak &#8594; otomatik eşik.</li>
		<li>Görüntü ölçüm ölçek uzunluğu atama görüntüde bir hattı yatırım Getirisi ölçek çubuğu üzerinden doğrudan çizerek ayarlayın. Ölçek çubuğu ayarlamak için'gidin analiz &#8594; ölçeği ayarla. Piksel uzunluğu (örneğin 120 piksel / 50 µm) istenen birim sayısını girdi.</li>
		<li>Sonuç alan ölçmek ve gri değeri demek. Gidin analiz &#8594; ayarla ölçümleri ve ölçüm tıklatarak toplamak analiz &#8594; ölçü birimi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+cancer+cell-derived+extracellular+matrix+in+tumor+progression.">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li><li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+biology+and+implications+for+treatment.">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38 (2006).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression.">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11 (2008).</li><li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix:+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer.">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li><li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin,+fibronectin,+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer:+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression.">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li><li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment.">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li><li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling.">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li><li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin:+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting.">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li><li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+tumor/stromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients.">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li><li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts.">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li><li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers.">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li><li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development.">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li><li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+reproductive+status/stages+in+mice.">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2009).</li><li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation.">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li><li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands.">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).</li><li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation.">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li><li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland.">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Gazetede, olduğu gibi fare meme dokuları duktal morfoloji ve ECM ifade aşağı akım histolojik analizler için yalıtmak için bir teknik anlatmıştık. Duktal Morfoloji analizleri ile ilgili olarak, duktal mimarisi lekeli histolojik kesitler kapalı tabanlı hızlı incelenmesi bu yöntemi sağlar. Duktal analizleri diğer yöntemleri görselleştirme duktal ağacının etkinleştirmek için boya teknik olarak zor ve zaman alıcı olabilir yöntemleri enjeksiyonlari güveniyor.
Meme Kans...

Meme kanseri doku fibrozu1,2,3,4önemli bir derecesi ile karakterizedir. ECM anılacaktır, bu cep varlık derecelerde tüm dokularda bulunur ve öncelikle fibriler ve fibriler sigara collagens, elastin ve glikoproteinlerin yanı sıra çoğu çeşitli sinyal molekülleri karmaşık bir meshwork oluşur Bu matris münzevi. Homeostatik koşullar altında ifade ve ECM bozulma sıkı kontrol. 5 sırasında meme tumorigenesis, ECM ifade ve yıkımı dengesi bozulur. Bu nedenle, meme tümörleri bol ECM proteinler collagens, fibronektin ve tenascin-C diğerleri arasında gibi hızlı bildirilmiştir. 6 meme tümör ilerleme, metastaz ve terapi direnç1,3, tanıtmak için matris crosslinking artan şekillerinin yanı sıra bu proteinlerin anormal ifade belgelenmiş oldu 4,7,8,9.
ECM kompozisyon ve duktal Morfoloji değerlendirmek için olduğu gibi meme dokuları yalıtım gerçekleştirildi. Burada, caveolin-1 için kadın nulliparous fareler eksik kullanılan, agresif için bağlı bir integral membran protein meme tümör imza10,11,12ve kadın nulliparous B6 kontrol fareler. Histolojik işleme ve bu dokularda boyama duktal Morfoloji karakterizasyonu birlikte birkaç ECM proteinler tanımlaması izin.
Genel olarak, Bütün, olduğu gibi meme dokuları yalıtım araştırmacılar eksojen veya endojen faktörler cevaben meydana gelen doku çapında morfolojik veya hücresel değişiklikleri öğrenmek için fırsat verir. Dezavantaj-in teknik analizleri 2 Boyut (2D) doku bölümleri karşı karmaşık morfolojisi duktal ağacının daha kapsamlı bir resmi verim bir 3D perspektif ile ilişkilidir. Meme bezi gerçekleşecek hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimleri karmaşıklığı göz önüne alındığında, Bütün, bozulmamış bezlerinin yalıtım verimli duktal morfoloji ve protein ifade çeşitli bölgelerde meme antikorundan analiz etmek için avantajlıdır bezi.

