Name: standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
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Wir möchte Gauri Datta Danke für ihre Hilfe bei der Vorbereitung experimentelle Materialien. Wir sind auch dankbar, Bettina Wittler und James Mann für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die NSF Stipendien DBI-1049341 und MCB-1143813 unterstützt.

1. Vorbereitung von 1 x Medium Murashige und Skoog (MS) <ol><li>hinzufügen 4.31 g MS basale Salzgemisch, 10 g Saccharose und 0,5 g 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES), ein Becher mit 0,8 L destilliertes Wasser und unter Rühren auflösen. Prüfen Sie und einstellen Sie der pH-Wert bis 5,7 mit 1 M Kalilauge (KOH). Hinzufügen von destilliertem Wasser zu 1 L.</li>
	<li>Teilen der Medien in zwei 1-Liter-Flaschen, 500 mL. Jede Flasche 5 g Agar-Agar hinzufügen. Halten Sie den Deckel lose.</li>
	<li>Autoklaven für 20 min bei 121 ° C, 15 Psi mit magnetischen Stir Bar in der Flasche.</li>
	<li>Nach dem Autoklavieren, stellen Sie die Flaschen auf einem Teller Rühren bei niedriger Drehzahl und ermöglichen das MS Medium auf 45-50 ° C abkühlen lassen (bis die Flasche mit bloßen Händen gehalten werden kann).</li>
	<li>Ausgehend von diesem Schritt, alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Haube. Hinzufügen von 500 µL Gamborg &#39; s Vitamin Lösung zu jeder Flasche und rühren Sie das MS-Medium, um die Vitamin-Lösung gleichmäßig zu verteilen.</li>
	<li>Platten, etwa die Hälfte der Tiefe der Platte decken genügend Medien gießen.</li>
	<li>Erlauben die Platten abkühlen bei Raumtemperatur ca. 1 h nach dem Agar zu erstarren lassen. 
	Hinweis: Wenn die Platten nicht sofort verwendet werden, wickeln Sie sie in Kunststoff und bei 4 ° C (Kühlschranktemperatur) zu speichern. Überdachte Platten, Boxen oder Rohre mit erstarrtem Agar können für mehrere Wochen bei 4 ° C in einem luftdichten Behälter gespeichert werden.</li>
</ol> 2. Sterilisation von Arabidopsis Samen mit Bleichmittel <ol><li>bereiten die MS Platten gemäß § 1 des Protokolls. Autoklaven 100 mL destilliertem Wasser zur gleichen Zeit wie der MS-Media. Verwenden Sie diese später als Spülwasser und zu helfen, die Samen zu unterbrechen um Beschichtung unterstützen. 
	Hinweis: Falls gewünscht, kann 0,8 % Agar Mischung (w/V) (z.B. Phytagar) auch autoklaviert in diesem Schritt werden. Die Agar-Mischung für destilliertes Wasser ersetzt werden kann, während der Beschichtung (Schritt 2.5.3.). Die zusätzliche Viskosität der Agar-Mischung macht es einfacher, Raum Samen auf der Platte oder Anlage in Zeilen ggf..</li>
	<li>Bereiten Sie 50 % (V/V) Bleichen Lösung zum Sterilisieren der Samen verwendet werden. Um Bleichmittel zu verdünnen, fügen Sie 100 mL von Bleichmittel zu 100 mL destilliertem Wasser hinzu. Das Bleichmittel-Lösung 50 µL Tween 20 Spülmittel hinzufügen. 
	Hinweis: Vorbereitete Bleichmittel-Lösung kann gelagert werden bis zu einem Monat, solange es nur unter sterilen Bedingungen geöffnet wird.</li>
	<li>Aliquoten 100 Samen zu einem Microcentrifuge Schlauch 1,5 mL.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Samen mit einer 50 %-Chloridlösung.
	<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, 500 µL 50 % Bleichmittel-Lösung hinzufügen den Microcentrifuge Schlauch, die Samen enthält. Tippen Sie auf der Unterseite des Rohres, die Samen in das Bleichmittel-Lösung auszusetzen. 
		Hinweis: Alternativ ein Rotator oder Plattform Shaker verwendet werden die Samen suspendiert halten.</li>
	</ol></li> <li>Spülen Sie das Bleichmittel-Lösung aus der Tube.
	<ol><li>Nach 10 min, entfernen Sie das Bleichmittel-Lösung aus den Microcentrifuge Schlauch mit Hilfe einer Pipette oder eine Absauganlage mit einer Pipettenspitze am Ende ausgestattet.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL sterilem destilliertem Wasser am Rohr. Verschließen Sie das Röhrchen und kehren Sie um zu mischen. Lassen Sie Samen auf den Boden des Röhrchens abrechnen. Entfernen Sie Samen auf den Boden des Röhrchens niedergelassen haben, sorgfältig das Bleichmittel-Lösung durch pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang Spülprozess 6mal.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL autoklaviert destilliertem Wasser am Rohr, die Samen auszusetzen.</li>
