Name: adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory at JoVE.com

המחבר תודה סוזן ויטפילד הכנה של דמויות, קמיל מרטין, הילארי Samagaio לקבלת סיוע בחלק מהניסויים.

<ol>
	<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li><li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+factors+influencing+survival+and+growth+of+human+pathogens+on+raw+fruit+and+vegetables.">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li><li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens.">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li><li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbe-plant+interactions:+principles+and+mechanisms.">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li><li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants:+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis.">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li><li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases:+Principles,+Mechanisms+of+Action,+and+Future+Prospects.">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li><li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts,+leaves+and+fruits.">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li><li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants.">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li><li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157:H7+to+alfalfa,+human+epithelial+cells,+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures.">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysaccharides+cellulose,+poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine,+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157:H7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells.">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li><li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens.">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Rhizobiaceae+to+plant+cells.">Attachment of Rhizobiaceae to plant cells.</a> The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+medium+promotes+the+attachment+of+Agrobacterium+tumefaciens.strain+NT1+to+carrot+cells.">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li><li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots.">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li><li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts.">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel,+attB,+attD,+and+attR+mutants.">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li><li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium.">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , (2012).</li><li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157:H7+on+postharvest+lettuce.">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li><li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157:H7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li><li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium.">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , (2012).</li><li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+seed+and+root+exudate+sugars:+composition,+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization.">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Revised+Medium+for+Rapid+Growth+and+Bio+Assays+with+Tobacco+Tissue+Cultures.">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li><li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria.">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157:H7+on+alfalfa+sprouts.">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li><li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lognormal+distribution+of+bacterial+populations+in+the+rhizosphere.">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces.">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252 (2014).</li><li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells.">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li><li>Tomlinson, A. D., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+regulation+of+polar+surface+attachment+in+Agrobacterium+tumefaciens.">Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).</li><li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces.">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li><li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157:H7:+quantification+and+internal+localization+in+roots.">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li><li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens.">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li><li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157:H7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions.">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li><li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157:H7+survival+on+field+lettuce.">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li><li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157:H7+on+alfalfa+seeds.">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li></ol>