<table><tbody><tr><td>Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Camera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>Olympus</td><td>cellSens Entry software</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Surgical Micro Loupes</td><td>Rose Micro Solutions</td><td></td><td>Magnification at researcher&#039;s preference</td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Staining Rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Staining Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Size appropriate for tissue</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, alcoholic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, Reagent Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>suitable for molecular biology</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Mounting Medium</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt&#039;s Mounting Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin antibody</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin-C antibody</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Smooth Muscle Actin antibody</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of intact, whole mouse mammary glands for analysis of extracellular matrix expression and gland morphology

#4 karın meme dokuları kadın nulliparous fareler gelen ECM ifade ve duktal mimari değerlendirmek için hasat için bu yordamı amacı oldu. Burada, deri altında küçük bir cep Mayo makas, subkutan doku içinde bezlerinin ayrılması temel karın zarını izin kullanılarak oluşturulmuş. Görselleştirme bezlerinin 3.5 kullanımı ile destekli x-R cerrahi mikro büyüteçler. Pelt ters ve geri izin olduğu gibi meme yağ yastıkları tanımlaması tutturulmuş. Her #4 karın bezlerinin açık açık neşter bıçak yanal subkutan katman ve bezleri arasında kaydırarak disseke. Hemen hasat sonrası, bezleri % 10 tarafsız tampon formalin sonraki doku işleme için yerleştirildi. Eksizyon tüm bezinin avantajlı çünkü öncelikle duktal epitel hücreleri ve kısmi biyopsi cevapsız microenvironmental diğer hücresel nüfus arasındaki önemli doku çapında etkileşimler hariç riskini ortadan kaldırır. Bir metodoloji analizleri duktal morfogenez ve protein ifade bezinin ayrı yerlere sınırlayan sabit dokular seri bölümleri kullanımını dezavantajıdır. Bu nedenle, 3 boyutlu (3D) duktal mimarisi ve protein ifadesindeki değişiklikleri kolayca elde edilebilecek değil. Genel olarak, teknik gelişim duktal morfogenez veya meme kanseri gibi aşağı akım araştırmalar için bütün olduğu gibi fare meme dokuları gerektiren çalışmalar için geçerlidir.

Dişi fareler meme dokuları 5 çift var. Özellikle, servikal bezleri (1), iki çift göğüs bezlerinin (#2 ve #3), karın bezleri (#4) bir çift ve kasık bezleri (#5) (Resim 1A) 1 Çift bir çift vardır. Burada, kolayca tanımlanabilir oldukları gibi #4 bezleri izole. İkisi arasında ayrım zor olduğu gibi bazı durumlarda, #4 ve #5 bezleri birlikte izole edildi. Sağlam #4 karın yalıtmak için meme dokuları, pelt tutturulmuş ve d...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology at JoVE.com

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Sağlam, Bütün fare meme dokuları yalıtım hücre dışı matriks ifade ve bezi Morfoloji analizi için

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K Görüntüleme.  University of Nebraska Medical Center. Burada, hücre dışı Matriks (ECM) ifade ve duktal Morfoloji araştırmak için meme dokuları bütün, olduğu gibi fare yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Fare #4 karın bezleri tarafsız tampon formalin içinde sabit kesitli ve ECM proteinler için immünhistokimya kullanarak lekeli 8-10 hafta eski kadın nulliparous fareler, elde.

Video: Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and genetic alterations. Mammary gland whole mounts are an inexpensive method to capture the progression of morphological changes that may arise after exposure. However, in later life, when abnormalities are more prone to develop, sole reliance on this one method may not always provide enough information to make a proper diagnosis of the abnormality. Historically, in chemical test guideline studies, a single mammary gland is removed at necropsy and prepared as a hematoxylin and eosin (H&#38;E)-stained section. The incorporation of contralateral mammary whole-mount collection and analysis decreases the likelihood of a false-negative assessment. Evaluation of the whole mount is limited by the presence of one or two entire mammary glands on a slide, and in some cases, the abnormalities observed in the whole mount are not uniformly represented in the H&#38;E section.&#160; The goal of this study was to develop a protocol for converting coverslipped mammary whole mounts to H&#38;E-stained sections so that lesions that would otherwise have been missed or that are difficult to diagnose can be identified. Here, we detail a method to produce a high-quality, paraffin-embedded H&#38;E section from a mammary gland that was initially prepared as a whole mount. In comparison to a tissue that was intentionally prepared for H&#38;E sectioning, the whole mount requires additional preparation for tissue removal and processing. However, this method is considered inexpensive, as it requires common lab reagents and little additional time. As a result, this method can provide invaluable information on how chemical and environmental exposures alter normal mammary development, as well as display changes that occur because of genetic modifications.

