Wir möchte Gauri Datta Danke für ihre Hilfe bei der Vorbereitung experimentelle Materialien. Wir sind auch dankbar, Bettina Wittler und James Mann für die kritische Überprüfung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die NSF Stipendien DBI-1049341 und MCB-1143813 unterstützt.

1. Vorbereitung von 1 x Medium Murashige und Skoog (MS) <ol><li>hinzufügen 4.31 g MS basale Salzgemisch, 10 g Saccharose und 0,5 g 2-(N-Morpholino) Ethanesulfonic Säure (MES), ein Becher mit 0,8 L destilliertes Wasser und unter Rühren auflösen. Prüfen Sie und einstellen Sie der pH-Wert bis 5,7 mit 1 M Kalilauge (KOH). Hinzufügen von destilliertem Wasser zu 1 L.</li>
	<li>Teilen der Medien in zwei 1-Liter-Flaschen, 500 mL. Jede Flasche 5 g Agar-Agar hinzufügen. Halten Sie den Deckel lose.</li>
	<li>Autoklaven für 20 min bei 121 ° C, 15 Psi mit magnetischen Stir Bar in der Flasche.</li>
	<li>Nach dem Autoklavieren, stellen Sie die Flaschen auf einem Teller Rühren bei niedriger Drehzahl und ermöglichen das MS Medium auf 45-50 ° C abkühlen lassen (bis die Flasche mit bloßen Händen gehalten werden kann).</li>
	<li>Ausgehend von diesem Schritt, alle Schritte unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Haube. Hinzufügen von 500 µL Gamborg &#39; s Vitamin Lösung zu jeder Flasche und rühren Sie das MS-Medium, um die Vitamin-Lösung gleichmäßig zu verteilen.</li>
	<li>Platten, etwa die Hälfte der Tiefe der Platte decken genügend Medien gießen.</li>
	<li>Erlauben die Platten abkühlen bei Raumtemperatur ca. 1 h nach dem Agar zu erstarren lassen. 
	Hinweis: Wenn die Platten nicht sofort verwendet werden, wickeln Sie sie in Kunststoff und bei 4 ° C (Kühlschranktemperatur) zu speichern. Überdachte Platten, Boxen oder Rohre mit erstarrtem Agar können für mehrere Wochen bei 4 ° C in einem luftdichten Behälter gespeichert werden.</li>
</ol> 2. Sterilisation von Arabidopsis Samen mit Bleichmittel <ol><li>bereiten die MS Platten gemäß § 1 des Protokolls. Autoklaven 100 mL destilliertem Wasser zur gleichen Zeit wie der MS-Media. Verwenden Sie diese später als Spülwasser und zu helfen, die Samen zu unterbrechen um Beschichtung unterstützen. 
	Hinweis: Falls gewünscht, kann 0,8 % Agar Mischung (w/V) (z.B. Phytagar) auch autoklaviert in diesem Schritt werden. Die Agar-Mischung für destilliertes Wasser ersetzt werden kann, während der Beschichtung (Schritt 2.5.3.). Die zusätzliche Viskosität der Agar-Mischung macht es einfacher, Raum Samen auf der Platte oder Anlage in Zeilen ggf..</li>
	<li>Bereiten Sie 50 % (V/V) Bleichen Lösung zum Sterilisieren der Samen verwendet werden. Um Bleichmittel zu verdünnen, fügen Sie 100 mL von Bleichmittel zu 100 mL destilliertem Wasser hinzu. Das Bleichmittel-Lösung 50 µL Tween 20 Spülmittel hinzufügen. 
	Hinweis: Vorbereitete Bleichmittel-Lösung kann gelagert werden bis zu einem Monat, solange es nur unter sterilen Bedingungen geöffnet wird.</li>
	<li>Aliquoten 100 Samen zu einem Microcentrifuge Schlauch 1,5 mL.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Samen mit einer 50 %-Chloridlösung.
	<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, 500 µL 50 % Bleichmittel-Lösung hinzufügen den Microcentrifuge Schlauch, die Samen enthält. Tippen Sie auf der Unterseite des Rohres, die Samen in das Bleichmittel-Lösung auszusetzen. 
		Hinweis: Alternativ ein Rotator oder Plattform Shaker verwendet werden die Samen suspendiert halten.</li>
	</ol></li> <li>Spülen Sie das Bleichmittel-Lösung aus der Tube.