המחבר מצהיר שיש לה אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

חשוב להיות מודעים כל של משטחים שעליהם חיידקים יכולים לדבוק במהלך הניסוי. לפיכך חיידקים המסוגלים מחייב זכוכית יכול לזלזל אם קיימא תא ספירת נעשים באמצעות צינורות זכוכית ופיפטות. אם הצמחים גדלים ב אגר או אדמה וחלק אגר או אדמה נשאר על הצמחים ואז החיידק עלול להיקשר לחומר adhering, ולא את הצמחים. מצד שני, נטילת משטח המפעל, במיוחד במקרה של שורשים, יכול להסיר את ציפוי פני שטח טבעי כגון ריריות ובכך לשנות את התוצאות של בדיקות הדבקות.
חשוב להיות בטוחים כי החיידק מוסיפים את הדגירה יישארו בחיים במהלך הניסוי. לכן ספירת קיימא של חיידקים חינם, כמו גם המצורף באופן שגרתי לבצעו. כמה טיפולים או מוטציות חיידקי עלולה להפחית את קצב התפתחות חיידקים או באמת לגרום למותו של שבריר של האוכלוסייה חיידקי. חיידקים מתים וחיים לא ניתן להבדיל במיקרוסקופ אלא אם כתמי מיוחדים משמשים. יש ערכת הכתם שימושי עבור חיידקים חיים/מתים אשר תלויה החרגה של צבעי מן החיידקים החיים. אם קיימת אוכלוסייה מעורבת של חיידקים ואז ספירת קיימא המינים של ריבית זאת, עשוי להיות השיטה הקלה ביותר לקבוע אם הדגירה הביאה מוות חיידקי.
קומפוזיציה בינונית השפעה הישרדות חיידקי וצמיחה. שורש תפליט וחומרים שוחרר מן הפצע ולחתוך אתרים תספק המצע לתמוך צנוע התפתחות חיידקים. פוספט, חנקן ו ברזל נוטים להיות הגבלת בתנאים אלו. קטיונים דו ערכיים כגון סידן ומגנזיום עשויים להשפיע אדהזיה. בחלק מהמקרים מקור פחמן יכול להשפיע על הדבקה. pH גם בענייני. באופן כללי ה-pH של rhizosphere הוא בין 5.5 ו- 6.5.
יש להיזהר בשימוש חיידקים שמסומנים עמידות לאנטיביוטיקה. האנטיביוטיקה הנפוצים ביותר הם ריפאמפיצין וחומצה nalidixic. עמידות לאנטיביוטיקה אלה בדרך כלל עקב מוטציות בגנים כרומוזומלית (RNA פולימראז ו gyrase, בהתאמה), ולכן לא בקלות ניתן להעביר לאמץ עוד בתקופת הדגירה. סוג זה של התנגדות גם לא תוצאה של השפלה או שינוי של האנטיביוטיקה. סימון חיידקים עם סמן גנטי בעקיצות פלסמיד אינו מומלץ אלא אם לא ניתן להעביר את פלסמיד לחיידקים אחרים. ההתנגדות לאנטיביוטיקה אסור עקב השינוי השפלה או כימית של האנטיביוטיקה כמו חיידקים רגישים לאנטיביוטיקה יוכלו לגדול על צלחות אנטיביוטי אם הם ממוקמים קרוב חיידקים עמידים.
בשיטות המתוארות במאמר זה שימושיים עבור גודל מדגם קטן ו/או ניסויים שבו הדגימות צריך להיות כלול (לדוגמה, בניסויים המערבים פתוגנים אנושי). במדגמים גדולים (מעל 100 גרם של חומר או צמחים יותר מ-50) בשיטות אחרות או שינוי דרסטי של שיטות אלה יהיה צורך10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. הנוכחות של מספרים גדולים של מיקרואורגניזמים חוץ המין נחקר יכול גם להוות בעיות משמעותיות. פתרונות אפשריים כוללים את השימוש חיידקים מסומן עם חלבון פלואורסצנטי או עמידות לאנטיביוטיקה, כפי שתואר בשלבים 6.1.2 ו- 7.3. עם זאת, כאשר החיידק עניין הם אנשים נדירים בקרב אוכלוסיה גדולה של מיקרואורגניזמים אחרים סמנים אלה לא ניתן מספיק כדי לאפשר הערכה ברורה וחד משמעית של המספרים של החיידק נחקר.
כל אחת מהשיטות המתוארות כאן הן שיטות מעבדה מבוסס. שינויים מזעריים יידרש ללימודי החממה. שינויים נוספים צפויים להיות הנדרשים ללימודי שדה שבו חד-תאיים, חרקים, בעלי חיים אחרים טריפה והאקלים וריאציה לסבך את מתן תנאים שהוגדרו עבור הניסויים. בעתיד שיטות אלה יורחב לכלול פעולת הגומלין בין שני אורגניזמים על פני הצמח.

המדד של איגוד חיידקי לשתול משטחים הפך חשוב בשלושה מצבים שונים. המצב הראשון הוא הבחינה של השידור של האדם פתוגנים צמח משטחים1,2,3. המטרה היא למנוע מחייב חיידקי או כדי להסיר או להרוג חיידקים מאוגד ובכך להפחית את העברת מחלות על-ידי חומר צמחי. המצב השני הוא הבחינה של הכריכה של פתוגנים צמח לשתול משטחים4. שוב המטרה היא למנוע מחייב או כדי להסיר או להרוג חיידקים מאוגד ובכך להפחית את המחלה. המצב השלישי הוא הבחינה של הכריכה של חיידקים סימביוטיים או צמחים-צמיחה-קידום5,6. . המטרה היא לקדם בקטריאלי מחייב ובכך להגדיל ובריאות הצמח יבול התשואות.
הטכניקות למדידת איגוד חיידקי לשתול משטחים המתוארות במאמר זה הם זול וקל יחסית לביצוע. שהדרישות היחידות במיקרוסקופ הינם חומרים הנמצאים בדרך כלל בדיקות מעבדה. עבור כמה טכניקות sonicator אמבט שימושית. מהטכניקות שתוארו מיועדים מחייב ניסויים מתבצעות בעזרת גודל מדגם קטן יחסית. מדידות של איגוד מיוצרים במעבדה, למרות שזה עשוי להיות אפשרי לשנות חלק משיטות אלה לשימוש בחממה או בשטח.
טכניקות אלה שימשו למדידת איגוד חיידקי שורשים, נבטים, עלים לחתוך לחתוך פירות, עגבניות שרי שלמות מעבדה7,8,9,10,11, 12,13,14,15. הם גם שימשו כדי למדוד שורש התיישבות צמחים גדלים בקרקע או חול מעבדה16. הטכניקות שימשו עם מינים חיידקיים רבים כולל Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli סלמונלה enterica, ו Pseudomonas fluorescens. ניתן למצוא תיאור שימושי של שיטות להערכת את האינטראקציה של א tumefaciens עם משטחי מורטון, Fuqua (2012)17. בכל המקרים גודל מדגם מעורבים היו קטנים, בדרך כלל פחות מ- 25-50 צמחים. מהטכניקות שתוארו מתאימים לשימוש עם פתוגנים אנושי אשר צריך להישמר כלולות במהלך הניסויים.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

כתב יד זה מתאר שיטה למדידת מחייב חיידקי משטחי המפעל axenic במיקרוסקופ אור, באמצעות ספירת קיימא. צמח החומרים המשמשים כוללים שורשים, נבטים, עלים, לחתוך פירות. בשיטות המתוארות הן זולות, קל וזה מתאים גודל מדגם קטן. איגוד נמדד במעבדה, ניתן להשתמש במגוון מדיה הדגירה ותנאים. ההשפעה של מעכבי יכול להיקבע. גם יכול להיות מוערך מצבים לקדם ומעכבות מחייב. במקרים מסוימים זה אפשרי להבחין אם התנאים השונים לשנות מחייב בראש ובראשונה בגלל השפעתם על המפעל או על החיידקים.

א tumefaciens והצנרות שורש משטחים. על מנת לקבוע אם ייצור חיידקי תאית ממלאת תפקיד שורש קולוניזציה, ההשפעות של מוטציות חיידקי אשר למנוע תאית סינתזה היו בחן16. מהטכניקות שתוארו בשלבים 1.3 ו- 7.1 שימשו. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים סטריליים. כאשר השורשים היו כ 2 ס מ היו טבול השעיה של חיידקים5 10 לכל mL, נטועים בקרקע מפוסטר במיכלים. הצמחים היו בוגרים למשך 14 ימים ב- 25 ° C על 12 שעות אור/12 h מחזור כהה. לאחר הצביעו פעמים הצמחים הוסרו מן המכולות. השורשים היו נשטפים, sonicated ב sonicator אמבט להסרת חיידקים מאוגד. מספרים חיידקי היו נחושים באמצעות ספירת קיימא. איור 2 מציג את ההשפעה של שתי מוטציות תאית-חיסור שונים על היכולת של החיידקים לישוב עגבניות שורשים. למרות סטיות תקן של כמה מדידות גבוה ככל 0.9 כניסה10 (בעיה נפוצה עם סוג זה של מדידה) צמצום באיגוד המוטציות תאית-חיסור עולה בבירור, נוכל להסיק כי ייצור חיידקי תאית מסייעת החיידקים הקולוניזציה של עגבניות שורשים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> איור 2 : שורש קולוניזציה לפי סוג הפרוע תאית-חיסור מוטציות של tumefaciens א. יומן10 המספר הכולל של חיידקים לכל ס מ אורך הבסיס התאוששה עגבניות שורשים מחוסן עם פראי סוג tumefaciens א זן C58, מוטציות תאית-מינוס C58:1 ו- C58:A60. המספרים המוצגים הם אמצעי לפחות ארבעה ניסויים נפרדים. ברים מצביעים על סטיות תקן של האמצעים. שורשים חוסנו בטבילת אותם בהשעיה של חיידקים5 10 לכל mL במשך דקה אחת. הצמחים גדלו במיכלים, החיידקים באופן רופף חסיד הוסרו על ידי שטיפת השורשים ב שטיפת מאגר בקבוקון זכוכית. חיידקים חסיד הדוק הוסרו באמצעות sonicator אמבטיה וכתוצאה מכך התליה מצופה כדי לקבוע תא קיימא נחשב16. איור זה השתנה מ Matthysse ו McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
תפקידו של exopolysaccharides באיגוד של e. coli , חיידקים אחרים כדי נבטי אלפלפה נבדק. כמה התפרצויות של מחלת diarrheal עקב e. coli O157:H7 יש כבר לייחס נבטי אלפלפה מזוהמים. איגוד של פראי-סוג חיידקים, מוטציות לא מצליח לעשות exopolysaccharides שונות נמדדה באמצעות השיטות המתוארות שלבים 1.1, 5.1 ו- 7.2. נבטי אלפלפה היו פני מחוטא, מונבטים ליום אחד במים סטריליים 25 ° c בחושך. נבטים 4 עם מעילים הזרע מצורף הונחו במנות פלסטיק סטרילית, המכיל 5 מ ל מים. חיידקים גדל מרק לוריא נוספו ריכוז סופי של 5 x 103 לכל mL. נבטים חוסנו היו הדגירה 25 ° c בחושך למשך 3 ימים. הנבטים היו לשטוף פעמיים ב 5 מ ל מים סטריליים בקבוקון על-ידי היפוך נמרצת, הומוגני ב שטיפת המאגר באמצעות מהמגן זכוכית מבוססת על מנוע של טפלון. ניסויים קודמים באמצעות חיידקים שמסומנים פלסמיד נושא גן ה-GFP הראה אין בקטריות למביטה למרות משטח חיידקים נצפו בקלות. התוצאות מוצגות בטבלה1. נבדקו שני זנים של החיידק O157:H7. לשני הזנים הופיעה הייצור של poly-β-1, 6-גלוקורונית acid(PGA) כדי לבצע את התרומה הגדולה הכריכה של פתוגניים החיידק לשתול משטחים. שטיפת המעי הגס חומצה גם מילא תפקיד משמעותי באיגוד. בזמן הירידה מחייב בתאית-חיסור מוטציות היה משמעותי לא היה גדול כמו זה עבור שני סוכרים אחרים.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">ההשפעות של מוטציות בגנים הפקה Exopolysaccharide על כריכה של אי O157:H7 קולי כדי נבטים ומעילים זרע פתוח</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">זן חיידקי</td>
			<td rowspan="2">מוטציה או גנוטיפ (רלוונטי פנוטיפ)</td>
			<td colspan="2">יומן מספר10 של חיידקים מאוגד לכל נבט או זרע המעיל</td>
		</tr>
<tr>
<td>נבטי אלפלפהb
</td>
			<td>מעילים זרע פתוח</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>אף אחד (סוג הפרוע)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (תאית-מינוס)</td>
			<td>2.9 ± 0.7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (חומצה חוקן-מינוס)</td>