	</ol></li> <li>Platte die sterilisierten Samen auf MS Platten.
	<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, beschriften Sie die Unterseite der Platte mit dem Namen und dem aktuellen Datum MS.</li>
		<li>Gießen Sie die Samen aus den Microcentrifuge Schlauch auf die MS-Platte. Verbreiten Sie die Samen um die MS-Platte mit einer sterilen, Einweg-Impfkeimen Schleife oder einer sterilen Pipettenspitze. 
		Hinweis: Wenn Samen sind in Reihen gesät werden, eine Pipette mit 200 µL Spitze lässt sich individuell Samen in die gewünschten Positionen zu platzieren. Um den Fluss der Samen zu verbessern, kann zum Jahresende die Pipettenspitze von 3-5 mm mit einer Schere abgeschnitten werden. Eine unangebrachte Samen oder Cluster von Samen können dann neu positioniert werden oder getrennt, mit einer sterilen Einweg-Impfkeimen Schleife.</li>
		<li>Legen Sie die MS-Platte auf der Rückseite des die Laminar-Flow-Haube mit dem Deckel halb geschlossen. Das überschüssige Wasser von der MS-Platte verdunsten lassen.</li>
		<li>Setzen Sie den Deckel auf der MS-Platte. Siegel die MS-Platte durch das Einwickeln der Platte mit mikroporösen Papier chirurgische tape (siehe die Tabelle der Werkstoffe).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilisation von Arabidopsis Saatgut mit Chlorgas <ol><li>bereiten die MS Platten gemäß § 1 des Protokolls. Autoklaven 100 mL destilliertem Wasser zur gleichen Zeit wie der MS-Media; Dies wird später verwendet, um dazu beitragen, die Samen zur Beschichtung Unterstützung auszusetzen. 
	Hinweis: Falls gewünscht, kann 0,8 % Agar Mischung (w/V) (z.B. Phytagar) auch autoklaviert in diesem Schritt werden. Die Agar-Mischung für destilliertes Wasser ersetzt werden kann, während der Beschichtung (Schritt 3.6.2.). Die zusätzliche Viskosität der Agar-Mischung macht es einfacher, Raum Samen auf der Platte oder Anlage in Zeilen ggf..</li>
	<li>Vor Beginn der Sterilisation, berechnen die Mengen an Bleichmittel und Salzsäure (HCl) erforderlich, um produzieren Chlorgas.
	<ol><li>Berechnen Sie die Menge an HCl benötigt, um die 6,1 % Cl 2 erforderlich für die Sterilisation produzieren.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgende Formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> mit 7.000 mL als das Volumen des Behälters Sterilisation und 6,1 % Cl 2; errechnet sich das Volumen der HCl zu 3 mL. 
		Hinweis: Eine Tabelle, die für die Durchführung der Berechnung für verschiedene Volumina der Container und % Cl 2 programmiert als ergänzende Tabelle1 vorgesehen ist.</li>
	</ol></li> <li>Aliquoten 100 Samen in 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Schließen Sie die Kappen für jedes Fläschchen, legen Sie die Fläschchen in einem Kunststoff-Rack und beiseite stellen. 
	Hinweis: Samen können für längere Zeit an dieser Stelle gespeichert werden, solange sie in einem ordnungsgemäßen Zustand befinden. Lagerbedingungen finden Sie in Abschnitt 3.3.2 des Protokolls von Rivero und Kollegen 4. 96-Well-Plattenformat kann auch verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Materialien notwendig, Chlor-Gas-Sterilisation durchzuführen.
	<ol><li>ihre Speicherorte Bleichmittel und HCl einzuholen.</li>
		<li>Schnitt ein Streifen von großen Paraffin film (siehe die Tabelle der Materialien), im Schritt 3.5.3 verwenden., Sterilisation Containers zu versiegeln.</li>
		<li>Legen Sie die Kunststoff-Behälter mit Deckel, in dem die Sterilisation in einer Dampfhaube stattfinden wird. Die Obergrenzen für die Saatgut-Fläschchen öffnen und legen Sie das gesamte Saatgut Rack innerhalb der Kunststoffbehälter.</li>
	</ol></li> <li>Chlor-Gas-Sterilisation bei Raumtemperatur durchführen. 
	Achtung: Arbeiten Sie mit Bleichmittel und Säure getrennt. Lassen Sie sich nicht entweder Flasche verschlossen, um das Risiko von Leckagen. Verwenden Sie geeignetsten persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Handschuhe und einen Laborkittel. Wenn entweder Bleichmittel oder Säure auf Handschuhe spritzt, ändern Sie Handschuhe vor dem Umgang mit anderen Materialien. Entfernen Sie immer Handschuhe in der Dunstabzugshaube bei Bleichmittel oder Säure Kontamination.
	<ol><li>Eine 250 mL-Becherglas im Inneren des Behälters und 100 mL Bleichmittel. 
		Hinweis: Die Reaktion zwischen HCl und Bleichmittel erfordert mindestens 22 Bänden Übermaß an Bleichmittel. Die Reaktion wird die HCl zu konsumieren und bleichen durch die Freigabe von Cl 2 Gas mit Natriumchlorid (NaCl) und Wasser als Nebenprodukte. Mit einem großen Überschuss von Bleichmittel ermöglicht den Verbrauch von zusätzlichen HCl dährend der Entlüftung Periode, die verringert die Menge an Natriumbicarbonat (Nahco3 3) benötigt, um die Lösung für die Entsorgung neutralisieren. 
		Vorsicht: Der Becher ist mindestens zweimal das flüssige Gesamtvolumen des Bleiche + HCl. Dies verhindert Spritzer Flucht das Becherglas während der nächste Schritt, die Samen beschädigen, Kleidung bleichen oder exponierten Haut verbrennen können.</li>
		<li>Verleihen den Becher mit der Bleiche 3 mL HCl. 
		Achtung: Die erste Reaktion entstehen Bläschen, vor allem bei Gaskonzentrationen 6,1 % höher. Ein lang-sleeved Kittel ist für diesen Schritt notwendig.</li>
		<li>Schließen die Sterilisation-Container und verschließen Sie diese sofort mit Paraffin Film.</li>
		<li>Überwachung des Sterilisation Containers während der Sterilisation Zeit Gas Anhäufung sicherzustellen, die Anhäufung von Chlorgas als ein schwaches gelb Dunst im Inneren des Behälters sichtbar sein soll. 
		Achtung: Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen Sterilisation Containers um sicherzustellen, dass der Druck im Inneren des Deckels nicht unseated hat oder paraffin Film. Wenn der Deckel hat abgewählt oder Paraffin-Film hat Lose kommen, schließen Sie den Deckel und sorgfältig wickeln Sie den Behälter mit einer zusätzlichen Schicht von Paraffin Film.</li>
		<li>Nach 1 h-Sterilisation, öffnen Sie den Container durch Entfernen des Paraffin-Films und Öffnen des Deckels an der Ecke. Den Container, vent für 3 h die Reaktion und das Chlorgas beseitigen lassen.</li>
		<li>Schließen die Kappen von den alle Mikrozentrifugenröhrchen im Samen Rack. 
		Hinweis: Sterilisierte Samen können gespeichert werden, bis zum Zeitpunkt der Galvanik, solange sie in trockenem Zustand gespeichert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die Samen-Ständer und legen Sie sie in eine laminare Strömung Kapuze.</li>
		<li>Neutralisieren Chlor Gas Reaktion <ol><li>Add 1,5 g Nahco3 3 Pulver langsam in das Becherglas mit dem Bleichmittel/HCl-Lösung und rühren mit einem Glasstab Nahco3 3 in Lösung aufzulösen. Fügen Sie weitere hinzu Nahco3 3 bis Kohlendioxid (CO 2) Gasblasen bilden aufgehört haben. 
			Achtung: Fügen Sie langsam um Spritzer zu vermeiden. Verwenden Sie geeignete PSA einschließlich Handschuhe und einen Laborkittel.</li>
			<li>Testen Sie den pH-Wert der Lösung mit pH-Streifen oder ein pH-Meter. Fügen Sie zusätzliche Nahco3 3, bei Bedarf kann bis der pH-Wert der Lösung neutral (pH 7,0). An dieser Stelle die Lösung aus der Dunstabzugshaube entfernt und gemäß aller geltenden Entsorgung Richtlinien entsorgt werden kann. 
			Achtung: Wenn Geruch bei der Entsorgung bemerkt wird, dann die Lösung sollte sofort zurückgegeben werden, der Dampfhaube.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Platte die sterilisierten Samen auf MS Platten.
	<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, beschriften Sie die Unterseite der Platte mit dem Namen und dem aktuellen Datum MS.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL von sterilisierten destilliertem Wasser auf jeder Microcentrifuge Schlauch, die Samen auszusetzen. Samen auf der MS Teller gießen und verbreiten die Samen gleichmäßig um die Platte mit einer sterilen, Einweg-Impfkeimen Schleife oder einer sterilen Pipettenspitze.</li>
		<li>Legen Sie die MS-Platte auf der Rückseite des die Laminar-Flow-Haube mit dem Deckel halb geschlossen. Das überschüssige Wasser von der MS-Platte verdunsten lassen.</li>
		<li>Setzen Sie den Deckel auf der MS-Platte. Die MS Dichtplatte durch Umwickeln der Platte mit mikroporösen chirurgische Papierband.</li>
	</ol></li></ol> 4. Wachstum von Arabidopsis auf MS Platten <ol><li>legen Sie die Platten mit den Deckel oben für drei Tage bei 4 ° c und Umgebungsfeuchte. 
	Hinweis: Dieser Vorgang wird als Schichtung und dient dazu, die Keimung der einzelnen Samen synchronisieren.</li>
	<li>Die Platten auf das Wachstum Umfeld übertragen.
	<ol><li>Pflegen Temperatur bei 23 ° C und Lichtintensität bei 120-150 µmol/m 2 s mit 16 h Licht / dunkel 8 h Photoperiode. Teller flach in der Umgebung wachsen mit dem Deckel auf der Oberseite zu platzieren, damit die Wurzeln in das Medium wachsen.</li>
	</ol></li> <li>Lassen Sie die Sämlinge auf Platten für 8 Tage wachsen. 
	Hinweis: Eine 8-tägige Vegetationsperiode kann spät keimenden Samen zu keimen. Platten können frühestens 8 Tage gewertet werden, ob alle Samen gekeimt haben.</li>
	<li>Punkten die Keimrate.
	<ol><li>Rekord die Anzahl der Samen, die gekeimt haben und die nicht gekeimt haben. Keimrate zu berechnen, indem die Anzahl der Samen, die gekeimt haben durch die Gesamtzahl der Samen auf der Platte. 
		Hinweis: Keimung wird gezählt, wenn die Keimwurzel außerhalb der Samenschale projiziert hat und die zwei Keimblätter sichtbar sind.</li>
		<li>Auch die Anzahl der Samen von Form, um die Wirksamkeit der Sterilisationsbedingungen betroffen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Beim Anbau von Arabidopsis Samen auf sterile Medien muss irgendeine Form der Sterilisation angewendet werden. Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation-Behandlungen führen zu ähnlichen Keimen Rate und Schimmel Wachstumshemmung. Keine Sterilisation Methode bewirkt eine signifikante Reduktion Keimrate für Samen mit potenziellen hohe Keimung; Bleichmittel Sterilisation empfiehlt jedoch für Leitungen mit niedriger Keimung Potenzial (20-70 %), aufgrund der geringen, wenn auch nicht signifikant, Verbesserung der Keimrate im Vergleich zu Gassterilisation (Abbildung 3A).
Arabidopsis Samen mit Bleichmittel Konzentrationen von 40-100 % für bis zu 10 Minuten sterilisieren bietet zufriedenstellende Keimung Prozentsätze und effektive Form der Unterdrückung. Obwohl Chlorid-Konzentrationen von weniger als 40 % bieten ausreichende Sterilisation für die meisten Saatgutpartien, mit einer Konzentration von 40 % oder höher garantiert effektive Sterilisation der auch stark verschmutzte Saatgutpartien. Es ist wichtig, keine 10 min der Sterilisation überschreiten bei Chlorid-Konzentrationen gleich oder höher als 80 % hohen Mortalität und Mängel in der Sämling-Entwicklung zu vermeiden.
Behandlung von Arabidopsis Samen mit Chlor-Gas-Konzentrationen von 6,1 % oder 16,5 % für 1 h führt zu hohen Keimungsraten und angemessene Schimmel Beseitigung. Niedrige Chlor-Gas-Konzentration (2,1 %) kann erfolgreich eingesetzt werden, mit zunehmender Dauer der Sterilisation bis 3 h.
Wenn einige Zeilen werden sterilisiert müssen, wird Flüssigkeit Sterilisation in einer Lösung von 50 % Bleichmittel für 10 min empfohlen. Für eine größere Zahl von Linien ist Gassterilisation mit einer Gaskonzentration von 6,1 % für 1 h eine bessere Option, da viele Zeilen schnell und einfach mit weniger Manipulation sterilisiert werden können.
Unsere Ergebnisse liefern standardisierte Bedingungen für die Sterilisierung, große Anzahl von Samen der verschiedenen Genotypen und die Samen mit potenziellen niedriger Keimung. Die einzige Einschränkung dieser Sterilisation-Techniken ist, dass sie auf die Samen mit Keimungsraten weniger als 20 % durch umfangreiche Samen Sterblichkeit angewendet werden können. Alternative Methoden, wie Beschallung17, Keimrate bei fehlender Sterilisation erhöhen können in diesen Fällen vorteilhaft sein.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) ist eine erstklassige Modellorganismus für Grundlagen- und angewandte Forschung im Werk Biologie1,2,3. Während Standardbedingungen für Arabidopsis Wachstum gut etablierte4wurden, wurde die Wirkung der Samen Sterilisation auf Saatgut Lebensfähigkeit nicht rigoros getestet. Feste Medien in Platten oder Kisten werden routinemäßig verwendet, um Wachstum von Arabidopsis Sämlinge für viele experimentelle Anwendungen, wie z. B. Identifizierung von homozygot letale Mutanten in einer Trennung Bevölkerung, Beobachtung von schießen und Wurzel Phänotypen zu früh zu erleichtern Stufen, Isolierung von Pathogen-freies Gewebe, Sammlung von großen Mengen an Sämling Gewebe, Auswahl der Transformanten oder resistente Pflanzen und Bewertung der Keimung1,2,3,4 . Samen von Pflanzen in einem Gewächshaus geerntet oder Wachstum Kammer gelegentlich mit Mikroorganismen und Staub verunreinigt sind. Wachstum von Arabidopsis Sämlinge auf verschiedene Arten von sterilen Medien erfordert vorherige Samen Sterilisation, mikrobielle Verunreinigungen wie Pilze und Bakterien auf der Oberfläche der Samen zu entfernen. Die Verwendung eines wirksamen Samen Sterilisation Regimes ist entscheidend für ein ausgewogenes Verhältnis von hohen Keimung, minimale Verunreinigung und kräftiges Pflanzenwachstum.
Die zwei am häufigsten verwendeten Methoden zur Arabidopsis Samen Sterilisation basieren auf kommerzielle Bleichmittel (Flüssigkeit-Phase) und Chlor-Gas (Dampf-Phase). Verschiedene Verfahren sind eingesetzt worden, für beide Flüssigkeit-Phase Sterilisation1,4,5,6,7,8,9 , 10 und Dampfphase Sterilisation von Arabidopsis Samen8,10,11,12,13,14,15 ,16. Während diese Verfahren wirksam bei Saatgut Sterilisation der eingesetzten Genotypen zu erreichen gewesen, wurde jedoch eine detaillierte Analyse der Auswirkungen der verschiedenen Sterilisation Behandlungen auf die Samen der verschiedenen Genotypen nicht berichtet. Daher ist die Optimierung dieser Sterilisation Verfahren erforderlich, um die Bedingungen zu definieren, in denen effiziente Sterilisation mit hohe Keimrate kombiniert wird.
The Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) ist einzigartig positioniert, um (a) Saatgut Lebensfähigkeit einer Vielzahl von unterschiedlichen Genotypen in der Sammlung und (b) nutzen Sie die Qualitätskontrollverfahren intern angewendet und als Reaktion auf Nutzer-Feedback zu testen über die Keimung der Samen. Die Ziele der hier vorgestellten Experimente waren die Auswirkungen der verschiedenen Sterilisationsverfahren auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen zu bestimmen. Optimierte Sterilisationen, die hohen Keimungsraten führen und gleichzeitig minimale Pathogenkontamination präsentieren für Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Sämlinge müssen oft auf sterile Medien angebaut werden. Dies erfordert eine vorherige Samen Sterilisation das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen auf der Oberfläche der Samen zu verhindern. Derzeit sind Arabidopsis Samen sterilisiert, mit zwei unterschiedlichen Sterilisationstechniken in Bedingungen, die unterscheiden sich leicht zwischen Labors und nicht standardisiert wurden, häufig mit dem Ergebnis nur teilweise effektive Sterilisation oder übermäßige Samen Sterblichkeit. Die meisten dieser Methoden sind auch nicht leicht skalierbar, um eine große Anzahl von Samen Linien der verschiedenen Genotypen. Technologien für Hochdurchsatz-Analyse von Arabidopsis weiterhin vermehren, werden standardisierte Techniken für die große Anzahl von Samen der verschiedenen Genotypen Sterilisierung unerlässlich für die Durchführung derartiger Experimente immer. Die Beantwortung einer Reihe von Arabidopsis Linien zwei verschiedene Sterilisationstechniken wurde anhand des Samen Keimrate und das Niveau der Verunreinigung des Saatgutes mit Mikroben und anderen Krankheitserregern. Die Behandlungen enthalten verschiedene Konzentrationen der Sterilisierung von Agenten und Zeiten der Exposition, kombiniert, um optimale Bedingungen für Arabidopsis Samen Sterilisation zu bestimmen. Optimierte Protokolle wurden für zwei verschiedene Sterilisationsverfahren: Bleach (Flüssigkeit-Phase) und (Cl2) Chlorgas (Dampf-Phase), beide was zu hohen Keimungsraten und minimale mikrobieller Kontamination. Das Dienstprogramm dieser Protokolle wurde durch die Erprobung von Wildtyp und Mutanten Samen mit einer Reihe von Keimen Potenziale dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Samen wirksam sterilisiert werden können mit beiden Methoden ohne übermäßige Samen Mortalität, obwohl nachteilige Auswirkungen der Sterilisation für Samen mit niedriger als optimale Keimung Potenzial beobachtet wurden. Darüber hinaus wurde eine Formel entwickelt, um Forscher luftdichten Behältern in verschiedenen Größen die standardisierte Chlor Gas Sterilisationsbedingungen zuweisen können. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen einfache, effiziente und kostengünstige Samen Sterilisation für eine große Anzahl von Arabidopsis Linien.

Arabidopsis Samen aus eine offene Feld, im Gewächshaus oder Wachstum Kammer sind manchmal durch verschiedene Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien1,4kontaminiert. Keimende Samen auf sterile Medien kann besonders schwierig wegen der Verschmutzung der Platten, vor allem, wenn die Versorgung mit Saatgut begrenzt ist. Das optimierte Protokoll für Bleichmittel und Chlor Gassterilisation, deren Ergebnisse nachfolgend präsentiert werden, dieses Problem minimiert und bewahrt die Lebensfähigkeit von Samen für Anwendungen mit hohem Durchsatz.
Auswirkungen der Bleichmittel Sterilisation auf das Keimen der Samen von Arabidopsis Col-0
Bleach ist der am häufigsten verwendeten Agent für Saatgut Sterilisation in zahlreichen Pflanzenarten. Die optimale Konzentration der Sterilisation-Agent und die Belichtungszeit variiert zwischen den Arten. Eine Reihe von Protokollen beschäftigt mit Bleichmittel für die Sterilisation von Arabidopsis Samen1,4,5,6,7,8,9 , 10. vier unterschiedliche Konzentrationen von Bleichmittel mit fünf verschiedenen Belichtungszeit Perioden wurden getestet und die Ergebnisse präsentieren wir Abbildung 1. Die Behandlungen wurden auf Columbia Wildtyp (Col-0) Samen angewendet. Die Wirkung des Bleiche Konzentration auf das Keimen der Samen Col-0 variiert je nach der Sterilisation beweist eine signifikante Wechselwirkung zwischen Bleichmittel Konzentration und Zeit der Sterilisation (Abbildung 1, P &#60; 0,001, ANOVA-Analyse der Varianz).
Behandlungen mit allen Chlorid-Konzentrationen führte in den Experimenten mit Sterilisation Zeit zwischen 5 und 10 min ebenso hohe Keimrate von Col-0 Samen (Abbildung 1). Hohen Keimungsraten wurden auch Haushaltsbleiche Konzentrationen von 40 % und 50 % für alle Sterilisation Zeiten beobachtet. Behandlungen mit 80 % und 100 % Bleichmittel für Zeiträume von mehr als 10 min führte zu einer signifikanten Abnahme der Keimrate im Vergleich zu den durchnässten verkürzt (P &#60; 0,01, ANOVA). Darüber hinaus für 80 % und 100 % Behandlungen für 20 min Chlorid, Keimung wurde signifikant verringert im Vergleich zu den entsprechenden 40 % und 50 % Bleichmittel Behandlungen (P &#60; 0,001, ANOVA).
Samen angezeigt verschiedenen Ebenen der bleichen und Ausdörrende Verwendung hohe Chlorid-Konzentrationen für 15 Minuten oder länger. Zusätzlich zu den relativ hoch (bis zu 32 %) Samen Sterblichkeit, gekeimte Samen sterilisiert in diesen Bedingungen zeigte oft Wachstumsstörungen, spiegelt sich in ein Versagen der Keimblätter und Hypocotyle, zu entfalten und zu verlängern, was zu Entwicklungsstörungen Verhaftung. Die meisten Behandlungen (14 von 20) wurden völlig Schimmel-frei, was zu Schimmel Ebene Gesamtdurchschnitt von 0,21 % ± 0,003 (Tabelle 1).
Eine Behandlung mit 50 % Bleichmittel und einer Einwirkzeit von 10 min wurde als das beste Sterilisation Regime ausgewählt, weil es hohe Keimung Prozentsatz mit guten Hemmung des Wachstums der Oberfläche Pathogen kombiniert. Diese Behandlung wurde ausgewählt, um die Wirkung der Bleichmittel Sterilisation auf verschiedenen Mutante Linien zu testen, wie unten beschrieben.
Auswirkungen von Chlor-Gas-Sterilisation auf das Keimen der Samen Col-0
Um Chlor Gas Sterilisationsbedingungen zu optimieren, wurden drei unterschiedliche Konzentrationen von Chlorgas zur Col-0 Samen für zwei Zeiträume (Tabelle 2) zu sterilisieren. Die Gaskonzentration war das Volumen der konzentrierten HCl und das Volumen des Behälters Sterilisation unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Diese Gleichung wurde abgeleitet, mit dem idealen Gas-Gesetz angenommen, 12,3 M HCl, einer Temperatur von 23 ° C und standard atmosphärischen Druck von 101,3 kPa.
Die Wirkung von Chlor-Gas-Konzentration auf das Keimen der Samen Col-0 wurde gezeigt, dass die Zeit der Sterilisation davon abhängen, wie durch eine signifikante Wechselwirkung zwischen der Zeit und der Konzentration Faktoren angegeben (Abbildung 2A, P &#60; 0,01, ANOVA) . Chlor-Gas-Konzentration hatte keinen signifikanten Einfluss auf das Keimen der Samen der Col-0 1 h Sterilisation unterzogen. Mit diesmal Sterilisation alle Konzentrationen von Chlorgas gefördert ähnlich hohe Keimfähigkeit, über 85 % (P &#62; 0,05, ANOVA). Auf der anderen Seite ein 3 h lang Sterilisation ergab einen signifikanten Rückgang der Keimrate für die höchste Konzentration von Chlorgas, verglichen mit den beiden unteren Gaskonzentrationen (P &#60; 0,05, ANOVA). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Behandlungen von Arabidopsis Samen mit keinem der getesteten Chlor Gaskonzentrationen für 1 h oder mit Gaskonzentrationen unter 16,5 % für 3 h ebenso wirksam Samen Lebensfähigkeit zu erhalten sind, da die Keimrate immer größer wurden über 82 %. Samen für 3 h mit 16,5 % Gas sterilisieren war jedoch nachteilig auf die Samenkeimung.
Das Auftreten von Schimmel war auch abhängig von der Gaskonzentration und Belichtungszeit. Schimmelbildung war effektiv mit der relativ hohen Konzentrationen von 6,1 % und 16,5 % Chlorgas für 1 h dauernden Behandlung und alle Gaskonzentrationen für 3 h (Abbildung 2 b) gehemmt.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Behandlung mit einer Gaskonzentration von 6,1 % für 1 h (Tabelle 2) als die besten Dampfphase Sterilisation Zustand ausgewählt, testen Sie die Wirkung der Gassterilisation auf verschiedenen Mutante Linien, da es hohe Keimung Rate kombiniert ( 85 %) mit sehr niedrigen Niveau von Schimmel Verschmutzung (0,02 %).
Auswirkungen der Bleiche und Chlor Gassterilisation auf Samen mit verschiedenen Keimen potenzielle
Statistische Analyse ergab, dass die Keimung Sterilisationsmethoden abhängig von der Keimung Potenzial der Linien reagierte auf (Abb. 3A, P &#60; 0,01, ANOVA). Weder Bleichmittel noch Chlor-Gas-Sterilisation reduziert die Keimfähigkeit der Samen mit hoher Keimung potenzielle (Gruppen 4 und 5). Keine Behandlung wirkten sich auf die ohnehin schon niedrige Keimungsrate der Gruppe mit der niedrigsten KeimungPotenzial (Gruppe 1). Im Gegensatz dazu Chlor Gassterilisation führte zu einer deutlichen Verringerung von ca. 12-18 % (P &#60; 0,01, ANOVA) in die Keimung der Samen mit mittleren Keimung Potenzial (Gruppen 2 und 3). Bleichmittel Sterilisation verringert auch Keimrate von 13 % der Gruppe 2, aber es nicht zu verringern die Keimrate von Gruppe 3. Zwar gab es keinen signifikanten Unterschied in Keimrate zwischen dem Bleichmittel und Chlor Gas Behandlungen in einer beliebigen Gruppe von Keimen (Abb. 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), Samen sterilisiert mit Bleichmittel haben eine etwas höhere Keimrate als Gas sterilisiert Saatgut in allen Gruppen der Keimung.
Sterilisation-Behandlungen signifikant verändert (P &#60; 0,001, ANOVA) Prozent der Samen von Schimmel (Abb. 3 b) betroffen. Beide Chlor Gas und Bleichmittel Sterilisation führten zu weniger Schimmelbildung (P &#60; 0,05, ANOVA) im Vergleich zu keine Sterilisation. Es gab keinen Unterschied in der Form-Ebene zwischen Gas und Bleichmittel Sterilisation in einer beliebigen Gruppe festgestellt (Abb. 3 b, P &#62; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Abb. 1: Auswirkungen von Bleichmittel Konzentration und Sterilisation Zeit auf das Keimen der Samen von Arabidopsis Col-0. Werte sind Mittel ± SD aus 5 unabhängigen Wiederholungen des Experiments gewonnen. * zeigt signifikante Unterschiede im Vergleich zu den 5 min einweichen Dauer für eine Reihe von Chlorid-Konzentrationen (P &#60; 0,01, ANOVA). #zeigt erhebliche Unterschiede von 80 % und 100 % Chlorid-Konzentrationen im Vergleich zu 40 % und 50 % für 20 min Zeit (P &#60; 0,01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Auswirkungen von Chlor gas-Konzentration und Sterilisation Zeit auf Arabidopsis Col-0 Samen. (A) Keimrate und (B) Schimmel-Ebene. Fehlerbalken darzustellen Mittel ± SD 5 biologische und 5 technische Wiederholungen des Experiments entnommen. Bedeutet, dass einen Brief nicht teilen sind signifikant unterschiedlich (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Auswirkungen der Bleiche und Chlor Gassterilisation auf Samen mit verschiedenen Keimen potenzielle. (A) Keimrate und (B) Schimmel-Ebene. Die 100 Zeilen SALK T-DNA wurden in fünf Gruppen entsprechend ihrer Keimung potenzielle definiert als die Keimungsrate in Ermangelung jeder Sterilisation Agent eingestuft. Die Gruppen basierend auf die Keimrate waren wie folgt: Gruppe 1 (0-20 %), Gruppe 2 (21-50 %), Gruppe 3 (51-70 %), Gruppe 4 (71-90 %) und Gruppe 5 (91-100 %). Die Linien wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und ihre potenziellen Keimung Genotyp nicht abhängig. Werte sind Mittel ± SD aus drei unabhängigen Wiederholungen des Experiments gewonnen. Buchstaben ("a", "Ab", "C", etc.) über jeden Wert zeigen die statistischen Gruppierungen der Kategorie Mittel. Bedeutet, dass einen Brief nicht teilen sind signifikant unterschiedlich (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sterilisation-Zeit (min)</td>
			<td colspan="4">Chlorid-Konzentration (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>2.13 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,50 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,36 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,68 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19 %</td>
			<td>0,28 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Schimmel Maß an Bleichmittel sterilisiert Col-0 Samen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bleichmittel</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Zeit</td>
			<td rowspan="2">% Chlorgas (Mol Cl2/mol total Gas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Chlor (Cl2) gas-Sterilisation Behandlungen auf Columbia Wildtyp Samen mit einem 7 L-Container.
Zusätzliche Tabelle 1: Eine Tabelle, die für die Durchführung der Berechnung für verschiedene Volumina der Container und % Cl2programmiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen auf sterile Medien gewachsen zu bestimmen. Optimierte Sterilisation Protokolle wurden entwickelt, um das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gleichzeitig zufriedenstellend Samen überleben zu verhindern.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

