Vorremmo ringraziare Gauri Datta per la sua assistenza nella preparazione di materiali sperimentali. Siamo inoltre grati a Bettina Wittler e James Mann per la revisione critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NSF sovvenzioni DBI-1049341 e MCB-1143813.

1. preparazione di Murashige e Skoog (MS) medio: 1x <ol><li>aggiungere 4,31 g di MS basale miscela di sale, 10 g di saccarosio e 0,5 g di 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acido (MES) in un becher contenente 0,8 L di acqua distillata e mescolare per sciogliere. Controllare e regolare il pH a 5.7 utilizzando 1 M di idrossido di potassio (KOH). Aggiungere acqua distillata per fare 1 L.</li>
	<li>Dividere i media in due bottiglie da 1 L, 500 mL cadauna. Aggiungere 5 g di agar ad ogni bottiglia. Tenere il coperchio allentato.</li>
	<li>Autoclave per 20 min a 121 ° C, 15 psi con un ancoretta magnetica in bottiglia.</li>
	<li>Dopo la sterilizzazione in autoclave, mettete le bottiglie in un piatto mescolare a bassa velocità e lasci che il media MS raffreddare a 45-50 ° C (fino a quando la bottiglia può essere tenuta con le mani nude).</li>
	<li>a partire da questo passaggio, eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare. Aggiungere 500 µ l Gamborg &#39; s soluzione di vitamine per ogni bottiglia e mescolare il mezzo di MS per distribuire uniformemente la soluzione vitamina.</li>
	<li>Versare abbastanza media in piastre a coprire circa la metà della profondità della piastra.</li>
	<li>Lasciate raffreddare a temperatura ambiente per circa 1 h per consentire l'agar solidificare le piastre. 
	Nota: Se le piastre non sono deve essere usato immediatamente, li avvolgono in plastica e conservare a 4 ° C (temperatura del frigorifero). Coperto di piastre, scatole o tubi con agar solidificato possono essere conservati per diverse settimane a 4 ° C in un contenitore ermetico.</li>
</ol> 2. Sterilizzazione dei semi di Arabidopsis con candeggina <ol><li>preparare il MS Piastre conformemente al punto 1 del protocollo. Autoclave 100 mL di acqua distillata allo stesso tempo come i Media di MS. Utilizzare questo più tardi come acqua di risciacquo e consente di sospendere i semi per aiutare nella placcatura. 
	Nota: Se lo si desidera, miscela di agar 0,8% (p/v) (ad es. phytagar) può anche essere autoclavato in questo passaggio. La miscela di agar può essere sostituito con acqua distillata durante placcatura (passo 2.5.3.). La viscosità supplementare della miscela agar rende più facile ai semi di spazio sulla piastra o pianta in righe se necessario.</li>
	<li>Preparare 50% (v/v) di candeggina soluzione da utilizzare per sterilizzare i semi. Per diluire la candeggina, aggiungere 100 mL di candeggina per 100 mL di acqua distillata. Aggiungere 50 µ l di Tween 20 detergente alla soluzione di candeggina. 
	Nota: Soluzione di candeggina preparata può essere conservata per fino a un mese, fino a quando viene aperto solo in condizioni di sterilità.</li>
	<li>Aliquot 100 semi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Sterilizzare i semi utilizzando una soluzione di candeggina al 50%.
	<ol><li>In una cappa a flusso laminare, aggiungere 500 µ l di soluzione di candeggina al 50% per il tubo del microcentrifuge contenente i semi. Toccare il fondo del tubo di sospendere i semi della soluzione di candeggina. 
		Nota: In alternativa, un rotatore o shaker a piattaforma può essere utilizzato per tenere i semi sospesi.</li>
	</ol></li> <li>Risciacquare la soluzione di candeggina dal tubo.
	<ol><li>Dopo 10 min, rimuovere la soluzione di candeggina dal tubo del microcentrifuge utilizzando una pipetta o un aspiratore dotato di un puntale all'estremità.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di acqua distillata sterile al tubo. Tappare la provetta e invertire per mescolare. Consentire semi a depositarsi sul fondo del tubo. Una volta che i semi sono depositati alla parte inferiore del tubo con attenzione rimuovere la soluzione di candeggina di pipettaggio. Ripetere l'operazione di risciacquo processo 6 volte.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di acqua distillata in autoclave al tubo di sospendere i semi.</li>
	</ol></li> <li>Piastra semi sterilizzati sulle piastre di MS.
	<ol><li>In una cappa a flusso laminare, etichettare il fondo del piatto con il nome e la data corrente MS.</li>
		<li>Versare i semi dal tubo del microcentrifuge sulla piastra di MS. Spargere i semi intorno alla piastra di MS utilizzando un'ansa sterile, monouso da inoculo o una pipetta sterile. 
		Nota: Se semi devono essere seminati in righe, può essere utilizzata una pipetta con una punta di 200 µ l di individualmente i semi nelle posizioni desiderate. Per migliorare il flusso di semi, alla fine della punta della pipetta può essere tagliata da 3-5 mm utilizzando le forbici. Ogni seme fuori luogo o grappoli di semi può quindi essere riposizionati o separati utilizzando un'ansa da inoculo monouso sterile.</li>
		<li>Mettere la piastra di MS sul retro della della cappa a flusso laminare con il coperchio chiuso a metà. Permettere all'acqua in eccesso di evaporare dalla piastra MS.</li>
		<li>Mettere il coperchio sulla piastra di MS. Guarnizione piastra MS avvolgendo la piastra con carta microporosa chirurgica nastro (vedere la Tabella materiali).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilizzazione del seme di Arabidopsis con Gas di cloro <ol><li>preparare il MS Piastre conformemente al punto 1 del protocollo. Autoclave 100 mL di acqua distillata allo stesso tempo come la MS Media; Questo verrà utilizzato in seguito per aiutare sospendere i semi per aiutare nella placcatura. 
	Nota: Se lo si desidera, miscela di agar 0,8% (p/v) (ad es. phytagar) può anche essere autoclavato in questo passaggio. La miscela di agar può essere sostituito con acqua distillata durante placcatura (passo 3.6.2.). La viscosità supplementare della miscela agar rende più facile ai semi di spazio sulla piastra o pianta in righe se necessario.</li>
	<li>Prima di iniziare la sterilizzazione, calcolare la quantità di candeggina e acido cloridrico (HCl) per produrre gas di cloro necessaria.
	<ol><li>Calcolare la quantità di HCl necessari per produrre il 6.1% Cl 2 necessaria per la sterilizzazione.</li>
		<li>Utilizzare la seguente formula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> con 7.000 mL come il volume del contenitore di sterilizzazione e 6.1% Cl 2; il volume di HCl è calcolato per essere 3ml. 
		Nota: Un foglio di calcolo programmato per effettuare il calcolo per diversi volumi del contenitore e % Cl 2 viene fornito come supplementare nella tabella 1.</li>
	</ol></li> <li>Aliquot 100 semi in microcentrifuga 0,5 mL. Chiudere i tappi per ciascun flaconcino, posizionare le fiale in un rack di plastica e mettere da parte. 
	Nota: Finché sono memorizzati in opportune condizioni, semi possono essere memorizzati per un periodo prolungato di tempo a questo punto. Condizioni di conservazione possono essere trovate nella sezione 3.3.2 del protocollo di Rivero e colleghi 4. piastra a 96 pozzetti formato può essere utilizzato anche.</li>
	<li>Preparare i materiali necessari per eseguire la sterilizzazione del gas cloro.
	<ol><li>Ottenere candeggina e HCl dalle loro posizioni di archiviazione.</li>
		<li>Taglio una striscia di paraffina grande film (Vedi la Tabella materiali) da utilizzare nel passaggio 3.5.3. per sigillare il contenitore per sterilizzazione.</li>
		<li>Inserire il contenitore di plastica con coperchio in cui la sterilizzazione si svolgerà all'interno di una cappa aspirante. Aprire i tappi su tutti i flaconi di seme e dispongono la cremagliera di seme intero all'interno del contenitore di plastica.</li>
	</ol></li> <li>Eseguire la sterilizzazione del gas di cloro a temperatura ambiente. 
	Attenzione: Lavorare con candeggina e acido separatamente. Non lasciare una bottiglia non livellata per ridurre il rischio di fuoriuscite. Utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) compresi guanti e un camice da laboratorio. Se candeggina o acido spruzza su guanti, cambiare i guanti prima di maneggiare altri materiali. Rimuovere sempre i guanti nella cappa fumi in caso di contaminazione di candeggina o acido.
	<ol><li>Mettere un becher da 250 mL all'interno del contenitore e aggiungere 100 mL di candeggina. 
		Nota: La reazione tra HCl e candeggina richiede almeno 22 volumi eccesso di candeggina. La reazione si consuma l'HCl e candeggina rilasciando gas 2 Cl con acqua e cloruro di sodio (NaCl) come sottoprodotti. Utilizzando un grande eccesso di candeggina consente il consumo di ulteriori HCl durante il periodo di ventilazione, che diminuisce la quantità di sodio bicarbonato (NaHCO 3) necessari per neutralizzare la soluzione per lo smaltimento. 
		Attenzione: Il contenitore dovrebbe essere almeno due volte il volume totale di liquido di candeggina + HCl. Questo impedisce spruzzi evasione Becher durante il passaggio successivo, che possono danneggiare i semi, candeggina vestiti o bruciare la pelle esposta.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di HCl per il becher contenente candeggina. 
		Attenzione: La reazione iniziale produce bolle, soprattutto alle concentrazioni di gas superiore a 6,1%. Un camice a maniche lunghe è necessario per questo passaggio.</li>
		<li>Chiudere il contenitore per sterilizzazione e sigillare con pellicola di paraffina immediatamente.</li>
		<li>Monitorare il contenitore per sterilizzazione durante il tempo di sterilizzazione per garantire l'accumulo di gas; l'accumulo di gas di cloro deve essere visibile come una debole foschia giallo all'interno del contenitore. 
		Attenzione: Controllare periodicamente il contenitore di sterilizzazione per assicurare che la pressione all'interno non ha disarcionato il coperchio o pellicola di paraffina. Se il coperchio è venuto disarcionato o il film di paraffina si è allentato, chiudere il coperchio e avvolgere attentamente il contenitore con un ulteriore strato di pellicola paraffina.</li>
		<li>h dopo l'1-sterilizzazione periodo, aprire il contenitore di rimozione della pellicola di paraffina e aprendo il coperchio su un angolo. Consentire il contenitore sfogare per 3 ore per completare la reazione ed eliminare il gas cloro.</li>
		<li>Chiudere i tappi di tutte le provette microcentrifuga nel rack seme. 
		Nota: Semi sterilizzati possono essere memorizzati fino a tempo di placcatura, purché essi sono immagazzinati in condizione asciutta.</li>
		<li>Rimuovere il rack di seme e posizionarlo in una cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Neutralizzare la reazione del gas cloro <ol><li>aggiungere 1,5 g NaHCO 3 polvere lentamente per il becher contenente la soluzione di candeggina/HCl e mescolare con una bacchetta di vetro per sciogliere il NaHCO 3 nella soluzione. Continuare ad aggiungere NaHCO 3 fino a quando hanno smesso di bolle di gas di anidride carbonica (CO 2) formando. 
			Attenzione: Aggiungere lentamente per evitare schizzi. Uso dei DPI appropriati, compresi i guanti e un camice da laboratorio.</li>
			<li>Verificare il pH della soluzione utilizzando strisce pH o un pH-metro. Aggiungere ulteriori NaHCO 3 se necessario fino a quando il pH della soluzione è neutro (pH 7.0). A questo punto la soluzione può essere rimosso dalla cappa fumi e smaltita secondo le linee guida di smaltimento tutti. 
			Attenzione: Se durante lo smaltimento è notato alcun odore, quindi la soluzione dovrebbe immediatamente essere rinviata per la cappa.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Piastra semi sterilizzati sulle piastre di MS.