			<td>1.8 ± 0.7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>P 8624</td>
			<td>
pgaC (PGA-מינוס)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>± 1.0 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>אף אחד (סוג הפרוע)</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (תאית-מינוס)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (חומצה חוקן-מינוס)</td>
			<td>3.9 ± 0.5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-מינוס)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0.7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">זאת אומרת ± סטיית תקן של מינימום של שלוש מדידות של המספר (יומן10) של חיידקים מאוגד לאחר 3 ימים.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b נבטים נשטפו לפני המדידה.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c שונה באופן מהותי מן הסוג הפרוע: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">שונה באופן משמעותי מן הסוג בר d: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ההשפעות של מוטציות בגנים הפקה exopolysaccharide על הכריכה של E. coli O157:H7 כדי נבטים. על מנת לקבוע את התפקיד של exopolysaccharides השונות ליפופוליסכריד באיגוד של פתוגניים החיידק זנים O157:H7 כדי נבטי אלפלפה, הכריכה של קבוצת מוטציות נבטים, מעילים זרע פתוח נבדקה באמצעות השיטות תיאר בשלב 6. התוצאות הראו כי פולי-ß-1, 6 -N-acetyl-D-גלוקוזאמין (PGA) שנראה חיוני מחייב נבטים, כי חומצה תאית והן colanic נדרשים עבור איגוד המרבי של e. coli O157. טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.
על מנת לקבוע אם הייצור של PGA הוא מספיק כדי לגרום את איגוד חיידקי לשתול משטחים, פלסמיד (pMM11) נושאת את אופרון משובטים קידוד הגנים הדרושים עבור PGA ייצור הוכנס שני חיידקים שונים אשר לא בדרך כלל תוכל לאגד עגבניות שורשים10. Tumefaciens א A1045 הוא מוטנט של המתח פראי סוג C58 אשר נכשל ביצירת גלוקן מחזורית-β-1, 2, נכשל גם לאגד לשתול משטחים29. Sinorhizobium meliloti 1021 המהווה פקעיות על אספסת נכשל לאגד ללא קטניות כולל עגבניות12. השיטות המתוארות שלבים 1.1, 5.1, 6.3 ו- 7.1 שימשו כדי לקבוע אם היכולת לגרום PGA בדרך כלל מוגברת איגוד חיידקי שורש משטחים. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים סטריליים. שורשים היו חותכים למקטעים 1 ס מ אורך והושמו במים סטריליים, החיידקים חוסנו. ככל ששני המינים האלה של חיידקים גדלים בקצב שונה, איגוד נמדדה בזמנים שונים כדי לאפשר שווה בערך כמויות של התפתחות חיידקים. הנוכחות של pMM11 פלסמיד נגרמת עלייה משמעותית דומה במספר של חיידקים מאוגד של שני מינים (טבלה 2)10. עלייה משמעותית באיגוד נראתה גם במיקרוסקופ אור אך האיגוד היה מאוד שונה אצל שני המינים (איור 3). Tumefaciens א A1045 מאוגדים כמו בודדים חיידקים פני השורש. Meliloti ס מאוגדים באשכולות גדולים שבהם רק אחדים של החיידק היה מחובר ישירות לספריית הבסיס של רוב החיידקים צורפו לחיידקים אחרים. דוגמה זו מראה כי פשוט לנתח את המספרים של חיידקים מאוגדים ללא כולל תצפיות מיקרוסקופיות יכול לתת רושם מטעה של תוצאות ניסוי. למרות שתי השיטות (ספירת קיימא ותצפיות מיקרוסקופיים) להציג שאת pMM11 מוגבר מחייב חיידקי לשורשים עגבניות, סוג הכריכה הנגרמת על ידי הייצור של PGA היה שונה אצל שני המינים חיידקי10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">השפעת pMM11 פלסמיד על איגוד של החיידק לשורשים עגבניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>זן חיידקי</td>
			<td>פלסמיד</td>
			<td>מספר החיידקים מאוגד לכל אורך השורש מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>א tumefaciens A1045
</td>
			<td>אף אחד</td>
			<td>0.25 x3 10 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (וקטורית)</td>
			<td>0.25 x3 10 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (סינתזה PGA)</td>
			<td>10 x 10-3 -± 0.25 x 10-3
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ס meliloti 1021b
</td>
			<td>אף אחד</td>
			<td>אף אחד לא זיהה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (וקטורית)</td>
			<td>אף אחד לא זיהה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (סינתזה PGA)</td>
			<td>50 x 10-3 -± 5 x 10-3