	<ol><li>Nach 10 min, entfernen Sie das Bleichmittel-Lösung aus den Microcentrifuge Schlauch mit Hilfe einer Pipette oder eine Absauganlage mit einer Pipettenspitze am Ende ausgestattet.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL sterilem destilliertem Wasser am Rohr. Verschließen Sie das Röhrchen und kehren Sie um zu mischen. Lassen Sie Samen auf den Boden des Röhrchens abrechnen. Entfernen Sie Samen auf den Boden des Röhrchens niedergelassen haben, sorgfältig das Bleichmittel-Lösung durch pipettieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang Spülprozess 6mal.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL autoklaviert destilliertem Wasser am Rohr, die Samen auszusetzen.</li>
	</ol></li> <li>Platte die sterilisierten Samen auf MS Platten.
	<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, beschriften Sie die Unterseite der Platte mit dem Namen und dem aktuellen Datum MS.</li>
		<li>Gießen Sie die Samen aus den Microcentrifuge Schlauch auf die MS-Platte. Verbreiten Sie die Samen um die MS-Platte mit einer sterilen, Einweg-Impfkeimen Schleife oder einer sterilen Pipettenspitze. 
		Hinweis: Wenn Samen sind in Reihen gesät werden, eine Pipette mit 200 µL Spitze lässt sich individuell Samen in die gewünschten Positionen zu platzieren. Um den Fluss der Samen zu verbessern, kann zum Jahresende die Pipettenspitze von 3-5 mm mit einer Schere abgeschnitten werden. Eine unangebrachte Samen oder Cluster von Samen können dann neu positioniert werden oder getrennt, mit einer sterilen Einweg-Impfkeimen Schleife.</li>
		<li>Legen Sie die MS-Platte auf der Rückseite des die Laminar-Flow-Haube mit dem Deckel halb geschlossen. Das überschüssige Wasser von der MS-Platte verdunsten lassen.</li>
		<li>Setzen Sie den Deckel auf der MS-Platte. Siegel die MS-Platte durch das Einwickeln der Platte mit mikroporösen Papier chirurgische tape (siehe die Tabelle der Werkstoffe).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilisation von Arabidopsis Saatgut mit Chlorgas <ol><li>bereiten die MS Platten gemäß § 1 des Protokolls. Autoklaven 100 mL destilliertem Wasser zur gleichen Zeit wie der MS-Media; Dies wird später verwendet, um dazu beitragen, die Samen zur Beschichtung Unterstützung auszusetzen. 
	Hinweis: Falls gewünscht, kann 0,8 % Agar Mischung (w/V) (z.B. Phytagar) auch autoklaviert in diesem Schritt werden. Die Agar-Mischung für destilliertes Wasser ersetzt werden kann, während der Beschichtung (Schritt 3.6.2.). Die zusätzliche Viskosität der Agar-Mischung macht es einfacher, Raum Samen auf der Platte oder Anlage in Zeilen ggf..</li>
	<li>Vor Beginn der Sterilisation, berechnen die Mengen an Bleichmittel und Salzsäure (HCl) erforderlich, um produzieren Chlorgas.
	<ol><li>Berechnen Sie die Menge an HCl benötigt, um die 6,1 % Cl 2 erforderlich für die Sterilisation produzieren.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgende Formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> mit 7.000 mL als das Volumen des Behälters Sterilisation und 6,1 % Cl 2; errechnet sich das Volumen der HCl zu 3 mL. 
		Hinweis: Eine Tabelle, die für die Durchführung der Berechnung für verschiedene Volumina der Container und % Cl 2 programmiert als ergänzende Tabelle1 vorgesehen ist.</li>
	</ol></li> <li>Aliquoten 100 Samen in 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Schließen Sie die Kappen für jedes Fläschchen, legen Sie die Fläschchen in einem Kunststoff-Rack und beiseite stellen. 
	Hinweis: Samen können für längere Zeit an dieser Stelle gespeichert werden, solange sie in einem ordnungsgemäßen Zustand befinden. Lagerbedingungen finden Sie in Abschnitt 3.3.2 des Protokolls von Rivero und Kollegen 4. 96-Well-Plattenformat kann auch verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie die Materialien notwendig, Chlor-Gas-Sterilisation durchzuführen.
	<ol><li>ihre Speicherorte Bleichmittel und HCl einzuholen.</li>
		<li>Schnitt ein Streifen von großen Paraffin film (siehe die Tabelle der Materialien), im Schritt 3.5.3 verwenden., Sterilisation Containers zu versiegeln.</li>
		<li>Legen Sie die Kunststoff-Behälter mit Deckel, in dem die Sterilisation in einer Dampfhaube stattfinden wird. Die Obergrenzen für die Saatgut-Fläschchen öffnen und legen Sie das gesamte Saatgut Rack innerhalb der Kunststoffbehälter.</li>
	</ol></li> <li>Chlor-Gas-Sterilisation bei Raumtemperatur durchführen. 