We developed a method to successfully remove, process, section, and stain, for histopathological evaluation, mammary tissue that had originally been fixed on slides as whole mounts. This method may promote the collection and evaluation of mammary gland whole mounts in reproductive and developmental test guideline studies.

Lezyon Tanımlaması için Meme Bandı Bütün Dağılımları

Normal mammary gland development may be altered by exposure to environmental toxicants and pharmaceutical products, excessive exposure to hormones, and ...

Kanser Araştırmaları

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

Tıp

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cell (NAMEC)-derived extracellular vesicles can be isolated from NAMEC medium via differential ultracentrifugation. Based on their density, EVs can be purified via ultracentrifugation at 110,000 x g. The EV preparation from ultracentrifugation can be further separated using a continuous density gradient to prevent contamination with soluble proteins. The purified EVs can then be further evaluated using nanoparticle-tracking analysis, which measures the size and number of vesicles in the preparation. The extracellular vesicles with a size ranging from 50 to 150 nm are exosomes. The NAMEC-derived EVs/exosomes can be ingested by mammary epithelial cells, which can be measured by flow cytometry and confocal microscopy. Some mammary stem cell properties (e.g., mammary gland-forming ability) can be transferred from the stem-like NAMECs to mammary epithelial cells via the NAMEC-derived EVs/exosomes. Isolated primary EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells cannot form mammary glands after being transplanted into mouse fat pads, while EpCAMlo/CD49fhi basal mammary epithelial cells form mammary glands after transplantation. Uptake of NAMEC-derived EVs/exosomes by EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells allows them to generate mammary glands after being transplanted into fat pads. The EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells transfer mammary gland-forming ability to EpCAMhi/CD49flo luminal mammary epithelial cells.

This protocol describes methods for purifying, quantitating, and characterizing extracellular vesicles (EVs)/exosomes from non-adherent/mesenchymal mammary epithelial cells and for using them to transfer mammary gland-forming ability to luminal mammary epithelial cells. EVs/exosomes derived from stem-like mammary epithelial cells can transfer this cell property to cells that ingest the EVs/exosomes.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Gelişim Biyolojisi

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Generating and Imaging Mouse and Human Epithelial Organoids from Normal and Tumor Mammary Tissue Without Passaging

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after propagation from primary tissue or stem cells. This method of organoid generation forgoes single-cell differentiation through multiple passages and instead uses differential centrifugation to isolate mammary epithelial organoids from mechanically and enzymatically dissociated tissues. This protocol provides a streamlined technique for rapidly producing small and large epithelial organoids from both mouse and human mammary tissue in addition to techniques for organoid embedding in collagen and basement extracellular matrix. Furthermore, instructions for in-gel fixation and immunofluorescent staining are provided for the purpose of visualizing organoid morphology and density. These methodologies are suitable for myriad downstream analyses, such as co-culturing with immune cells and ex vivo metastasis modeling via collagen invasion assay. These analyses serve to better elucidate cell-cell behavior and create a more complete understanding of interactions within the tumor microenvironment.

This protocol discusses an approach for generating epithelial organoids from primary normal and tumor mammary tissue through differential centrifugation. Furthermore, instructions are included for three-dimensional culturing as well as immunofluorescent imaging of embedded organoids.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Organoids are a reliable method for modeling organ tissue due to their self-organizing properties and retention of function and architecture after ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Fare Modeller Meme Bezi Geliştirme ve Fonksiyon Değerlendirme

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biyoloji

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Fare Trakea gelen Bazal Hücre ve Submukozal Bezi Kanal Hücre İzolasyonu

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...