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">איגוד חיידקי, נמדדה לאחר שעתיים</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b איגוד חיידקי היה מדד אחרי 18 שעות</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: השפעת פלסמיד נושא הגנים לסינתזה של PGA על הכריכה של Tumefaciens א A1045, meliloti ס 1021 אל פלחי עגבניה שורש. כדי לבחון את היכולת של פולי-ß-1, 6 -N-acetyl-D-גלוקוזאמין (PGA) כדי לקדם את הכריכה של חיידקים לטעת שורשים, השפעת פלסמיד היוועצות היכולת לגרום PGA (pMM11) על הכריכה של שני זנים של חיידקים הקשורים צמח עגבניות שורשים נבדק. גם זן של חיידקים הראו משמעותי מחייב לשורשים עגבניות בהיעדרו של פלסמיד או בנוכחות של פלסמיד ללא הגנים קידוד PGA סינתזה (pBBR1mcs). התוספת של פלסמיד נושא הגנים סינתזה PGA גדל לכריכה על ידי שני סוגי חיידקים. כי tumefaciens א גדל מהר יותר meliloti ס מחייב נמדדה אחרי שעתיים של דגירה עבור tumefaciens א ואחרי 18 h עבור ס meliloti. הטכניקות בשימוש הם מהמתואר בשלב 7. טבלה זו שונתה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> איור 3 : השפעת pMM11 פלסמיד נושא הגנים ביוסינטזה PGA על הכריכה של A1045 tumefaciens א ו ס meliloti 1021 כדי שערות השורש עגבניות. A1045 tumefaciens א מחייב עגבניות שערות השורש של A), B) A1045 tumefaciens א pMM11, C) meliloti ס 1021, ו- D) pMM11 ס meliloti 1021. למרות העלייה קשירה של שני המינים חיידקי הוא בערך דומה בפרטים של האיגוד כפי שנראה במיקרוסקופ אור מעט שונים. הטכניקות בשימוש הם מהמתואר בשלב 6. איור זה השתנה מ Matthysse, Deora, מישרה, טורס10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
זה לפעמים ניתן להשתמש מחייב הלא-ביולוגיים משטחים לסייע בהבחנה התרומה של החיידקים, של הצמח באינטראקציה מסוימת. Polysaccharide(UPP) unipolar של tumefaciens א הוכח כדי להיות מסוגל לתווך איגוד חיידקי למגוון של שני משטחים ביולוגי, הלא-ביולוגיים30. הסידן נצפתה כדי לעכב את הכריכה של tumefaciens א לשתול משטחים בתיווכו של UPP28. על מנת לקבוע עיכוב על ידי יונים של סידן של איגוד חיידקי לשתול משטחים עקב אפקט על החיידק או על פני הצמח, נבחנה הכריכה של חיידקים חוטי ניילון. הטכניקות מתאר בשלב 8.2 שימשו. זרעי עגבניות, טומטים היו פני מחוטא, מונבטים במים כפי שמתואר בשלב 1. החיידקים היו גדל בינונית מזערי עם סוכרוז, להוסיף עגבניות שורשים או חוטי ניילון-ריכוז סופי של 10 /mL5כפי שמתואר בשלב 5.1. השפעת CaCl הוסיף2 על איגוד חיידקי עגבניות שורשים, חוטי ניילון נבדק במיקרוסקופ. איור 4 מראה של עיכוב דומה של איגוד על ידי סידן באמצעות או משטח רומז ההשפעה של סידן היא בעיקר על חיידקים10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> איור 4 : ההשפעה של סידן על הכריכה של tumefaciens א שערות השורש עגבניות, חוטי ניילון. Tumefaciens א , נדגרה עם שורשים עגבניות (A ו- B) או חוטי ניילון (C ו- D) במשך 24 שעות ביממה ב- 1:10 דילול של מלחי MS ו- 1:20 דילול של AB בינונית מזערי, 0.4% סוכרוז (A ו- C) או ב- 1:10 דילול של מלחי MS ו- 1:20 לדילול בינונית מזערי אלב , 0.4% סוכרוז המכיל 60 מ מ CaCl2 (B ו- D)31. CaCl הוסיף2 עכבות איגוד חיידקי שורשים והן חוטי ניילון רומז כי עיכוב היה בעיקר בשל אפקט על החיידק ולא על השטח המפעל. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory at JoVE.com

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

שיטה קלה עבור מדידה ואפיון הידבקות חיידקים לצמחים, בעיקר שורשים ונבטים, המתוארת במאמר זה.

דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. שיטה קלה עבור מדידה ואפיון הידבקות חיידקים לצמחים, בעיקר שורשים ונבטים, המתוארת במאמר זה.

Video: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioengineering

זיהוי נשאות ריזובקטריאלית על Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

מחבר זרקור: שיפור התיישבות הריזובקטריה על שורשי צמחים לשיפור יעילות הדשן המיקרוביאלי

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily ...

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

דבקותה של חיידקים לשתול משטחים הנמדדים במעבדה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

מדידת התיישבות חיידקים על שורשי Arabidopsis thaliana במצב הידרופוני

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae⁺ STEC Colonization to Host Cells

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear