ברצוננו להודות יעל נב עוזי על הסיוע בהכנת חומרים ניסיוניים. אנו אסירי תודה גם Wittler בטינה, ג'יימס מאן עבור סקירה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי ה-NSF מענקים DBI-1049341 MCB-1143813.

1-הכנת 1 x בינוני Murashige ו- Skoog (MS) <ol><li>g 4.31 להוסיף של MS תערובת הבסיס, 10 גרם סוכרוז ו 0.5 גר' 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic חומצה (MES) גביע המכיל 0.8 לליטר מים מזוקקים ומערבבים להתמוסס. בדוק והתאם pH ל 5.7 באמצעות 1 מ' אשלגן הידרוקסידי (KOH). להוסיף מים מזוקקים כדי ליצור 1 ל'</li>
	<li>לחלק את המדיה שני בקבוקים 1 ליטר, 500 מ ל כל אחד. להוסיף 5 גר' אגר כל בקבוק. חופשיות המכסה.</li>
	<li>אוטוקלב כעשרים דקות ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi עם פס מגנטי מערבבים בבקבוק.</li>
	<li>לאחר autoclaving, למקם את הבקבוקים על צלחת מערבבים במהירות נמוכה, ולאפשר ' המדיום MS להתקרר עד 45-50 ° C (עד הבקבוק יכולים להיות מוחזקים בידיים חשופות).</li>
	<li>החל משלב זה, לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים ב תא למינארי. להוסיף 500 µL Gamborg &#39; s ויטמין לפתרון כל בקבוק ומערבבים המדיום MS לפיזור אחיד הפתרון ויטמין.</li>
	<li>שופכים מספיק מדיה לתוך צלחות לכסות בערך מחצית העומק של הצלחת-</li>
	<li>לאפשר את הצלחות להתקרר בטמפרטורת החדר במשך כ 1 h לאפשר את אגר שבמהלכו. 
	הערה: אם הצלחות לא אמור לשמש מיד, לעטוף אותם פלסטיק ולאחסן ב 4 מעלות (טמפרטורת המקרר). צלחות מקורה, תיבות או צינורות עם אגר הקרושה ניתן לאחסן מספר שבועות ב 4 ° C בכלי אטום לאוויר.</li>
</ol> 2. עיקור וסירוס של תודרנית זרעים עם אקונומיקה <ol><li>הכן MS צלחות על פי סעיף 1 של הפרוטוקול. אוטוקלב 100 מ של מים מזוקקים באותו זמן כמו התקשורת MS. השתמש באפשרות זו בהמשך כמו שטיפה במים וכדי לסייע להשעות את הזרעים כדי לסייע יופיצ. 
	הערה: אם רצונך בכך, 0.8% אגר תערובת (w/v) (לדוגמא phytagar) יכול להיות גם בלוק בשלב זה. התערובת אגר הרבה מכדי מים מזוקקים במהלך ציפוי (שלב הנגן 2.5.3.). צמיגות נוספת של התערובת אגר מקלה על שטח זרעים על צלחת או צמח בשורות במידת הצורך.</li>
	<li>הכנת 50% (v/v) מלבין פתרון כדי לשמש לחיטוי הזרעים. כדי לדלל אקונומיקה, להוסיף 100 מ של אקונומיקה 100 מ של מים מזוקקים. להוסיף 50 µL של דטרגנט Tween 20 הפתרון מלבין. 
	הערה: פתרון אקונומיקה מוכן ניתן לאחסן עד חודש, כל עוד הוא רק נפתח בתנאים סטריליים.</li>
	<li>Aliquot 100 זרעים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL-</li>
	<li>לחטא את הזרעים באמצעות פתרון 50% מלבין.
	<ol><li>בתוך תא למינארי, להוסיף 500 µL של הפתרון 50% מלבין הצינור microcentrifuge המכיל את הזרעים. הקש על החלק התחתון של צינור כדי להשעות את הזרעים בפתרון מלבין. 
		הערה: לחלופין, מסובב או שאכר פלטפורמה של עשוי לשמש כדי לשמור את הזרעים מושעה.</li>
	</ol></li> <li>לשטוף את הפתרון אקונומיקה מהצינור.
	<ol><li>אחרי 10 דקות, להסיר הפתרון אקונומיקה באמצעות פיפטה או של העצמות מצויד טיפ פיפטה בקצה הצינור microcentrifuge.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של מים מזוקקים סטריליים כדי ברכבת התחתית. סגור את הצינור, היפוך לערבב. לאפשר זרעים להתיישב לתחתית הצינור. לאחר זרעים התיישבו לתחתית הצינור בזהירות להסיר את הפתרון אקונומיקה על-ידי pipetting. חזור על פעולה זו שטיפה תהליך 6 פעמים.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של מים מזוקקים בלוק צינור כדי להשעות את הזרעים.</li>
	</ol></li> <li>צלחת הזרעים סטיריליים על צלחות MS-
	<ol><li>בתוך תא למינארי, תווית התחתית לצלחת MS עם השם מניות לבין התאריך הנוכחי.</li>
		<li>יוצקים את הזרעים מהצינור microcentrifuge לצלחת MS. להפיץ את הזרעים סביב הצלחת MS באמצעות לולאה לחסן סטרילי, לשימוש יחיד או טיפ פיפטה סטרילי. 
		הערה: אם זרעים נזרע בשורות, פיפטה עם טיפ 200 µL ניתן בנפרד למקם זרעים בעמדות הרצוי. כדי לשפר את הזרימה של זרעים, הסוף של קצה פיפטה שניתן לחיתוך על ידי 3-5 מ מ באמצעות מספריים. כל הזרעים במקומה או אשכולות של זרעים ואז ניתן למקם או מופרדים באמצעות לולאה לחסן חד-פעמי סטרילי.</li>
		<li>למקם את הצלחת MS-חוסר של למינארי עם המכסה עצומות למחצה. לאפשר את המים העודפים מתמוססות מהצלחת MS-</li>
		<li>למקם את המכסה על הצלחת MS. חותם הצלחת MS על ידי ליפוף לצלחת עם נייר נקבובי כירורגי קלטת (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
	</ol></li></ol> 3. עיקור וסירוס של תודרנית זרע עם גז כלור <ol><li>הכן MS צלחות על פי סעיף 1 של הפרוטוקול. אוטוקלב 100 מ של מים מזוקקים באותו זמן כמו התקשורת MS; זה ישמש אחר כך לעזור להשעות את הזרעים כדי לסייע יופיצ. 
	הערה: אם רצונך בכך, 0.8% אגר תערובת (w/v) (לדוגמא phytagar) יכול להיות גם בלוק בשלב זה. התערובת אגר הרבה מכדי מים מזוקקים במהלך ציפוי (שלב 3.6.2.). צמיגות נוספת של התערובת אגר מקלה על שטח זרעים על צלחת או צמח בשורות במידת הצורך.</li>
	<li>לפני שמתחילים עיקור, לחשב את הסכומים של אקונומיקה, חומצת מלח (HCl) הדרושה להפקת גז כלור.
	<ol><li>לחשב הסכום של HCl הדרוש כדי לייצר את Cl 6.1% 2 נדרש עבור עיקור.</li>
		<li>להשתמש בנוסחה הבאה: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> עם mL 7,000 בתור אמצעי האחסון של המיכל עיקור וסירוס ו- 6.1% Cl 2; הנפח של HCl מחושבת להיות 3 מ ל. 
		הערה: גיליון אלקטרוני מתוכנת לבצע את החישוב עבור אמצעי אחסון שונים של מיכל ו- % Cl 2 מסופק משלימה טבלה 1-</li>
	</ol></li> <li>Aliquot 100 זרעים לתוך צינור microcentrifuge 0.5 mL. לסגור את כובעי כל מבחנה, למקם את הבקבוקונים מתלה פלסטיק ו להפריש. 
	הערה: זרעים ניתן לאחסן לתקופה ממושכת של זמן בשלב זה כל עוד הם מאוחסנים בתנאים נאותים. תנאי אחסון ניתן למצוא בסעיף 3.3.2 של הפרוטוקול על ידי ריברו ועמיתיו 4. ניתן להשתמש בתבנית 96-ובכן צלחת-</li>
	<li>להכין את החומרים הדרושים לביצוע סטריליזציה גז כלור.
	<ol><li>להשיג מלבין ו- HCl של מיקומי אחסון שלהם.</li>
		<li>לחתוך רצועה של פרפין גדול סרט (ראה את הטבלה של חומרים) לשימוש בשלב 3.5.3. לאטום את המיכל עיקור.</li>
		<li>למקם את מיכל פלסטיק עם מכסה בו העיקור יתקיים בתוך ברדס fume. לפתוח את הפקקים על כל הבקבוקונים זרע ומניחים המתלה כולו זרע בתוך המיכל פלסטיק.</li>
	</ol></li> <li>לבצע עיקור גז כלור בטמפרטורת החדר. 
	התראה: לעבוד עם אקונומיקה וחומצה בנפרד. אין להשאיר גם בקבוק uncapped כדי להפחית את הסיכון של נוזלים. השתמש המתאים ציוד מגן אישי (עיקרון השוויון הפוליטי) כולל כפפות חלוק מעבדה. אם אקונומיקה או חומצה מתיז על כפפות, לשנות כפפות לפני טיפול חומרים אחרים. תמיד להסיר כפפות בשכונה fume במקרה של זיהום אקונומיקה או חומצה.
	<ol><li>מקום גביע 250 מ ל בתוך המיכל ולהוסיף 100 מ של אקונומיקה. 
		הערה: התגובה בין HCl אקונומיקה מחייבת לפחות 22 כרכים עודף של אקונומיקה. התגובה לצרוך HCl, אקונומיקה על ידי שחרור גז 2 Cl עם נתרן כלורי (NaCl) ומים כמו תוצרי לוואי. שימוש עודף גדול של אקונומיקה מאפשר את הצריכה של d HCl נוספיםuring תקופת אוורור, אשר מפחית את כמות נתרן ביקרבונט (NaHCO 3) הדרושים כדי לנטרל את הפתרון עבור סילוק. 
		התראה: כשהספל צריך להיות לפחות פעמיים נוזלי הנפח הכולל של אקונומיקה + HCl. פעולה זו מונעת פרצים בריחה כשהספל במהלך השלב הבא, אשר יכול לגרום נזק זרעים, אקונומיקה בגדים, או לצרוב עור חשוף.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של HCl כשהספל המכיל האקונומיקה. 
		התראה: התגובה הראשונית יהיה לייצר בועות, במיוחד בריכוזים גז גבוהה יותר מ- 6.1%. חלוק מעבדה עם שרוולים ארוכים הכרחי בשלב זה.</li>
		<li>לסגור את המיכל עיקור, לאטום אותו עם סרט פרפין מיד.</li>
		<li>לפקח על המכולה עיקור במהלך הזמן עיקור כדי להבטיח הצטברות גזים; ההצטברות של כלור גז צריך להיות גלוי כמו אובך הצהוב חלש בתוך המיכל. 
		התראה: בדוק מעת לעת המכולה עיקור כדי להבטיח כי הלחץ בתוך יש לא unseated את המכסה או שעוות פרפין הסרט. אם המכסה הגיע ב־2005 נכללו קאו יאי או הסרט פרפין השתחררה, סגור את המכסה, בזהירות לעטוף את המיכל עם רובד נוסף של הסרט פרפין.</li>
		<li>לאחר 1 h-עיקור התקופה, פתח את המיכל על-ידי הסרת פרפין הסרט ופתיחה המכסה על פינה אחת. לאפשר המכולה לפרוק עבור 3 שעות להשלים את התגובה ולחסל הגז-</li>
		<li>לסגור את הפקקים כל microcentrifuge הצינורות בארון זרע. 
		הערה: זרעים סטיריליים ניתן לאחסן עד הזמן של ציפוי כל עוד הן מאוחסנות במצב יבש.</li>
		<li>להסיר את המדף זרע ולמקם אותו תא למינארי.</li>
		<li>לנטרל תגובת גז כלור <ol><li>להוסיף 1.5 גר' אבקת 3 NaHCO לאט כדי כשהספל המכיל את הפתרון מלבין/HCl ומערבבים עם מוט זכוכית לפזר את NaHCO 3 פתרון. המשך להוסיף NaHCO 3 עד בועות הגז פחמן דו-חמצני (CO 2) פסקו להרכיב. 
			התראה: להוסיף לאט כדי למנוע פרצים. השתמש עיקרון השוויון הפוליטי המתאים כולל כפפות חלוק מעבדה.</li>
			<li>לבדוק את רמת ה-pH של התמיסה באמצעות חומציות או מד pH. להוסיף NaHCO נוספים 3 אם הצורך עד ה-pH של הפתרון הוא נייטרלי (pH 7.0). בשלב זה הפתרון יכול להיות הוסר מהשכונה fume והשמדתי בהתאם להנחיות סילוק ישים כל. 