	<ol><li>In una cappa a flusso laminare, etichettare il fondo del piatto con il nome e la data corrente MS.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di acqua distillata sterile per ogni tubo del microcentrifuge per sospendere i semi. Versare semi verso la piastra di MS e spargere i semi in modo uniforme intorno alla piastra utilizzando un'ansa sterile, monouso da inoculo o una pipetta sterile.</li>
		<li>Mettere la piastra di MS sul retro della della cappa a flusso laminare con il coperchio chiuso a metà. Permettere all'acqua in eccesso di evaporare dalla piastra MS.</li>
		<li>Mettere il coperchio sulla piastra di MS. Sigillare la piastra MS avvolgendo la piastra con nastro chirurgico di carta microporosa.</li>
	</ol></li></ol> 4. Crescita di Arabidopsis sulle piastre di MS <ol><li>posizionare le piastre con il coperchio sulla parte superiore per tre giorni a 4 ° c e umidità ambiente. 
	Nota: Questo processo si chiama stratificazione e serve per sincronizzare la germinazione dei semi individuali.</li>
	<li>Le piastre di trasferimento per l'ambiente di crescita.
	<ol><li>Mantenere temperatura a 23 ° C e intensità della luce a 120-150 µmol/m 2 s con luce di 16 h / 8h scuro fotoperiodo. Collocare i piatti piatto nell'ambiente crescere con il coperchio sulla parte superiore così le radici si sviluppano nel terreno.</li>
	</ol></li> <li>Let crescono le piantine sulle piastre per 8 giorni. 
	Nota: Un periodo di crescita di 8 giorno permette tardi germinare semi di germinare. Piastre possono essere segnati prima di 8 giorni se tutti i semi hanno germinato.</li>
	<li>Punteggio ottenuto i tassi di germinazione.
	<ol><li>Record il numero di semi che hanno germinato e che non hanno germinato. Tasso di germinazione viene calcolato dividendo il numero di semi germinati per il numero totale di semi sul piatto. 
		Nota: Germinazione viene conteggiato quando la radichetta ha proiettato fuori il cappotto di seme e i due cotiledoni sono visibili.</li>
		<li>Anche contare il numero di semi colpiti da muffa per determinare l'efficacia delle condizioni di sterilizzazione.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando crescere semi di Arabidopsis su terreno sterile, qualche forma di sterilizzazione deve essere applicato. Trattamenti di sterilizzazione di gas sia candeggina e cloro causare inibizione simile di crescita tasso e muffa di germinazione. Nessuno dei due metodi di sterilizzazione causa una riduzione significativa nel tasso di germinazione di semi con alta germinazione potenziale; Tuttavia, candeggina sterilizzazione è consigliata per linee con più basso potenziale di germinazione (20-70%), dovuto la piccola, seppur non significativo, miglioramento nel tasso di germinazione rispetto alla sterilizzazione del gas (Figura 3A).
Semi di Arabidopsis con concentrazioni di candeggina da 40-100% per fino a 10 min di sterilizzazione fornisce percentuali di germinazione soddisfacente e muffa efficace soppressione. Anche se le concentrazioni di candeggina meno del 40% fornire adeguata sterilizzazione per la maggior parte delle partite di sementi, utilizzando una concentrazione di 40% o superiore garantisce una sterilizzazione efficace anche pesantemente contaminati di lotti di sementi. È importante non superare i 10 min di sterilizzazione quando usando candeggina concentrazioni pari o superiori a 80% per evitare difetti di sviluppo del semenzale e semi di alta mortalità.
Il trattamento semi di Arabidopsis con le concentrazioni di gas di cloro del 6,1% e 16,5% per risultati 1H in tassi di germinazione alta e muffa adeguata eliminazione. Concentrazione di gas di cloro basso (2,1%) può essere utilizzato con successo da aumento della durata della sterilizzazione a 3 h.
Quando poche righe devono essere sterilizzati, si consiglia sterilizzazione liquida in una soluzione di candeggina al 50% per 10 min. Per un numero maggiore di righe, sterilizzazione a gas con una concentrazione di gas del 6,1% per 1 h è un'opzione migliore poiché molte linee possono essere sterilizzati in modo facile e veloce con meno manipolazione.
I nostri risultati forniscono condizioni standardizzate per la sterilizzazione sia grande numero di semi di diversi genotipi e i semi con basso potenziale di germinazione. L'unica limitazione di queste tecniche di sterilizzazione è che non possono essere applicati ai semi con tassi di germinazione meno del 20% a causa di mortalità di vasto seme. Metodi alternativi, come sonicazione17, per aumentare il tasso di germinazione in assenza di sterilizzazione potrebbero essere utile in quei casi.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) è un organismo modello privilegiata per la ricerca di base e applicata in pianta biologia1,2,3. Mentre le condizioni standard per crescita di Arabidopsis sono stati affermati4, l'effetto di sterilizzazione di seme sulla vitalità del seme non è stato rigorosamente testato. Terreni solidi in lastre o scatole sono usato ordinariamente per facilitare la crescita delle piantine di Arabidopsis per molte applicazioni sperimentali, come l'identificazione di mutanti omozigoti letale in una popolazione segregating, osservazione dei fenotipi sparare e radice a presto fasi, isolamento del patogeno-libero tessuto, raccolta di grandi quantità di tessuto semenzale, selezione di piante resistenti alla droga o trasformanti e valutazione di germinazione1,2,3,4 . Semi raccolti da piante coltivate in una serra o camera di crescita occasionalmente sono contaminati da microrganismi e polvere. Crescita delle piantine di Arabidopsis su diversi tipi di terreno sterile richiede sterilizzazione preventiva seme per rimuovere i contaminanti microbici quali funghi e batteri presenti sulla superficie del seme. L'uso di un regime di sterilizzazione efficace seme è fondamentale per un equilibrio di alta germinazione, contaminazione minima e la pianta vigorosa crescita.
I due metodi più comuni utilizzati per la sterilizzazione del seme di Arabidopsis sono basati su candeggina commerciale (fase liquida) e gas di cloro (fase gassosa). Varie procedure sono state impiegate per entrambi fase liquida sterilizzazione1,4,5,6,7,8,9 , sterilizzazione del vapore-fase e 10 di Arabidopsis semi8,10,11,12,13,14,15 ,16. Tuttavia, mentre queste procedure sono state efficaci nell'effettuazione sterilizzazione seme dei genotipi utilizzati, un'analisi dettagliata degli effetti di trattamenti diversi sterilizzazione sui semi di differenti genotipi non è stata segnalata. Pertanto, l'ottimizzazione di queste procedure di sterilizzazione è necessaria per definire le condizioni in cui efficiente sterilizzazione è combinato con alta germinabilità.
Centro di risorse biologiche (ABRC) di The Arabidopsis è posizionata per) sperimentare la vitalità di sementi di una varietà di differenti genotipi nel vantaggio raccolta e b) di adottare le procedure di controllo della qualità applicate internamente e in risposta al feedback degli utenti sulla germinazione del seme. Gli obiettivi degli esperimenti presentati qui erano di determinare gli effetti dei vari metodi di sterilizzazione sulla germinazione dei semi di una gamma di Arabidopsis genotipi. Procedure di sterilizzazione ottimizzato che provocare tassi di germinazione di semi di alta mantenendo la contaminazione da agenti patogeni minimal sono presentate per la sterilizzazione a gas sia candeggina e cloro.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana Piantine (Arabidopsis) spesso bisogno di essere coltivato su terreno sterile. Ciò richiede sterilizzazione seme preventiva per prevenire la crescita di contaminanti microbici presenti sulla superficie del seme. Attualmente, i semi di Arabidopsis sono sterilizzati usando due tecniche di sterilizzazione distinti in condizioni che differiscono leggermente tra i laboratori e non sono state standardizzate, spesso con conseguente sterilizzazione solo parzialmente efficace o nella mortalità eccessiva seme. La maggior parte di questi metodi non sono anche facilmente scalabile per un gran numero di linee di semi diversi genotipi. Come tecnologie per analisi di alto-rendimento di Arabidopsis continuano a proliferare, tecniche standardizzate per la sterilizzazione dei numerosi semi di differenti genotipi sono sempre essenziali per lo svolgimento di questi tipi di esperimenti. È stata valutata la risposta di un certo numero di linee di Arabidopsis a due tecniche di sterilizzazione diversi basato sul tasso di germinazione del seme e il livello di contaminazione del seme con microbi ed altri agenti patogeni. I trattamenti incluso diverse concentrazioni di agenti e tempi di esposizione, combinati per determinare le condizioni ottimali per la sterilizzazione del seme di Arabidopsis di sterilizzazione. Sono stati sviluppati protocolli ottimizzati per due metodi di sterilizzazione diversi: candeggina (fase liquida) e cloro (Cl2) gas (fase gassosa), entrambi con conseguente tassi di germinazione di semi di alta e minima contaminazione microbica. L'utilità di questi protocolli è stato illustrato attraverso la sperimentazione di wild type e mutanti semi con una gamma di potenziali di germinazione. I nostri risultati indicano che semi possono essere efficacemente sterilizzati utilizzando qualsiasi metodo senza mortalità eccessiva seme, anche se sono stati osservati effetti nocivi di sterilizzazione per semi con minore potenziale di germinazione ottimale. Inoltre, un'equazione è stata sviluppata per consentire ai ricercatori di applicare le condizioni di sterilizzazione del gas cloro standardizzato per contenitori ermetici di diverse dimensioni. I protocolli descritti qui consentono sterilizzazione seme facile, efficiente e poco costoso per un gran numero di linee di Arabidopsis.

Semi di Arabidopsis raccolti da una camera aperta del campo, serra o crescita a volte sono contaminati da vari microrganismi come batteri e funghi1,4. Così, germinazione di semi sul terreno sterile può essere particolarmente impegnativo a causa della contaminazione delle piastre, soprattutto quando la fornitura di sementi è limitato. Il protocollo ottimizzato per la sterilizzazione a gas candeggina e il cloro, i cui risultati sono presentati qui di seguito, riduce al minimo questo problema e preserva la vitalità dei semi richiesto per le applicazioni ad alta velocità.
Effetti di sterilizzazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Arabidopsis Col-0
Bleach è l'agente più comunemente utilizzato per la sterilizzazione di seme in numerose specie di piante. La concentrazione ottima dell'agente di sterilizzazione e il tempo di esposizione varia tra specie. Diversi protocolli sono stati impiegati con candeggina per la sterilizzazione di Arabidopsis semi1,4,5,6,7,8,9 , 10. quattro differenti concentrazioni di candeggina con cinque tempo di esposizione diversi periodi sono stati testati e i risultati sono presentate in Figura 1. I trattamenti sono stati applicati ai semi di Columbia selvaggio-tipo (Col-0). L'effetto della concentrazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Col-0 varia a seconda del tempo di sterilizzazione, come dimostrato da un'interazione significativa fra concentrazione di candeggina e tempo di sterilizzazione (Figura 1, P &#60; 0.001, ANOVA-analisi della varianza).
Negli esperimenti con tempi di sterilizzazione tra 5 e 10 min, trattamenti con tutte le concentrazioni di candeggina provocato ugualmente alta germinabilità dei semi Col-0 (Figura 1). Tariffe alta germinazione inoltre sono state osservate per le concentrazioni di candeggina per uso domestico del 40% e 50% per tutti i tempi di sterilizzazione. Trattamenti con candeggina 80% e 100% per periodi più lunghi di 10 min ha provocato una significativa diminuiscono del tasso di germinazione rispetto ai tempi di immersione totale (P &#60; 0.01, ANOVA). Inoltre, per l'80% e il 100% di candeggina trattamenti per 20 min, germinazione è stata significativamente diminuita rispetto al corrispondente 40% e 50% candeggina trattamenti (P &#60; 0.001, ANOVA).
Semi vari livelli di candeggio e avvizzimento quando usando candeggina alte concentrazioni per 15 min o più visualizzati. In aggiunta alla relativamente alta (fino a 32%) mortalità seme, semi germinati sterilizzati in queste condizioni spesso ha mostrate i difetti di crescita, si riflette in un fallimento dei cotiledoni e ipocotili per spiegare e allungare, con conseguente arresto dello sviluppo. Maggior parte dei trattamenti (14 su 20) erano completamente privo di muffa, con conseguente muffa livello media complessiva di 0,21% ± 0,003 (tabella 1).
Un trattamento con candeggina al 50% e un tempo di macerazione di 10 min è stato selezionato come il miglior regime di sterilizzazione perché combinato alto tasso di germinazione con buona inibizione di sviluppo del patogeno superficiale. Questo trattamento è stato selezionato per testare l'effetto di sterilizzazione di candeggina su diverse linee mutanti come descritto di seguito.
Effetti della sterilizzazione del gas di cloro sulla germinazione dei semi di Col-0
Per ottimizzare le condizioni di sterilizzazione del gas di cloro, tre differenti concentrazioni di gas di cloro sono state usate per sterilizzare semi Col-0 per due periodi di tempo (tabella 2). La concentrazione di gas è stata calcolata in base il volume di HCl concentrato e il volume del contenitore di sterilizzazione usando la seguente equazione:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Questa equazione è stata derivata utilizzando la legge dei gas perfetti assumendo 12,3 M HCl, una temperatura di 23 ° C e pressione atmosferica standard di 101,3 kPa.
L'effetto della concentrazione di gas di cloro sulla germinazione dei semi di Col-0 è stato indicato per dipendere dal tempo di sterilizzazione, come indicato da un'interazione significativa fra il tempo e i fattori di concentrazione (Figura 2A, P &#60; 0.01, ANOVA) . Concentrazione di gas di cloro ha avuto alcun effetto significativo sulla germinazione dei semi di Col-0 sottoposto a sterilizzazione 1 h. Con questo tempo di sterilizzazione, tutte le concentrazioni di gas di cloro promosso allo stesso modo alti livelli di germinazione, superiore all'85% (P &#62; 0,05, ANOVA). D'altra parte, una sterilizzazione h-lungo 3 ha provocato una diminuzione significativa del tasso di germinazione per la più alta concentrazione di gas di cloro, confrontato con le due concentrazioni più basse di gas (P &#60; 0,05, ANOVA). Questi risultati indicano che i trattamenti di semi di Arabidopsis con una qualsiasi delle concentrazioni del gas di cloro testata per 1 h, o con le concentrazioni di gas inferiore al 16,5% per 3 h, sono ugualmente efficaci nel preservare la vitalità del seme dal momento che i tassi di germinazione erano sempre maggiori al 82%. Tuttavia, semi per 3 h con 16,5% gas di sterilizzazione è stato dannoso per la germinazione dei semi.
Anche l'incidenza di muffa era dipenda sulla concentrazione di gas e tempo di esposizione. Crescita di muffa efficacemente è stata inibita con concentrazioni relativamente elevate di gas di cloro 6,1% e 16,5% per 1 h-lungo trattamento e con tutte le concentrazioni di gas per 3 h (Figura 2B).
Basato su questi risultati, un trattamento con una concentrazione di gas del 6,1% per 1 h (tabella 2) è stato selezionato come la migliore condizione per sterilizzazione a vapore-fase per testare l'effetto di sterilizzazione a gas su diverse linee mutanti, poiché ha combinato (tasso di germinazione alta 85%) con bassissimo livello di contaminazione di muffa (0,02%).
Effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina sui semi con diversi potenziali di germinazione
L'analisi statistica ha mostrato che la risposta di germinazione a metodi di sterilizzazione dipendeva il potenziale di germinazione delle linee (Figura 3A, P &#60; 0.01, ANOVA). Sterilizzazione a gas né candeggina né cloro ridotto tasso di germinazione dei semi con elevato potenziale di germinazione (gruppi di 4 e 5). Né il trattamento ha avuto un effetto sul tasso di germinazione già basso del gruppo con il più basso di germinazionepotenziale (gruppo 1). Al contrario, sterilizzazione del gas di cloro ha provocato una riduzione significativa di circa 12-18% (P &#60; 0.01, ANOVA) nella germinazione dei semi con potenziale di germinazione intermedio (gruppi 2 e 3). Candeggina sterilizzazione inoltre è diminuito tasso di germinazione del 13% del gruppo 2, ma esso non ha fatto diminuire il tasso di germinazione del gruppo 3. Anche se non c'era differenza significativa nel tasso di germinazione tra la candeggina e il cloro trattamenti di gas in qualsiasi gruppo di germinazione (Figura 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), semi sterilizzati con candeggina hanno avuto un leggermente superiore tasso di germinazione di semi sterilizzati con gas in tutti i gruppi di germinazione.
Trattamenti di sterilizzazione alterati significativamente (P &#60; 0.001, ANOVA) la percentuale di semi colpiti da muffa (Figura 3B). Entrambi sterilizzazione di candeggina e gas di cloro ha provocato meno crescita di muffe (P &#60; 0,05, ANOVA) rispetto a nessuna sterilizzazione. Non c'era differenza nel livello di muffa rilevata tra gas e candeggina sterilizzazione in qualsiasi gruppo (Figura 3B, P &#62; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figura 1: gli effetti del tempo di concentrazione e sterilizzazione di candeggina sulla germinazione dei semi di Arabidopsis Col-0. I valori sono mezzi ± SD ottenuta da 5 replicazioni indipendenti dell'esperimento. * indica le differenze significative rispetto a 5min ammollo durata per un intervallo di concentrazioni di candeggina (P &#60; 0.01, ANOVA). #indica le differenze significative di 80% e 100% candeggina concentrazioni rispetto al 40% e 50% per un 20 min periodo di tempo (P &#60; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figura 2: gli effetti del cloro gas concentrazione e sterilizzazione tempo sui semi di Arabidopsis Col-0. (A) (B) muffa livello e tasso di germinazione. Barre di errore rappresentano mezzi ± SD ottenuta da 5 biologici e tecnici 5 replicazioni dell'esperimento. Significa che non condividono una lettera sono significativamente differenti (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figura 3: effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina sui semi con diversi potenziali di germinazione. (A) (B) muffa livello e tasso di germinazione. Le 100 righe di SALK T-DNA sono state classificate in cinque gruppi secondo la loro germinazione potenziale definiti come il tasso di germinazione in assenza di qualsiasi agente di sterilizzazione. I gruppi sulla base del tasso di germinazione erano come segue: gruppo 1 (0-20%), gruppo 2 (21-50%), gruppo 3 (51-70%), gruppo 4 (71-90%) e gruppo 5 (91-100%). Le linee sono stati scelti in modo casuale e loro germinazione potenziale non dipendeva dal genotipo. I valori sono mezzi ± SD ottenuti da tre repliche indipendenti dell'esperimento. Lettere ("a", "ab", "c", ecc.) sopra ogni valore indicano i raggruppamenti statistici dei mezzi di categoria. Significa che non condividono una lettera sono significativamente differenti (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Tempo di sterilizzazione (min)</td>
			<td colspan="4">Concentrazione di candeggina (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0,36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Livello di stampo di candeggina-sterilizzata semi Col-0.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Candeggina</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Tempo</td>
			<td rowspan="2">% Gas di cloro (mol gas totale Cl2/mol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: Cloro (Cl2) gas trattamenti di sterilizzazione sui semi di selvaggio-tipo Columbia utilizzando un contenitore di 7 L.
Supplementare tabella 1: Un foglio di calcolo programmato per effettuare il calcolo per diversi volumi del contenitore e % Cl2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis

L'obiettivo di questo studio era di determinare gli effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina su germinazione del seme di una gamma di Arabidopsis genotipi coltivati in terreno sterile. Sono stati sviluppati protocolli di sterilizzazione ottimizzato per impedire la crescita di contaminanti microbici fornendo al contempo sopravvivenza seme soddisfacente.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.2K Views.  The Ohio State University. L'obiettivo di questo studio era di determinare gli effetti della sterilizzazione del gas di cloro e candeggina su germinazione del seme di una gamma di Arabidopsis genotipi coltivati in terreno sterile. Sono stati sviluppati protocolli di sterilizzazione ottimizzato per impedire la crescita di contaminanti microbici fornendo al contempo sopravvivenza seme soddisfacente.

Video: Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Ricerca

Biologia

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

High-throughput per l&#39;analisi Saccarificazione materiali lignocellulosici

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...