	Achtung: Arbeiten Sie mit Bleichmittel und Säure getrennt. Lassen Sie sich nicht entweder Flasche verschlossen, um das Risiko von Leckagen. Verwenden Sie geeignetsten persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Handschuhe und einen Laborkittel. Wenn entweder Bleichmittel oder Säure auf Handschuhe spritzt, ändern Sie Handschuhe vor dem Umgang mit anderen Materialien. Entfernen Sie immer Handschuhe in der Dunstabzugshaube bei Bleichmittel oder Säure Kontamination.
	<ol><li>Eine 250 mL-Becherglas im Inneren des Behälters und 100 mL Bleichmittel. 
		Hinweis: Die Reaktion zwischen HCl und Bleichmittel erfordert mindestens 22 Bänden Übermaß an Bleichmittel. Die Reaktion wird die HCl zu konsumieren und bleichen durch die Freigabe von Cl 2 Gas mit Natriumchlorid (NaCl) und Wasser als Nebenprodukte. Mit einem großen Überschuss von Bleichmittel ermöglicht den Verbrauch von zusätzlichen HCl dährend der Entlüftung Periode, die verringert die Menge an Natriumbicarbonat (Nahco3 3) benötigt, um die Lösung für die Entsorgung neutralisieren. 
		Vorsicht: Der Becher ist mindestens zweimal das flüssige Gesamtvolumen des Bleiche + HCl. Dies verhindert Spritzer Flucht das Becherglas während der nächste Schritt, die Samen beschädigen, Kleidung bleichen oder exponierten Haut verbrennen können.</li>
		<li>Verleihen den Becher mit der Bleiche 3 mL HCl. 
		Achtung: Die erste Reaktion entstehen Bläschen, vor allem bei Gaskonzentrationen 6,1 % höher. Ein lang-sleeved Kittel ist für diesen Schritt notwendig.</li>
		<li>Schließen die Sterilisation-Container und verschließen Sie diese sofort mit Paraffin Film.</li>
		<li>Überwachung des Sterilisation Containers während der Sterilisation Zeit Gas Anhäufung sicherzustellen, die Anhäufung von Chlorgas als ein schwaches gelb Dunst im Inneren des Behälters sichtbar sein soll. 
		Achtung: Überprüfen Sie in regelmäßigen Abständen Sterilisation Containers um sicherzustellen, dass der Druck im Inneren des Deckels nicht unseated hat oder paraffin Film. Wenn der Deckel hat abgewählt oder Paraffin-Film hat Lose kommen, schließen Sie den Deckel und sorgfältig wickeln Sie den Behälter mit einer zusätzlichen Schicht von Paraffin Film.</li>
		<li>Nach 1 h-Sterilisation, öffnen Sie den Container durch Entfernen des Paraffin-Films und Öffnen des Deckels an der Ecke. Den Container, vent für 3 h die Reaktion und das Chlorgas beseitigen lassen.</li>
		<li>Schließen die Kappen von den alle Mikrozentrifugenröhrchen im Samen Rack. 
		Hinweis: Sterilisierte Samen können gespeichert werden, bis zum Zeitpunkt der Galvanik, solange sie in trockenem Zustand gespeichert werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die Samen-Ständer und legen Sie sie in eine laminare Strömung Kapuze.</li>
		<li>Neutralisieren Chlor Gas Reaktion <ol><li>Add 1,5 g Nahco3 3 Pulver langsam in das Becherglas mit dem Bleichmittel/HCl-Lösung und rühren mit einem Glasstab Nahco3 3 in Lösung aufzulösen. Fügen Sie weitere hinzu Nahco3 3 bis Kohlendioxid (CO 2) Gasblasen bilden aufgehört haben. 
			Achtung: Fügen Sie langsam um Spritzer zu vermeiden. Verwenden Sie geeignete PSA einschließlich Handschuhe und einen Laborkittel.</li>
			<li>Testen Sie den pH-Wert der Lösung mit pH-Streifen oder ein pH-Meter. Fügen Sie zusätzliche Nahco3 3, bei Bedarf kann bis der pH-Wert der Lösung neutral (pH 7,0). An dieser Stelle die Lösung aus der Dunstabzugshaube entfernt und gemäß aller geltenden Entsorgung Richtlinien entsorgt werden kann. 
			Achtung: Wenn Geruch bei der Entsorgung bemerkt wird, dann die Lösung sollte sofort zurückgegeben werden, der Dampfhaube.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Platte die sterilisierten Samen auf MS Platten.