			התראה: אם כל הריח שם לב במהלך סילוק ואז הפתרון מיד יש להחזיר למכסה fume.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>צלחת הזרעים סטיריליים על צלחות MS-
	<ol><li>בתוך תא למינארי, תווית התחתית לצלחת MS עם השם מניות לבין התאריך הנוכחי.</li>
		<li>µL 500 להוסיף מים מזוקקים סטיריליים כל שפופרת microcentrifuge להשעות את הזרעים. יוצקים זרעים על הצלחת MS ולהפיץ את הזרעים אחיד סביב הצלחת באמצעות לולאה לחסן סטרילי, לשימוש יחיד או טיפ פיפטה סטרילי.</li>
		<li>למקם את הצלחת MS-חוסר של למינארי עם המכסה עצומות למחצה. לאפשר את המים העודפים מתמוססות מהצלחת MS-</li>
		<li>למקם את המכסה על הצלחת MS. לאטום את הצלחת MS על ידי ליפוף לצלחת עם נייר הדבקה נקבובי.</li>
	</ol></li></ol> 4. הצמיחה של תודרנית על צלחות MS <ol><li>מקום הצלחות עם המכסה על גבי שלושה ימים ב- 4 הלעפה תרוטרפמט והלחות הסביבתית. 
	הערה: תהליך זה נקרא ריבוד ומשמש לסינכרון מלכתחילה נביטה של זרעים בודדים.</li>
	<li>להעביר את הצלחות לסביבה צמיחה.
	Photoperiod <ol><li>שמור על טמפרטורה ב 23 ° C, עוצמת האור-120-150 µmol/m 2 s 16 h אור / כהה 8 שעות. מקום צלחות שטוח לתוך הסביבה לגדול עם המכסה למעלה אז השורשים לגדול לתוך המדיום.</li>
	</ol></li> <li>לתת השתילים על צלחות לגדול במשך 8 ימים. 
	הערה: תקופת הצמיחה 8 היום מאפשר מאוחר. הנבטת הזרעים לנבוט. צלחות can be הבקיע מוקדם יותר מאשר 8 ימים אם יש כל הזרעים מונבטים.</li>
	<li>ציון שיעור הנביטה.
	<ol><li>רשומה מספר זרעים זה יש מונבטים, כי יש לא מונבטים. לחשב שיעור נביטה על-ידי חלוקת מספר הזרעים מונבטים על ידי המספר הכולל של זרעים על הצלחת. 
		הערה: נביטה נספרת כאשר radicle חזתה מחוץ קליפת הזרע פסיגי הזרע שני גלויים.</li>
		<li>גם לספור את מספר זרעים מושפעת עובש כדי לקבוע את היעילות של התנאים עיקור.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. M., Stepanova, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+transformation+with+large+bacterial+artificial+chromosomes.">Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes.</a> Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).</li><li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins.">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291 (2013).</li><li>Podar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth+and+cultivation.">Plant growth and cultivation.</a> Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+agar-plate+method+for+studying+root+growth+and+response+of+Arabidopsis+thaliana.">An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana.</a> Sci Rep. 3, 1273 (2013).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16, (1998).</li><li>Cederholm, H. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sensitivities+to+phosphate+deprivation+suggest+that+RGF+peptides+play+disparate+roles+in+Arabidopsis+thaliana+root+development.">Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development.</a> New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).</li><li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation.">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li><li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis.">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li><li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+14-amino+acid+CLV3,+CLE19,+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway.">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li><li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+screening+for+insertional+mutants.">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li><li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome.">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li><li>L&#243;pez-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds.">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאשר גדל תודרנית זרעים במדיה סטרילי, יש להחיל צורה כלשהי של עיקור. הן אקונומיקה כלור גז עיקור וטיפולי התוצאה דומה נביטה עובש וקצב הצמיחה עיכוב. גם שיטת עיקור גורם הפחתה משמעותית בשיעור נביטה של זרעים עם פוטנציאל; גבוהה נביטה עם זאת, אקונומיקה עיקור מומלצת עבור קווים עם פוטנציאל נביטה נמוכה יותר (20-70%), בשל הקטן, אף על פי שאינו משמעותי, שיפור בשיעור הנביטה לעומת גז עיקור (איור 3 א).
לחיטוי תודרנית זרעים עם אקונומיקה ריכוזים בין 40-100% עבור עד 10 דקות מספק אחוזי נביטה משביע רצון, דיכוי עובש יעיל. למרות אקונומיקה ריכוזים פחות מ- 40% לספק עיקור נאותה רוב הזרע הרבה, באמצעות ריכוז של 40% או גבוה יותר ערבויות עיקור יעיל של הרבה זרע מזוהם בכבדות אפילו. זה חשוב לא יעלה על 10 דקות של עיקור בעת שימוש אקונומיקה ריכוזים שווה או גבוה מ- 80% כדי למנוע תמותה גבוהה זרע מולדים בהתפתחות נבט.
