הדור של הפסיפס של חלב באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית

השיטה שלנו היא משמעותית כי זה מאפשר לחוקרים לבודד ולתפעל סוגי תאים שונים לחקירה של תרומות שושלת בודדות שלהם לצורת רקמות ותפקוד. טכניקה זו היא שיטה עדינה ויעילה להפרדת סוגי תאים וכתוצאה מכך, שלמות התאים נשמרת לתרבות תלת-מימדית. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם על מערכות אחרות כדי לבודד תאים שאין להם סמנים ביולוגיים מאופיינים היטב.

כדי לקצור את מספר שתיים, שלוש, ארבע וחמש בלוטות החלב מעכבר נקבה בן 10 עד 14 שבועות, תחילה לעשות חתך של סנטימטר אחד בקו האמצע בין שני hindlimbs. מאריכים את החתך עד הצוואר ובצעו חתכים בצד הדרך הקטנים מחתך קו האמצע לכיוון הגפיים. לאחר מכן למתוח את העור לימד לפני הבטחת אותו עם סיכה בכל צד של החיה.

באמצעות מדפים, לאסוף את בלוטות הלימפה מן בלוטות מספר ארבע. כדי להסיר את בלוטות החלב, להשתמש במספריים חדים לחתוך תחת כל אזור של רקמה, הצבת הרקמות ב 50 מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס DMEM-F12 בתוספת 5%FBS ואנטיביוטיקה אנטימיקוטית כפי שהם שנקטפו. כאשר כל הרקמות נאספו, קוצצים את הבלוטות עד שהחתיכות יכולות להתאים בקלות דרך קצה פיפטה מיליליטר אחד המסובב את הצלחת לפי הצורך, כך שכל הרקמות טחון באופן שווה.

לאחר מכן מעבירים את השברים בשלושה מיליליטר של מדיום עיכול לתוך באר אחת של צלחת הידבקות נמוכה של שש בארות במשך 14 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, בעדינות pipette את הרקמות 10 פעמים עם micropipette מיליליטר אחד ולהעביר את שברי הרקמה לתוך צינור 15 מיליליטר. לאסוף את הרקמה על ידי צנטריפוגה ולתלות את גלולה בחמישה מיליליטר של DPBS טרי.

לסנן את ההשעיה דרך מסננת ניילון 70 מיקרומטר רטוב מראש, לשטוף את הצינור במסננת ארבע פעמים עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס DMEM-F12 לכל לשטוף. כדי לשחרר את שברי הרקמה, החזק את לשונית מסננת עם אצבעות כפפות ולהפוך את מסננת מעל צלחת תרבות רקמת 60 מילימטר. מעבירים ארבעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה דרך החלק התחתון של המסננת ובודקים במהירות את המנה לתאים בודדים, טיפות שומן ורקמות מזהמים תחת מיקרוסקופ הפוך.

לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות כדי לאפשר שברי הרקמה לדבוק בצלחת וליצור שברים bilayered. כדי להפריד את תאי myoepithelial מתאים אפיתל luminal, לשטוף את המנה עם מיליליטר אחד של DPBS לפני הוספת מיליליטר אחד של טרי 0.5% טריים טריים טריים-EDTA לתאים. נטר בזהירות את העיכול תחת מיקרוסקופ הפוך.

השכבה החיצונית של תאי myoepithelial יתחיל להתנתק בתוך שלוש עד שש דקות. כאשר התאים myoepithelial התנתקו, להעביר את העל-טבעי לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל שני מיליליטר של 10%FBS ב DPBS. מבלי להפריע לתאי האפיתל הזוהרים, יש לשטוף בעדינות את המנה בשני מיליליטר של DPBS לפני הוספת מיליליטר טרי של טריפסין-EDTA לתאים הנותרים.

לאחר שבע עד 15 דקות, מרווה את התגובה האנזימטית עם שני מיליליטר של 10%FBS ב- PBS ומעבירים את התאים לצינור חדש של 15 מיליליטר. זה קריטי כדי לפקח מקרוב על התאים במהלך טריפסינציה דיפרנציאלית ולא לעכל יתר על מדי את התאים. כאשר שני השברים נאספו, צנטריפוגה התאים כדי להסיר כל שאריות ניתוק reagent ו resuspend כדורי ב 250 microliters של אמצעי תחזוקה לכל צינור.

לאחר הספירה, לדלל כל אוכלוסיית תא ל 1.2 פעמים 10 לארבעת התאים לכל ריכוז גם בינוני תחזוקה טרי. הוסיפו 90 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית של 50% ב-DMEM-F12 ללא פנול אדום לכל באר של מגלשה קאמרית בת שמונה בארות. כאשר כל הבארות היו מצופות, לחזק את שכבת הבסיס באינקובטור תרבות התא במשך 30 דקות.

במהלך פילמור זה, לאסוף את שברי התא על ידי צנטריפוגה resuspend כל אוכלוסייה ב 100 microliters של 10% מטריצה חוץ תאית ב 90% צמיחה בינונית ל הבאר. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל מתלה תא לכל באר ואפשרו לתרבויות המשותף להסתפק ב-20 דקות באינקובטור של תרבות התאים. בסוף האינקובציה, מוסיפים בזהירות 100 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לאורך הצד של כל קיר תא ומחזירים את המגלשה לאנקובטור תרבות התא.

תמונה התאים כל 24 שעות כדי לעקוב אחר הצמיחה שלהם בעדינות לחדש את מדיום הצמיחה כל יומיים עד שלושה ימים. כדי לתקן את האורגנואידים לכשל חיסוני, בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, שאפו בזהירות את המדיום מכל שקופית כדי להיות בתמונה ולשטוף כל באר עם 200 מיקרוליטרים של DPBS ל הבאר. תקן את האורגנואידים עם 200 מיקרוליטרים של ארבע מעלות צלזיוס paraformaldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני טיפול אורגנואידים עם 200 microliters של 0.2% גליצין ב DPBS לאורך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בסוף הדגירה, לחלחל האורגנואידים עם 0.25% טריטון X-100 ב DPBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו חסימה של כריכה לא ספציפית עם 5% נסיוב חמור או הנסיוב המתאים התואם את המין של הנוגדן המשני ב- DPBS במשך שעה אחת עם נדנדה. ואז לתייג את התאים עם 125 עד 200 microliters של הנוגדנים העיקריים המתאימים של עניין בסרום חמור 1% ב DPBS לילה בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה. למחרת בבוקר, לשטוף כל טוב פעמיים עם 200 microliters של DPBS בתוספת טריטון X-100 לפני תיוג האורגנואידים עם פלואורסצנטיות המתאימה מצומד נוגדנים משניים במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה מוגנת מפני אור.

לאחר מכן לשטוף כל טוב פעמיים עם DPBS טרי בתוספת טריטון X-100 כפי שהוכח תמונה האורגנואידים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר 24 שעות של דגירה, שברי אפיתל מטוהרים דבקו בתחתית צלחת התרבות ויוצרים מבנים שטוחים דמויי פנקייק עם שכבה החיצונית של תאי מיופיתל המקיפים שכבה פנימית של תאי אפיתל זוהרים. טיפול טריפסין מנתק באופן דיפרנציאלי את התאים עם התאים myoepithelial מתנתק הראשון ומופיע כתאים מעוגלים בהירים כי להקיף את הליבה של תאי אפיתל זוהר קובואידיים הנותרים.

הטוהר הכולל של שני תאי התא הוא כ-90% כפי שהוערך על ידי ביטוי הקרטין-14 וה-E-cadherin בתוך שתי האוכלוסיות. לאחר 10 ימים של תרבות במטריצה חוץ-תאית של 10% על בסיס מטריצה חוץ-תאית של 50% כפי שהוכח, האורגנואידים של תאי האפיתל האורטליאליים myoepithelial יצרו מבנים מסועפים גדולים עם לומן מפותח. ההתמדה ביום החמישי עם התוספת למדיום alveologenesis גורמת להיווצרות אורגנואידים גדולים יותר המכילים חלב מסועפים יותר.

חשוב לזכור לשטוף את מסננת בזהירות בעת איסוף האפיתל כדי להבטיח כי אין מזהמים סטרומה. כדי לבצע שאילתה על השינויים בביטוי גנים, החוקרים יכולים לאסוף RNA מהאיברים על ידי שחרורם מהמטריצה החוץ-תאית באמצעות פתרון התאוששות. Paraformaldehyde נחשב מסוכן וחוקרים צריכים להשתמש בציוד מגן אישי ולעבוד בתוך מכסה המנוע אדים בעת שימוש זה reagent.