	<ol><li>In einem Laminar-Flow-Haube, beschriften Sie die Unterseite der Platte mit dem Namen und dem aktuellen Datum MS.</li>
		<li>Hinzufügen 500 µL von sterilisierten destilliertem Wasser auf jeder Microcentrifuge Schlauch, die Samen auszusetzen. Samen auf der MS Teller gießen und verbreiten die Samen gleichmäßig um die Platte mit einer sterilen, Einweg-Impfkeimen Schleife oder einer sterilen Pipettenspitze.</li>
		<li>Legen Sie die MS-Platte auf der Rückseite des die Laminar-Flow-Haube mit dem Deckel halb geschlossen. Das überschüssige Wasser von der MS-Platte verdunsten lassen.</li>
		<li>Setzen Sie den Deckel auf der MS-Platte. Die MS Dichtplatte durch Umwickeln der Platte mit mikroporösen chirurgische Papierband.</li>
	</ol></li></ol> 4. Wachstum von Arabidopsis auf MS Platten <ol><li>legen Sie die Platten mit den Deckel oben für drei Tage bei 4 ° c und Umgebungsfeuchte. 
	Hinweis: Dieser Vorgang wird als Schichtung und dient dazu, die Keimung der einzelnen Samen synchronisieren.</li>
	<li>Die Platten auf das Wachstum Umfeld übertragen.
	<ol><li>Pflegen Temperatur bei 23 ° C und Lichtintensität bei 120-150 µmol/m 2 s mit 16 h Licht / dunkel 8 h Photoperiode. Teller flach in der Umgebung wachsen mit dem Deckel auf der Oberseite zu platzieren, damit die Wurzeln in das Medium wachsen.</li>
	</ol></li> <li>Lassen Sie die Sämlinge auf Platten für 8 Tage wachsen. 
	Hinweis: Eine 8-tägige Vegetationsperiode kann spät keimenden Samen zu keimen. Platten können frühestens 8 Tage gewertet werden, ob alle Samen gekeimt haben.</li>
	<li>Punkten die Keimrate.
	<ol><li>Rekord die Anzahl der Samen, die gekeimt haben und die nicht gekeimt haben. Keimrate zu berechnen, indem die Anzahl der Samen, die gekeimt haben durch die Gesamtzahl der Samen auf der Platte. 
		Hinweis: Keimung wird gezählt, wenn die Keimwurzel außerhalb der Samenschale projiziert hat und die zwei Keimblätter sichtbar sind.</li>
		<li>Auch die Anzahl der Samen von Form, um die Wirksamkeit der Sterilisationsbedingungen betroffen.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Beim Anbau von Arabidopsis Samen auf sterile Medien muss irgendeine Form der Sterilisation angewendet werden. Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation-Behandlungen führen zu ähnlichen Keimen Rate und Schimmel Wachstumshemmung. Keine Sterilisation Methode bewirkt eine signifikante Reduktion Keimrate für Samen mit potenziellen hohe Keimung; Bleichmittel Sterilisation empfiehlt jedoch für Leitungen mit niedriger Keimung Potenzial (20-70 %), aufgrund der geringen, wenn auch nicht signifikant, Verbesserung der Keimrate im Vergleich zu Gassterilisation (Abbildung 3A).
Arabidopsis Samen mit Bleichmittel Konzentrationen von 40-100 % für bis zu 10 Minuten sterilisieren bietet zufriedenstellende Keimung Prozentsätze und effektive Form der Unterdrückung. Obwohl Chlorid-Konzentrationen von weniger als 40 % bieten ausreichende Sterilisation für die meisten Saatgutpartien, mit einer Konzentration von 40 % oder höher garantiert effektive Sterilisation der auch stark verschmutzte Saatgutpartien. Es ist wichtig, keine 10 min der Sterilisation überschreiten bei Chlorid-Konzentrationen gleich oder höher als 80 % hohen Mortalität und Mängel in der Sämling-Entwicklung zu vermeiden.
Behandlung von Arabidopsis Samen mit Chlor-Gas-Konzentrationen von 6,1 % oder 16,5 % für 1 h führt zu hohen Keimungsraten und angemessene Schimmel Beseitigung. Niedrige Chlor-Gas-Konzentration (2,1 %) kann erfolgreich eingesetzt werden, mit zunehmender Dauer der Sterilisation bis 3 h.
Wenn einige Zeilen werden sterilisiert müssen, wird Flüssigkeit Sterilisation in einer Lösung von 50 % Bleichmittel für 10 min empfohlen. Für eine größere Zahl von Linien ist Gassterilisation mit einer Gaskonzentration von 6,1 % für 1 h eine bessere Option, da viele Zeilen schnell und einfach mit weniger Manipulation sterilisiert werden können.
Unsere Ergebnisse liefern standardisierte Bedingungen für die Sterilisierung, große Anzahl von Samen der verschiedenen Genotypen und die Samen mit potenziellen niedriger Keimung. Die einzige Einschränkung dieser Sterilisation-Techniken ist, dass sie auf die Samen mit Keimungsraten weniger als 20 % durch umfangreiche Samen Sterblichkeit angewendet werden können. Alternative Methoden, wie Beschallung17, Keimrate bei fehlender Sterilisation erhöhen können in diesen Fällen vorteilhaft sein.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) ist eine erstklassige Modellorganismus für Grundlagen- und angewandte Forschung im Werk Biologie1,2,3. Während Standardbedingungen für Arabidopsis Wachstum gut etablierte4wurden, wurde die Wirkung der Samen Sterilisation auf Saatgut Lebensfähigkeit nicht rigoros getestet. Feste Medien in Platten oder Kisten werden routinemäßig verwendet, um Wachstum von Arabidopsis Sämlinge für viele experimentelle Anwendungen, wie z. B. Identifizierung von homozygot letale Mutanten in einer Trennung Bevölkerung, Beobachtung von schießen und Wurzel Phänotypen zu früh zu erleichtern Stufen, Isolierung von Pathogen-freies Gewebe, Sammlung von großen Mengen an Sämling Gewebe, Auswahl der Transformanten oder resistente Pflanzen und Bewertung der Keimung1,2,3,4 . Samen von Pflanzen in einem Gewächshaus geerntet oder Wachstum Kammer gelegentlich mit Mikroorganismen und Staub verunreinigt sind. Wachstum von Arabidopsis Sämlinge auf verschiedene Arten von sterilen Medien erfordert vorherige Samen Sterilisation, mikrobielle Verunreinigungen wie Pilze und Bakterien auf der Oberfläche der Samen zu entfernen. Die Verwendung eines wirksamen Samen Sterilisation Regimes ist entscheidend für ein ausgewogenes Verhältnis von hohen Keimung, minimale Verunreinigung und kräftiges Pflanzenwachstum.
Die zwei am häufigsten verwendeten Methoden zur Arabidopsis Samen Sterilisation basieren auf kommerzielle Bleichmittel (Flüssigkeit-Phase) und Chlor-Gas (Dampf-Phase). Verschiedene Verfahren sind eingesetzt worden, für beide Flüssigkeit-Phase Sterilisation1,4,5,6,7,8,9 , 10 und Dampfphase Sterilisation von Arabidopsis Samen8,10,11,12,13,14,15 ,16. Während diese Verfahren wirksam bei Saatgut Sterilisation der eingesetzten Genotypen zu erreichen gewesen, wurde jedoch eine detaillierte Analyse der Auswirkungen der verschiedenen Sterilisation Behandlungen auf die Samen der verschiedenen Genotypen nicht berichtet. Daher ist die Optimierung dieser Sterilisation Verfahren erforderlich, um die Bedingungen zu definieren, in denen effiziente Sterilisation mit hohe Keimrate kombiniert wird.
The Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) ist einzigartig positioniert, um (a) Saatgut Lebensfähigkeit einer Vielzahl von unterschiedlichen Genotypen in der Sammlung und (b) nutzen Sie die Qualitätskontrollverfahren intern angewendet und als Reaktion auf Nutzer-Feedback zu testen über die Keimung der Samen. Die Ziele der hier vorgestellten Experimente waren die Auswirkungen der verschiedenen Sterilisationsverfahren auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen zu bestimmen. Optimierte Sterilisationen, die hohen Keimungsraten führen und gleichzeitig minimale Pathogenkontamination präsentieren für Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Sämlinge müssen oft auf sterile Medien angebaut werden. Dies erfordert eine vorherige Samen Sterilisation das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen auf der Oberfläche der Samen zu verhindern. Derzeit sind Arabidopsis Samen sterilisiert, mit zwei unterschiedlichen Sterilisationstechniken in Bedingungen, die unterscheiden sich leicht zwischen Labors und nicht standardisiert wurden, häufig mit dem Ergebnis nur teilweise effektive Sterilisation oder übermäßige Samen Sterblichkeit. Die meisten dieser Methoden sind auch nicht leicht skalierbar, um eine große Anzahl von Samen Linien der verschiedenen Genotypen. Technologien für Hochdurchsatz-Analyse von Arabidopsis weiterhin vermehren, werden standardisierte Techniken für die große Anzahl von Samen der verschiedenen Genotypen Sterilisierung unerlässlich für die Durchführung derartiger Experimente immer. Die Beantwortung einer Reihe von Arabidopsis Linien zwei verschiedene Sterilisationstechniken wurde anhand des Samen Keimrate und das Niveau der Verunreinigung des Saatgutes mit Mikroben und anderen Krankheitserregern. Die Behandlungen enthalten verschiedene Konzentrationen der Sterilisierung von Agenten und Zeiten der Exposition, kombiniert, um optimale Bedingungen für Arabidopsis Samen Sterilisation zu bestimmen. Optimierte Protokolle wurden für zwei verschiedene Sterilisationsverfahren: Bleach (Flüssigkeit-Phase) und (Cl2) Chlorgas (Dampf-Phase), beide was zu hohen Keimungsraten und minimale mikrobieller Kontamination. Das Dienstprogramm dieser Protokolle wurde durch die Erprobung von Wildtyp und Mutanten Samen mit einer Reihe von Keimen Potenziale dargestellt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Samen wirksam sterilisiert werden können mit beiden Methoden ohne übermäßige Samen Mortalität, obwohl nachteilige Auswirkungen der Sterilisation für Samen mit niedriger als optimale Keimung Potenzial beobachtet wurden. Darüber hinaus wurde eine Formel entwickelt, um Forscher luftdichten Behältern in verschiedenen Größen die standardisierte Chlor Gas Sterilisationsbedingungen zuweisen können. Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen einfache, effiziente und kostengünstige Samen Sterilisation für eine große Anzahl von Arabidopsis Linien.

Arabidopsis Samen aus eine offene Feld, im Gewächshaus oder Wachstum Kammer sind manchmal durch verschiedene Mikroorganismen wie Pilze und Bakterien1,4kontaminiert. Keimende Samen auf sterile Medien kann besonders schwierig wegen der Verschmutzung der Platten, vor allem, wenn die Versorgung mit Saatgut begrenzt ist. Das optimierte Protokoll für Bleichmittel und Chlor Gassterilisation, deren Ergebnisse nachfolgend präsentiert werden, dieses Problem minimiert und bewahrt die Lebensfähigkeit von Samen für Anwendungen mit hohem Durchsatz.
Auswirkungen der Bleichmittel Sterilisation auf das Keimen der Samen von Arabidopsis Col-0
Bleach ist der am häufigsten verwendeten Agent für Saatgut Sterilisation in zahlreichen Pflanzenarten. Die optimale Konzentration der Sterilisation-Agent und die Belichtungszeit variiert zwischen den Arten. Eine Reihe von Protokollen beschäftigt mit Bleichmittel für die Sterilisation von Arabidopsis Samen1,4,5,6,7,8,9 , 10. vier unterschiedliche Konzentrationen von Bleichmittel mit fünf verschiedenen Belichtungszeit Perioden wurden getestet und die Ergebnisse präsentieren wir Abbildung 1. Die Behandlungen wurden auf Columbia Wildtyp (Col-0) Samen angewendet. Die Wirkung des Bleiche Konzentration auf das Keimen der Samen Col-0 variiert je nach der Sterilisation beweist eine signifikante Wechselwirkung zwischen Bleichmittel Konzentration und Zeit der Sterilisation (Abbildung 1, P &#60; 0,001, ANOVA-Analyse der Varianz).
Behandlungen mit allen Chlorid-Konzentrationen führte in den Experimenten mit Sterilisation Zeit zwischen 5 und 10 min ebenso hohe Keimrate von Col-0 Samen (Abbildung 1). Hohen Keimungsraten wurden auch Haushaltsbleiche Konzentrationen von 40 % und 50 % für alle Sterilisation Zeiten beobachtet. Behandlungen mit 80 % und 100 % Bleichmittel für Zeiträume von mehr als 10 min führte zu einer signifikanten Abnahme der Keimrate im Vergleich zu den durchnässten verkürzt (P &#60; 0,01, ANOVA). Darüber hinaus für 80 % und 100 % Behandlungen für 20 min Chlorid, Keimung wurde signifikant verringert im Vergleich zu den entsprechenden 40 % und 50 % Bleichmittel Behandlungen (P &#60; 0,001, ANOVA).
Samen angezeigt verschiedenen Ebenen der bleichen und Ausdörrende Verwendung hohe Chlorid-Konzentrationen für 15 Minuten oder länger. Zusätzlich zu den relativ hoch (bis zu 32 %) Samen Sterblichkeit, gekeimte Samen sterilisiert in diesen Bedingungen zeigte oft Wachstumsstörungen, spiegelt sich in ein Versagen der Keimblätter und Hypocotyle, zu entfalten und zu verlängern, was zu Entwicklungsstörungen Verhaftung. Die meisten Behandlungen (14 von 20) wurden völlig Schimmel-frei, was zu Schimmel Ebene Gesamtdurchschnitt von 0,21 % ± 0,003 (Tabelle 1).
Eine Behandlung mit 50 % Bleichmittel und einer Einwirkzeit von 10 min wurde als das beste Sterilisation Regime ausgewählt, weil es hohe Keimung Prozentsatz mit guten Hemmung des Wachstums der Oberfläche Pathogen kombiniert. Diese Behandlung wurde ausgewählt, um die Wirkung der Bleichmittel Sterilisation auf verschiedenen Mutante Linien zu testen, wie unten beschrieben.
Auswirkungen von Chlor-Gas-Sterilisation auf das Keimen der Samen Col-0
Um Chlor Gas Sterilisationsbedingungen zu optimieren, wurden drei unterschiedliche Konzentrationen von Chlorgas zur Col-0 Samen für zwei Zeiträume (Tabelle 2) zu sterilisieren. Die Gaskonzentration war das Volumen der konzentrierten HCl und das Volumen des Behälters Sterilisation unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Diese Gleichung wurde abgeleitet, mit dem idealen Gas-Gesetz angenommen, 12,3 M HCl, einer Temperatur von 23 ° C und standard atmosphärischen Druck von 101,3 kPa.
Die Wirkung von Chlor-Gas-Konzentration auf das Keimen der Samen Col-0 wurde gezeigt, dass die Zeit der Sterilisation davon abhängen, wie durch eine signifikante Wechselwirkung zwischen der Zeit und der Konzentration Faktoren angegeben (Abbildung 2A, P &#60; 0,01, ANOVA) . Chlor-Gas-Konzentration hatte keinen signifikanten Einfluss auf das Keimen der Samen der Col-0 1 h Sterilisation unterzogen. Mit diesmal Sterilisation alle Konzentrationen von Chlorgas gefördert ähnlich hohe Keimfähigkeit, über 85 % (P &#62; 0,05, ANOVA). Auf der anderen Seite ein 3 h lang Sterilisation ergab einen signifikanten Rückgang der Keimrate für die höchste Konzentration von Chlorgas, verglichen mit den beiden unteren Gaskonzentrationen (P &#60; 0,05, ANOVA). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Behandlungen von Arabidopsis Samen mit keinem der getesteten Chlor Gaskonzentrationen für 1 h oder mit Gaskonzentrationen unter 16,5 % für 3 h ebenso wirksam Samen Lebensfähigkeit zu erhalten sind, da die Keimrate immer größer wurden über 82 %. Samen für 3 h mit 16,5 % Gas sterilisieren war jedoch nachteilig auf die Samenkeimung.
Das Auftreten von Schimmel war auch abhängig von der Gaskonzentration und Belichtungszeit. Schimmelbildung war effektiv mit der relativ hohen Konzentrationen von 6,1 % und 16,5 % Chlorgas für 1 h dauernden Behandlung und alle Gaskonzentrationen für 3 h (Abbildung 2 b) gehemmt.
Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Behandlung mit einer Gaskonzentration von 6,1 % für 1 h (Tabelle 2) als die besten Dampfphase Sterilisation Zustand ausgewählt, testen Sie die Wirkung der Gassterilisation auf verschiedenen Mutante Linien, da es hohe Keimung Rate kombiniert ( 85 %) mit sehr niedrigen Niveau von Schimmel Verschmutzung (0,02 %).
Auswirkungen der Bleiche und Chlor Gassterilisation auf Samen mit verschiedenen Keimen potenzielle
Statistische Analyse ergab, dass die Keimung Sterilisationsmethoden abhängig von der Keimung Potenzial der Linien reagierte auf (Abb. 3A, P &#60; 0,01, ANOVA). Weder Bleichmittel noch Chlor-Gas-Sterilisation reduziert die Keimfähigkeit der Samen mit hoher Keimung potenzielle (Gruppen 4 und 5). Keine Behandlung wirkten sich auf die ohnehin schon niedrige Keimungsrate der Gruppe mit der niedrigsten KeimungPotenzial (Gruppe 1). Im Gegensatz dazu Chlor Gassterilisation führte zu einer deutlichen Verringerung von ca. 12-18 % (P &#60; 0,01, ANOVA) in die Keimung der Samen mit mittleren Keimung Potenzial (Gruppen 2 und 3). Bleichmittel Sterilisation verringert auch Keimrate von 13 % der Gruppe 2, aber es nicht zu verringern die Keimrate von Gruppe 3. Zwar gab es keinen signifikanten Unterschied in Keimrate zwischen dem Bleichmittel und Chlor Gas Behandlungen in einer beliebigen Gruppe von Keimen (Abb. 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), Samen sterilisiert mit Bleichmittel haben eine etwas höhere Keimrate als Gas sterilisiert Saatgut in allen Gruppen der Keimung.
Sterilisation-Behandlungen signifikant verändert (P &#60; 0,001, ANOVA) Prozent der Samen von Schimmel (Abb. 3 b) betroffen. Beide Chlor Gas und Bleichmittel Sterilisation führten zu weniger Schimmelbildung (P &#60; 0,05, ANOVA) im Vergleich zu keine Sterilisation. Es gab keinen Unterschied in der Form-Ebene zwischen Gas und Bleichmittel Sterilisation in einer beliebigen Gruppe festgestellt (Abb. 3 b, P &#62; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Abb. 1: Auswirkungen von Bleichmittel Konzentration und Sterilisation Zeit auf das Keimen der Samen von Arabidopsis Col-0. Werte sind Mittel ± SD aus 5 unabhängigen Wiederholungen des Experiments gewonnen. * zeigt signifikante Unterschiede im Vergleich zu den 5 min einweichen Dauer für eine Reihe von Chlorid-Konzentrationen (P &#60; 0,01, ANOVA). #zeigt erhebliche Unterschiede von 80 % und 100 % Chlorid-Konzentrationen im Vergleich zu 40 % und 50 % für 20 min Zeit (P &#60; 0,01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Auswirkungen von Chlor gas-Konzentration und Sterilisation Zeit auf Arabidopsis Col-0 Samen. (A) Keimrate und (B) Schimmel-Ebene. Fehlerbalken darzustellen Mittel ± SD 5 biologische und 5 technische Wiederholungen des Experiments entnommen. Bedeutet, dass einen Brief nicht teilen sind signifikant unterschiedlich (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Auswirkungen der Bleiche und Chlor Gassterilisation auf Samen mit verschiedenen Keimen potenzielle. (A) Keimrate und (B) Schimmel-Ebene. Die 100 Zeilen SALK T-DNA wurden in fünf Gruppen entsprechend ihrer Keimung potenzielle definiert als die Keimungsrate in Ermangelung jeder Sterilisation Agent eingestuft. Die Gruppen basierend auf die Keimrate waren wie folgt: Gruppe 1 (0-20 %), Gruppe 2 (21-50 %), Gruppe 3 (51-70 %), Gruppe 4 (71-90 %) und Gruppe 5 (91-100 %). Die Linien wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und ihre potenziellen Keimung Genotyp nicht abhängig. Werte sind Mittel ± SD aus drei unabhängigen Wiederholungen des Experiments gewonnen. Buchstaben ("a", "Ab", "C", etc.) über jeden Wert zeigen die statistischen Gruppierungen der Kategorie Mittel. Bedeutet, dass einen Brief nicht teilen sind signifikant unterschiedlich (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sterilisation-Zeit (min)</td>
			<td colspan="4">Chlorid-Konzentration (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>2.13 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,50 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,36 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,68 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19 %</td>
			<td>0,28 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Schimmel Maß an Bleichmittel sterilisiert Col-0 Samen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bleichmittel</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Zeit</td>
			<td rowspan="2">% Chlorgas (Mol Cl2/mol total Gas)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Chlor (Cl2) gas-Sterilisation Behandlungen auf Columbia Wildtyp Samen mit einem 7 L-Container.
Zusätzliche Tabelle 1: Eine Tabelle, die für die Durchführung der Berechnung für verschiedene Volumina der Container und % Cl2programmiert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen auf sterile Medien gewachsen zu bestimmen. Optimierte Sterilisation Protokolle wurden entwickelt, um das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gleichzeitig zufriedenstellend Samen überleben zu verhindern.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

standardized-method-for-high-throughput-sterilization-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K Aufrufe.  The Ohio State University. Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen der Bleichmittel und Chlor-Gas-Sterilisation auf die Keimung der Samen von einer Reihe von Arabidopsis Genotypen auf sterile Medien gewachsen zu bestimmen. Optimierte Sterilisation Protokolle wurden entwickelt, um das Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gleichzeitig zufriedenstellend Samen überleben zu verhindern.

Serie: Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Forschung

Biologie

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Standardisierte Methode für Hochdurchsatz-Sterilisation von Arabidopsis Samen

Zusammenfassung

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Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine (RNPs) on Human pre-mRNA

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

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