טיפול תודרנית זרעים עם ריכוזי גז כלור 6.1% או 16.5% לתוצאות 1 h בנביטה גבוה המחירים ולמניעת עובש נאותה. ריכוז גז כלור נמוך (2.1%) יכול לשמש בהצלחה על ידי הגדלת משך עיקור ל-3 שעות.
כאשר כמה שורות צריך לעקר, מומלץ נוזלי עיקור בפתרון של אקונומיקה 50% למשך 10 דקות. עבור מספרים גדולים של קווים, עיקור גז עם ריכוז גז של 6.1% עבור 1 h הוא אפשרות טובה יותר מאחר קווים רבים יכולים להיות מעוקר בקלות ובמהירות עם פחות מניפולציה.
התוצאות שלנו לספק תנאים סטנדרטיים לחיטוי מספר גדול של זרעי אחרים שונים והן את הזרעים עם פוטנציאל נמוך נביטה. המגבלה היחידה של טכניקות אלה עיקור היא כי הם לא ניתן להחיל את הזרעים הנביטה המחירים פחות מ- 20% עקב תמותה נרחבת זרע. שיטות אלטרנטיביות, כגון sonication17, כדי להגדיל את שיעור הנביטה בהיעדרו של עיקור עשוי להועיל במקרים אלה.

תודרנית לבנה (תודרנית) הוא אורגניזם מודל עיקרי במחקר בסיסי ויישומי צמח ביולוגיה1,2,3. ואילו תנאים סטנדרטיים של תודרנית הצמיחה כבר וותיקה4, ההשפעה של עיקור זרע על הכדאיות זרע לא בקפדנות נבדק. מדיה מלאים צלחות או בתיבות משמש באופן שגרתי כדי להקל על צמיחה של תודרנית השתילים עבור יישומים ניסויים רבים, כגון זיהוי של homozygous קטלני המוטציות באוכלוסיה הפרדת, תצפית של פנוטיפים לירות ושורש -מוקדם שלבים, בידוד של רקמות ללא הפתוגן, אוסף של כמויות גדולות של שתיל רקמות, מבחר transformants או צמחים עמידים לתרופות והערכה של נביטה1,2,3,4 . זרעים שנקטפו הצמחים גדלו בחממה או תא לגידול נגועים מדי פעם עם מיקרואורגניזמים ואבק. הצמיחה של תודרנית שתילים על סוגים שונים של מדיה סטרילי מחייבת עיקור זרע מוקדמת כדי להסיר חיידקים מזהמים כגון פטריות וחיידקים המצויים על פני הזרע. השימוש של משטר עיקור של זרע יעיל הוא קריטי עבור איזון של נביטה גבוה, זיהום מזערי צימוח נמרץ.
שתי השיטות הנפוצות ביותר בשימוש עבור עיקור זרע תודרנית מבוססים על מסחרי אקונומיקה (נוזל-פאזי), גז כימי (אדי-שלב). הליכים שונים יש כבר מועסקים שני עיקור נוזלי-שלב1,4,5,6,7,8,9 , עיקור 10 ו אדי-פאזי של תודרנית זרעים8,10,11,12,13,14,15 ,16. עם זאת, בעוד נהלים אלה הוכחו כיעילים שישותו של אחרים שימוש עיקור זרע, ניתוח מפורט של ההשפעה של טיפולים שונים עיקור על הזרעים של אחרים שונה לא דווחה. לכן, אופטימיזציה של הליכים אלה עיקור נדרש להגדרת תנאי שבו עיקור יעיל בשילוב עם קצב נביטה גבוה.
תודרנית ביולוגי משאב מרכז (לסלילת) ממוקם באופן ייחודי כדי a) לבדוק הזרע הכדאיות של מגוון אחרים שונים את אוסף b) ולנצל נהלי בקרת איכות מוחל באופן פנימי, בתגובה למשוב על נביטת הזרעים. המטרות של הניסויים שהוצגו כאן היו לברר את ההשפעות של עיקור בשיטות שונות על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית. נהלים עיקור ממוטבת והתוצאה בשערי נביטת הזרעים גבוהה תוך שמירה על הפתוגן מינימלי זיהום מוצגים עבור עיקור גז אקונומיקה והן כלור.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

תודרנית לבנה שתילים (תודרנית) בדרך כלל צריכים להיות מבוגרים במדיה סטרילי. פעולה זו דורשת זרע מוקדמת עיקור כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים בהווה על פני הזרע. כיום, זרעים תודרנית סטריליים באמצעות שתי שיטות עיקור ברורים בתנאים שונים במקצת בין מעבדות, אינה אחידה, שנרשמים עיקור יעיל באופן חלקי בלבד או בתמותה זרע מוגזמת. רוב שיטות אלה אינן גם להרחבה בקלות למספר רב של זרע שורות מגוונים אחרים. טכנולוגיות לניתוח תפוקה גבוהה של תודרנית ממשיכים להתרבות, טכניקות מתוקננת לחיטוי מספרים גדולים של זרעי אחרים שונים הופכים חיוניים עבור ניצוח סוגים אלה של ניסויים. התגובה של מספר קווי תודרנית שתי טכניקות שונות עיקור הוערך בהתבסס על שיעור הנביטה הזרע ואת רמת זיהום זרע ועם חיידקים פתוגנים אחרים. הטיפולים כללו ריכוזים שונים של לחיטוי סוכנים ושעות של חשיפה, בשילוב כדי לקבוע תנאים אופטימליים תודרנית זרע עיקור. הוכנו נהלים מיטביים עבור שתי שיטות שונות עיקור: אקונומיקה (נוזל-פאזי), גז כלור (Cl2) (אדי-שלב), שניהם וכתוצאה מכך שיעורי הנביטה הזרע גבוהה זיהום מיקרוביאלי מינימלי. השירות של פרוטוקולים אלה מצויר באמצעות בדיקה של פראי סוג והן זרעים. מוטנטים עם מגוון של פוטנציאל נביטה. התוצאות שלנו מראים כי זרעים ביעילות לעקר באמצעות כל אחת מהשיטות ללא זרע מופרז התמותה, למרות השפעות מזיקות של עיקור נצפו על זרעים עם נמוך יותר פוטנציאל נביטה אופטימלית. בנוסף, משוואה פותחה כדי לאפשר לחוקרים חלים התנאים עיקור גז כלור מתוקננת אטום מיכלים בגדלים שונים. הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים עיקור זרע קלה, יעילה וזולה עבור מספר גדול של תודרנית קווים.

תודרנית זרעים שנאסף תא בשדה, חממה או צמיחה פתוחה לפעמים שזוהמו על ידי מיקרואורגניזמים שונים כמו פטריות וחיידקים1,4. לפיכך, נובטים זרעי במדיה סטרילי יכול להיות מאתגר במיוחד עקב זיהום של הצלחות, במיוחד כאשר אספקת הזרעים מוגבלת. פרוטוקול ממוטב עבור עיקור גז אקונומיקה והן כלור, תוצאותיה מוצגות להלן, ממזער את הבעיה ושומר את הכדאיות של זרעים הנדרש עבור יישומי תפוקה גבוהה.
ההשפעות של עיקור אקונומיקה על נביטה של זרעים תודרנית Col-0
אקונומיקה היא סוכן הנפוצות ביותר של זרע עיקור של מיני צמחים רבים. ריכוז אופטימלי של הסוכן עיקור וזמן חשיפה משתנה בין המינים. מספר פרוטוקולים יש כבר מועסקים באמצעות אקונומיקה עבור עיקור של תודרנית זרעים1,4,5,6,7,8,9 , 10. ארבע ריכוזים שונים של אקונומיקה עם זמן חשיפה שונות חמש תקופות נבדקו ואת התוצאות מוצגים איור 1. הטיפולים הוחלו על קולומביה פראי-סוג (Col-0) זרעים. השפעת ריכוז אקונומיקה על נביטה של זרעים Col-0 מגוונים תלוי בזמן של עיקור כפי שמגלה על אינטראקציה משמעותית בין ריכוז אקונומיקה לזמן של עיקור (איור 1, P &#60; 0.001. אנובה-השונות).
בניסויים עם עיקור פעמים בין 5 ל 10 דקות, טיפולים עם כל ריכוזי אקונומיקה הביאה באותה מידה נביטה גבוה שיעור של Col-0 זרעים (איור 1). המחירים נביטה גבוה נצפו גם עבור מלבין ביתי ריכוזים של 40% ו 50% עבור כל הזמן עיקור. טיפולים עם 80% ל-100% מלבין עבור תקופות יותר מ 10 דקות הביא משמעותי להקטין את שיעור הנביטה לעומת הפעמים טבילה קצרה יותר (P &#60; 0.01, ANOVA). יתר על כן, כי הן 80% ל-100% מלבין טיפולים במשך 20 דקות, נביטה משמעותית ירדו בהשוואה המתאימים 40% וטיפולי 50% מלבין (P &#60; 0.001, ANOVA).
זרעים להציג רמות שונות של הלבנת מצמקים בעת שימוש ריכוזים אקונומיקה גבוהה למשך 15 דקות או יותר. בנוסף גבוה יחסית (עד 32%) התמותה זרעים, זרעים מונבטים מעוקר ב תנאים אלה לעיתים קרובות הראה צמיחה פגמים, משתקפת כישלון של פסיגי הזרע, hypocotyls להתפתח, להאריך, וכתוצאה מכך מעצר התפתחותית. רוב הטיפולים (14 מתוך 20) היו לגמרי בחינם, וכתוצאה מכך הכוללת כייר רמת הממוצע של ± 0.21% 0.003 (טבלה 1).
טיפול עם אקונומיקה 50% וזמן הספיגה של 10 דקות נבחר המשטר עיקור הכי טוב כי זה משולב אחוז נביטה גבוה עם עיכוב טוב של פתוגן משטח צמיחה. טיפול זה נבחר כדי לבחון את ההשפעה של עיקור אקונומיקה על קווים מוטנטים שונים כפי שמתואר להלן.
ההשפעות של עיקור גז כלור על נביטה של זרעים Col-0
כדי למטב את תנאי סטריליזציה גז כלור, שימשו שלושה ריכוזים שונים של גז כלור כדי לחטא Col-0 זרעים במשך שתי תקופות זמן (טבלה 2). ריכוז הגז היה מחושב בהתבסס על הנפח של HCl מרוכזת, נפח המיכל עיקור באמצעות המשוואה הבאה:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
המשוואה הזו נגזר באמצעות החוק גז אידאלי בהנחה 12.3 M HCl, לטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס, לחץ אטמוספירי של 101.3 kPa.
השפעת ריכוז גז כלור על נביטה של זרעים Col-0 הוצגה לסמוך על הזמן של עיקור כמצוין על-ידי האינטראקציה משמעותי בין הזמן ואת הגורמים ריכוז (איור 2 א, P &#60; 0.01, ANOVA) . ריכוז גז כלור היה אין השפעה משמעותית על נביטה של זרעים Col-0 נתון 1 h עיקור. עם הפעם עיקור, כל ריכוזי גז כימי בדרגה דומה רמות גבוהות של נביטה, מעל 85% (P &#62; 0.05, ANOVA). מצד שני, עיקור h באורך 3, גרמו ירידה משמעותית אחוזי נביטה של הריכוז הגבוה ביותר של גז כלור, לעומת שני ריכוזים גז נמוכה יותר (P &#60; 0.05, ANOVA). תוצאות אלו מצביעות על טיפולים של תודרנית זרעים עם כל אחד ריכוזי גז כלור שנבדקו עבור 1 h, או עם ריכוזי גזים מתחת 16.5% עבור 3 h, יעילים באותה מידה בשימור הזרע הכדאיות מאז נביטה המחירים היו תמיד גדול יותר מ- 82%. עם זאת, לחיטוי זרעים h 3 בגז 16.5% היה מזיק נביטת הזרעים.
השכיחות של עובש גם הייתה תלויה גז ריכוז וזמן החשיפה. צמיחה של עובש היה עכבות ביעילות את ריכוזים גבוהים יחסית של 6.1% ל- 16.5% גז כלור לטיפול h באורך 1 ועם כל ריכוזי גז עבור 3 h (איור 2B).
בהתבסס על תוצאות אלו, טיפול עם ריכוז גז של 6.1% עבור h 1 (טבלה 2) נבחר התנאי עיקור אדי-פאזי הטוב ביותר כדי לבחון את ההשפעה של גז עיקור בשורות מוטנטים שונים, מאז זה משולב (קצב נביטה גבוה 85%) עם רמה נמוכה מאוד של זיהום עובש (0.02%).
ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על זרעים בעלי פוטנציאל שונה נביטה
ניתוח סטטיסטי הראה כי התגובה נביטה שיטות העיקור הייתה תלויה הפוטנציאל נביטה של הקווים (איור 3A, P &#60; 0.01, ANOVA). עיקור גז לא מלבין ולא כלור מופחת קצב נביטה של זרעים עם פוטנציאל גבוה נביטה (קבוצות 4 ו- 5). הטיפול לא היתה השפעה על קצב נמוך כבר נביטה של הקבוצה עם הנביטה הנמוךפוטנציאל (קבוצה 1). לעומת זאת, עיקור גז כלור הביא לירידה משמעותית בכ-12-18% (P &#60; 0.01, ANOVA) ב מלכתחילה נביטה של זרעים עם פוטנציאל נביטה ביניים (קבוצות 2 ו- 3). עיקור אקונומיקה גם ירד שיעור הנביטה ב 13% של קבוצה 2, אבל זה לא פחת שיעור הנביטה של קבוצה 3. למרות שהיה הבדל משמעותי בשיעור נביטה בין אקונומיקה כלור גז טיפולים בשום קבוצה נביטה (איור 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), זרעים עיקור באמצעות אקונומיקה היה מעט גבוה יותר שיעור הנביטה יותר גז-עיקור זרעים בכל קבוצות נביטה.
טיפולים עיקור שינו באופן משמעותי (P &#60; 0.001, ANOVA) האחוזים של זרעים מושפעת עובש (איור 3B). שניהם כלור גז ומלבין עיקור, גרמו פחות צמיחה של עובש (P &#60; 0.05, ANOVA) בהשוואה ללא עיקור. לא היה הבדל ברמת עובש זוהה בין עיקור גז ומלבין בשום קבוצה (איור 3B, P &#62; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
איור 1: השפעת ריכוז אקונומיקה וזמן עיקור על נביטה של זרעים תודרנית Col-0- ערכים הם אמצעי ± SD המתקבל 5 שכפולי עצמאית של הניסוי. * מציין הבדלים משמעותיים ביחס 5 דקות לספוג את משך עבור טווח ריכוזים אקונומיקה (P &#60; 0.01, ANOVA). #מציין הבדלים משמעותיים בין 80%-100% מלבין ריכוזי יחסית 40% ל- 50% במשך 20 דקות פרק זמן (P &#60; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
איור 2: השפעות של כלור גז ריכוז וזמן עיקור על זרעים תודרנית Col-0- (א) שיעור הנביטה ורמת עובש (B). קווי שגיאה מייצגים ± באמצעים SD המתקבל ביולוגי 5 ו 5 שכפולי טכני של הניסוי. אמצעים שאינם שותפים מכתב הם שונים באופן משמעותי (P &#60; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
איור 3: ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על זרעים בעלי פוטנציאל שונה נביטה. (א) שיעור הנביטה ורמת עובש (B). הקווים חוליה T-DNA 100 היו מסווגים חמש קבוצות על פי הנביטה שלהם פוטנציאל הגדיר את קצב נביטה, בהעדר כל סוכן עיקור. הקבוצות מבוסס על קצב נביטה היו כדלקמן: קבוצה 1 (0-20%), קבוצה 2 (21-50%), קבוצה 3 (51-70%), קבוצה 4 (71-90%) ו קבוצה 5 (91-100%). הקווים נבחרו באופן אקראי, שלהם נביטה הפוטנציאליים אינם תלויים גנוטיפ. ערכים הם אמצעי ± SD המתקבל שלושה שכפולי עצמאית של הניסוי. אותיות ("a", "ab", "c", וכו ') מעל כל ערך מציינים את קבוצות סטטיסטיות של קטגוריה פירושו. אמצעים שאינם שותפים מכתב הם שונים באופן משמעותי (P &#60; 0.05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">עיקור הזמן (דקות)</td>
			<td colspan="4">ריכוז אקונומיקה (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0.19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: כייר רמת מחוטא-אקונומיקה Col-0 זרעים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>אקונומיקה</td>
			<td>HCl</td>
			<td>זמן</td>
			<td rowspan="2">% גז כלור (מול Cl2/mol גז סה)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2: כלור (Cl2) גז עיקור טיפולים על קולומביה פראי-סוג הזרעים באמצעות מיכל 7 L.
משלימה טבלה 1: גיליון אלקטרוני מתוכנת לבצע את החישוב עבור אמצעי אחסון שונים של מיכל ו- % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית גדל על מדיה סטרילי. עיקור ממוטבת פרוטוקולים פותחו כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים תוך מתן זרע משביע רצון הישרדות.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

standardized-method-for-high-throughput-sterilization-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

29.2K Views.  The Ohio State University. מטרת המחקר הייתה לקבוע את ההשפעות של אקונומיקה, כלור גז עיקור על נביטת הזרעים של אחרים טווח של תודרנית גדל על מדיה סטרילי. עיקור ממוטבת פרוטוקולים פותחו כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים מזהמים תוך מתן זרע משביע רצון הישרדות.

Video: Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...