standardized-method-for-high-throughput-sterilization-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

29.4K Aufrufe.  The Ohio State University. Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen auf sterile Medien gewachsen zu bestimmen. Optimierte Sterilisation Protokolle wurden entwickelt, um das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gleichzeitig zufriedenstellend Samen überleben zu verhindern.

Serie: Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Forschung

Umwelt

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Eine Flexible Low-Cost-Hydrokultur-System für die Bewertung der Pflanze Antworten auf kleine Moleküle unter sterilen Bedingungen

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biologie

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Entwicklungsbiologie

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em&gt; In-vitro-</em&gt; Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Seitenwurzel induzierbaren Systems in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Und Mais

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

Hydroponics: ein vielseitiges System Nährstoff Allocation und Pflanzen Reaktionen auf die Nährstoffverfügbarkeit und Belastung durch toxische Elemente zu studieren

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Zusammenfassung

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Einhaltung von Bakterien auf Flächen, die im Labor ermittelten Pflanzen

Eine Flexible Low-Cost-Hydrokultur-System für die Bewertung der Pflanze Antworten auf kleine Moleküle unter sterilen Bedingungen

Isolation von Protoplasten aus Geweben von 14-Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden

Seitenwurzel induzierbaren Systems in

Hydroponics: ein vielseitiges System Nährstoff Allocation und Pflanzen Reaktionen auf die Nährstoffverfügbarkeit und Belastung durch toxische Elemente zu studieren

Hochdurchsatz-, robuste und hochzeitflexible Methode zur Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen