L.K. היא זוכת פרס studentship בוגר אוניברסיטת בריטיש קולומביה מלגת 4 שנים (4YF). L.M.S. הוא הנמען של אגודה הקנדי של גסטרואנטרולוגיה / קרוהן, קוליטיס קנדה / ניו CIHR שכר חוקר פרס הוא מלומד הביו-רפואית של קרן מייקל סמית למחקר בריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרוייקט משירותי הדם הקנדי, בשיתוף עם קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק # CIHR2016-LS).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת בריטיש קולומביה.
1. מח עצם מקרופאג נגזרת והפעלה עם נוגדנים
<ol>
	<li>לבצע המתת חסד באמצעות חנק2 CO.<ol>
		<li>עכבר למקום בלשכת הגיוס. המתת חסד העכבר עם הרדמה איזופלוריין 5%, עבור s 60-90, עד משותק ונושמת עמוק ולאט.</li>
		<li>לבטל את איזופלוריין הרדמה ולפקח על 6-8 L/דקה של CO2 עד העכבר הפסיקה לנשום. יוצאים עכבר עם CO2 לפחות עוד 5 דק. ודא כי קיים כבר לא דופק או נשימה. לבצע תאמת צוואר הרחם כדי להבטיח מוות. הערה: 8-12 שבועות עכברים הישן לספק את התשואה הגבוהה ביותר של מקרופאגים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>לרסס העכבר רגליים עם 70% אתנול, להלביש אותם עם הידיים והרגליים הנמתחת במצב פרקדן מעל לוח מוקצף. עם מספריים, מלקחיים להחזיק את העור, עושים חתך רדוד (0.2 ס מ) כדי להסיר את העור והפרווה מפני השטח של כל אחת הרגליים האחוריות. הערה: לבצע הליך זה ומניפולציות תרביות רקמה כל כיסוי סטרילי.</li>
	<li>חיתוך השריר לחשיפה tibias ועצמות ירך. הסר את tibias ואת עצמות הירך, על ידי חיתוך עצם של השרירים מתחת מפרק הירך מעל הקרסוליים. לקצץ כמה שיותר שרירים ככל האפשר.</li>
	<li>לרסס עצמות עם 70% אתנול ולהמתין 1 דקות עד להתאדות, ולאחר מכן למקם אותם בצלחת טוב 6 של עצם בינוני סומק (של Iscove שונה בינוני של Dulbecco (IMDM), 10% סרום שור עוברית (FBS)).</li>
	<li>חתוך את קצות העצמות על ידי חיתוך 0.1 ס מ של עצם הקרסול, העליון של עצם הירך, כך חלל העצם נחשפת. ודא מח העצם הוא גלוי מחט בקוטר 26 ניתן למקם בחלל העצם.</li>
	<li>חותכים את העצמות, השרירים כדי להפריד את tibias ואת עצמות הירך של המפרקים בברך. הכנס של מחט בקוטר 26 המצורפת מזרק 10 מ"ל לתוך החלל. לרוקן את מח העצם לתוך צינור חרוטי 50 מ ל 5 מ של העצם מיושרות בינוני. ריקון שני tibias ועצמות ירך שני, מעכבר אחד, לתוך כל שפופרת 50 מ.</li>
	<li>Pipette למעלה ולמטה כמה פעמים או מערבולת את מח העצם במהירות איטית כדי לפזר בעדינות גושים. מחרוזות של מח צריך להיות שבור לתוך קטן (פחות מ- 0.5 מ"מ) כתמים של מח. למלא צינור חרוטי כדי 50 מ עם עצם מיושרות בינוני. פיפטה התוכן של הצינור חרוט 75 ס מ2 רקמות בתרבות הבקבוק ובא דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 לשעה. הערה: בוגרת מקרופאגים ותאים mesenchymal יהיה חסיד אל הבקבוק ולא ימחקו, בעוד hematopoietic המוצא לאגס הרצוי להישאר ההשעיה.</li>
	<li>Pipette של המדיום עם אבות hematopoietic לתוך צינור חרוטי 50 מ. Centrifuge הצינור ב g 300 x בטמפרטורת החדר במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של המושבה מקרופאג גירוי בינוני תרבות פקטור (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ננוגרם למ"ל MCSF, פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין ו 150 μM monothioglycerol (mtg ב)).</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות hemocytometer18. הוסף בינוני resuspend לתאים ריכוז של 0.5 x 106 תאים למ"ל, 1.5 x 107 תאים/הבקבוק ב 30 מ של בינוני, ו פיפטה למעלה ולמטה בעדינות. פיפטה 30 מ של ההשעיה לתוך בקבוקון תרביות רקמה מטופלים חדשים 75 ס מ2 .</li>
	<li>ביום 4 וביום 7 אחרי תרבות ראשונית בשלב 1.9, ודא כי התאים הם מחסידי קנים מעט באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר ניגודיות שלב הפוכה. למחוק את המדיום המכילות את התאים הלא-חסיד. לשטוף את התאים עם IMDM פעם אחת, להוסיף 30 מ של MCSF תרבות בינוני.</li>
	<li>כאשר התאים הם בוגרים ביום 10 (&#62; 95% חיובי F4/80 ו- Mac-1), לוודא שוב התאים הם מחסידי במקצת.</li>
	<li>צלחת תאים עבור stimulations, המדיום תרבות להסיר הבקבוקון ולהוסיף 8 מ ל אנזים חינם, מבוסס-EDTA תא דיסוציאציה מאגר (טבלה של חומרים). דגירה את התאים עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>לגרד תאים בעדינות, עם כמות קטנה של לחץ, באמצעות המגרד של התא סטרילי. בדוק במיקרוסקופ זה התאים יש מנותקת השטח את הבקבוק. פיפטה הפומבית תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ. לשטוף את הבקבוק 3 פעמים עם 5 מ של IMDM, בריכה הפתרון שטיפה עם התאים נבצרו. צנטריפוגה תאים ב g x 300 בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של MCSF מדיום תרבות למחזור חרוט 50 מ. ספירת התאים קיימא באמצעות hemocytometer18. Resuspend תאים על ריכוז של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל וצלחת μL 100 של התא השעיה (1 x 105 תאים/טוב) לכל טוב של 96-ובכן רקמות תרבות מטופלים, צלחת התחתון שטוח. הערה: עצמות של עכבר אחד יפיק מספיק תאים 100-וולס. אם רצונך בכך, באפשרותך מצופה 1 מ"ל של תאים בצלחת 6-טוב (תרביות רקמה, שטוח מטופל למטה). מספר גדול יותר של תאים (1 x 106 תאים) עשויה להיות שימושית עבור ניתוחים תספיג חלבון.</li>
	<li>לאחר חסיד, לעורר כפילויות או שהפקידים בארות כל אחד עם 10 ננוגרם למ"ל של LPS ב IMDM, 30 מ"ג/מ"ל של IVIg, או IVIg + LPS. מינונים של LPS או IVIg, יכול להיות טיטרציה כדי למטב את התגובות. השאר כפולים או triplicate בארות כפקדי unstimulated. תקופת דגירה אותם של 24 שעות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2). הערה: תאים מצופים מחדש צריך לדבוק תרביות רקמה בארות בתוך 1 h.</li>
	<li>לאסוף תא supernatants מכל קידוח לתוך צינורות microcentrifuge mL 1.7 בודדים ולהסיר כל חלקיקי מאת ספינינג ב g x 10,000 למשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את התא supernatant, להימנע מהפרעה בגדר. למקם את התא מובהר supernatant בשפופרת microcentrifuge סטרילי. הערה: תא supernatants שניתן לבדיקה ציטוקינים, IL-10 של ציטוקין יחידה משנית, IL-12 / 23p 40, על ידי מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C לטווח ארוך. בצע אליסה פרוטוקול זמינים מסחרית קיט (טבלה של חומרים). ציטוקינים פרו-דלקתיים אחרים יכולים להיות לבדיקה, כגון IL-6 ו- TNF, כפי שהם מופחתים גם על ידי טיפול משותף עם IVIg + גירוי LPS בהשוואה גירוי עם תקליטונים בלבד. לאחר גירוי, תאים חסיד יכול להיות מוכנים טכניקות כגון סופג המערבי או כמותית פולימראז תגובת שרשרת (Q-PCR) 19,20.</li>
</ol>
2. מאתגר עכברים In Vivo עם IVIg קצירת מקרופאגים הצפק
<ol>
	<li>שוקלים כל עכבר.</li></ol>חישוב הנפח של IVIg (ריכוז מניות 100 מ"ג/מ"ל) הדרושים כדי לספק מנה הסופי של 2.5 g/ק ג משקל גוף העכבר כל. הערה: לדוגמה, עבור עכבר 20 גרם, 500 µL של IVIg נדרש.
	<li>צייר הכמות הנדרשת של IVIg לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד 26 סטרילי. קוטר המחט עבור בקרת עכברים אשר לא יקבל IVIg, לנהל אמצעי אחסון המקבילה מנה תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS), pH 7.4 במקום IVIg.</li>
	<li>עורפה העכבר עם יד אחת על-ידי תופס את עורה באחור של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה ממושכת שלה הזנב והרגליים האחוריות עם האצבעות הנותרות. להטות את הגוף שלו לכיוון האדמה.</li>
	<li>מקם את המחט בזווית של 30-40 מעלות ביחס הבטן של העכבר, ברביע התחתון הנכון, מסגרת משופעת למעלה והוסף 1.5 ס מ של המחט. להזריק את IVIg או PBS intraperitoneally. . אני לא. 1 h</li>
	<li>המתת חסד עכברים עם 5% איזופלוריין הרדמה ואחריו 6-8 L/min CO2 חנק (ראה שלבים 1.1.1 - 1.1.2), או בהתאם להנחיות האתית של המוסד.</li>
	<li>להצמיד את העכבר כדי לוח קצף, גפיים פרושים. לרסס את החלקים עם 70% אתנול. הערה: בצע את ההליך בשכונה סטרילי.</li>
	<li>לעשות חתך שטחי של העור (0.2 ס מ) עם מספריים לאורך הקו האמצעי של העכבר, כדי למנוע חיתוך חלל הצפק. משוך את העור בבטן את הבטן של העכבר באמצעות מלקחיים, כך שגלוי הציפוי הפנימי של הקיר הצפק ללא פגע.</li>
	<li>ממלאים מזרק 5 מ ל 5 מ של PBS סטרילי (pH 7.4). הכנס של 25 או 27 מד המחט בחלק העליון של חלל שמאל או צד ימין לעבר המרכז של העכבר עם שפוע של המחט למעלה. הערה: המקום את המחט בקפידה העכבר כך שאתה לא מזריק PBS לתוך האיברים, אך במקום זאת, לחלל הצפק.</li>
	<li>לדחוף את הנוזלים לתוך חלל הצפק. להוציא את המחט החלל ועיסוי של הצפק 10 s כדי לסלק תאים. המחט בחלק העליון של החלל ולהימנע איברים. לאסוף ולמקם נוזל שטיפת התאושש לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על קרח. הערה: עבור כל 5 מ של נוזל מוזרק, כ 3.75 מ ל ניתן לשחזר.</li>
	<li>חזור על הזרקת ושחזור (מדרגות 2.8 2.9) 3 יותר פעמים (נפח הזרקה סך של 20 מ ל), לשחזר 15 מ"ל של נוזל שטיפת בסך הכל. לאסוף שטיפת כל העכבר לתוך צינור חרוטי נפרד 15 מ"ל. הערה: לאחר הזריקה האחרונה, זה עשוי להיות קל יותר לחלץ את הנוזלים מן הצדדים רחוק שמאלה וימינה של העכבר, שבו מצטבר נוזל. האיברים תגרום פחות הפרעות עם מחט בעמדה זו.</li>
	<li>ספין תאים למטה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend תאי μL 500 של ציפוי בינוני (IMDM, 10% FBS ו פניצילין U/mL 100/סטרפטומיצין...) לכל העכבר סמוקות. ספירת מקרופאגים קיימא באמצעות hemocytometer18. הערה: המקרופאגים יהיה מעט גדול יותר מאשר שאר התאים הצפק. התשואה טיפוסי הוא 5 x 105 - עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/עכבר עכבר C57BL/6 פראי סוג. אופציונלי: אם מספר גדול של תאי הדם האדומים נמצאים בבגדר תא, לבצע צעד פירוק כדי להסיר אותם, באמצעות המאגר פירוק של תאי הדם האדומים 1 x על פי הוראות היצרן.</li>
	<li>Resuspend תאי ציפוי בינוני-עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/mL, צלחת μL 100 לכל טוב בצלחת תרביות רקמה מטופלים בתחתית שטוח 96-ובכן. הערה: ייתכן צורך בריכה תאים מן העכבר אחד או יותר עבור ניסוי אם משתמש triplicate בארות או ממריצים titrating. לדוגמה, אם עכבר אחד היו 5 x 105 מקרופאגים, μL 500 של ציפוי בינוני יהיה צורך. יהיו מספיק תאים עבור 5 בארות, או 1 בניסוי כפולות, עם מנה אחת של LPS.</li>
	<li>דגירה תאים עבור h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר מקרופאגים להיות חסיד. התאים חסיד הם המקרופאגים הצפק. הסר תא supernatants ותאים שאינם מחסידי. שטיפה הבארות פעמיים עם 200 μL IMDM (מראש התחמם עד 37 ° C), חכה 10 s לאט להטות את הצלחת. החלף את המדיום ציפוי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות לפני גירוי.</li>
	<li>לעורר את המקרופאגים עם 10 ננוגרם למ"ל של LPS ב- IMDM, או להשאיר unstimulated, בתור פקד. תקופת דגירה של 24 שעות, לאסוף ולהבהיר supernatants תא (ראה שלבים 1.16-1.17) לניתוח ציטוקין IL-10 על ידי אליסה. בצע אליסה פרוטוקול זמינים מסחרית קיט (טבלה של חומרים). הערה: לאחר גירוי, תאים חסיד יכול להיות מוכנים לכל טכניקות כגון תספיג או ה-PCR.</li>

3. מאתגר עכברים in Vivo עם IVIg + LPS קצירת מקרופאגים הצפק
<ol>
	<li>שוקלים כל עכבר. חישוב הנפח של IVIg (ריכוז מניות 100 מ"ג/מ"ל) הדרושים כדי לספק מנה הסופי של 2.5 g/ק ג משקל גוף. לחשב את הסכום של LPS (ריכוז מניות μg/מ ב- IMDM) הדרוש כדי לספק מנה הסופי של 0.2 μg/גרם משקל. הערה: לדוגמה, עבור עכבר 20 גרם, 500 µL של פתרון מניות IVIg, μL 40 של פתרון 100 μg/mL של LPS נדרש.</li>
	<li>לצייר את הכמות הנדרשת של IVIg ולהערכת LPS לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי מצויד 26 סטרילי המחט. עבור בקרת עכברים אשר לא יקבל IVIg, להחליף אמצעי מקביל של IVIg PBS סטרילי pH 7.4.</li>
	<li>עורפה העכבר עם יד אחת על-ידי תופס את עורה באחור של הצוואר עם האגודל והאצבע המורה ממושכת שלה הזנב והרגליים האחוריות עם האצבעות הנותרות. להטות את הגוף שלו לכיוון האדמה.</li>
	<li>מקום המחט בזווית של 30-40 מעלות ביחס הבטן של העכבר, ברביע התחתון הנכון, מסגרת משופעת, ו להוסיף 1.5 ס מ. הכנס IVIg + LPS, או PBS + LPS, intraperitoneally כמו צעד 2.4.</li>
	<li>לאחר 1h, לקצור מקרופאגים הצפק על-ידי ביצוע השלבים 2.5-2.10.</li>
	<li>ספין תאים למטה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. הסר 1 מ"ל של נוזל שטיפת התאושש להשתמש עבור IL-10 וניתוחים IL-12 / 23p 40 מאת אליסה לפי הוראות היצרן או להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס במשך שניתוח. הערה: כדי להבטיח השוואה מדויקת בין הטיפולים לניתוח ציטוקין נוזל שטיפה, לבצע flushs מ של חלל הצפק 4 פעמים עבור אמצעי אחסון הסופי של 15 מ"ל. לא כל נוזל יחולץ מתוך כל סומק.</li>
	<li>כמו צעד 2.11, resuspend ולספור מקרופאגים קיימא. הערה: המקרופאגים יהיה מעט גדול יותר מאשר שאר התאים הצפק.</li></ol>התשואה טיפוסי הוא 5 x 105 - עונה 1 פרק 106 מקרופאגים/עכבר עכבר C57BL/6 פראי סוג. אופציונלי: אם מספר גדול של תאי הדם האדומים נמצאים בבגדר תא, לבצע צעד פירוק לפי הנחיות היצרן כדי להסיר אותם, כמו שלב 2.11.
	<li>כמו צעד 2.12, להשעות מחדש תאי ציפוי בינוני. הערה: יתכן לתאים הבריכה הכרחי מכל עכבר אחד או יותר עבור ניסוי. לדוגמה, אם עכבר אחד היו 5 x 105 מקרופאגים, μL 500 של ציפוי בינוני יהיה צורך.</li>
	<li>כמו 2.13, דגירה תאים עבור h 1-37 ° C 5% CO2 כדי לאפשר מקרופאגים להיות חסיד.</li>
	<li>לאסוף ולהבהיר בינוני ממוזגים, לפי שלבים 1.14-1.15, מכל התאים הצפק. הערה: דגימות עשוי להיות שימוש באופן מיידי או קפוא, מאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לניתוח ציטוקין מאת אליסה.</li>
	<li>בצע את שלב 2.11, אך דגירה תאים עבור unstimulated 24 שעות. לאסוף ולהבהיר תא supernatants, לפי שלבים 1.16-1.17, לניתוח ציטוקין מאת אליסה. הערה: ניתן להכין תאים עבור טכניקות כגון תספיג או PCR, צעדים 1.16-1.17, 2.14.</li>

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation:+time+for+reassessment.">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations.">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+murine+macrophages.">Activation of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gallo, P., Gon&#231;alves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+IgG+density+and+macrophage+Fc+(gamma)+receptor+cross-linking+on+phagocytosis+and+IL-10+production.">The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production.</a> Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+necrosis+factor-&#945;+antibodies+induce+regulatory+macrophages+in+an+Fc+region-dependent+manner.">Anti-tumor necrosis factor-&#945; antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner.</a> Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).</li><li>Kozicky, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+skews+macrophages+to+an+anti-inflammatory,+IL-10-producing+activation+state.">Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+proinflammatory+responses+by+ligating+the+macrophage+Fcgamma+receptor+type+I.">Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I.</a> J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).</li><li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiinflammatory+activity+of+IgG:+the+intravenous+IgG+paradox.">The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox.</a> J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).</li><li>Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immune+globulin+in+autoimmune+and+inflammatory+diseases.">Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases.</a> N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).</li><li>Andersson, J., Skans&#233;n-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immune+globulin+affects+cytokine+production+in+T+lymphocytes+and+monocytes/macrophages.">Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages.</a> Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).</li><li>Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+by+activation+of+repressor+element+GA-12+through+hyperactivation+of+the+ERK+pathway.">Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway.</a> Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).</li><li>Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB1+(p50)+homodimers+differentially+regulate+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+macrophages.">NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages.</a> J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).</li><li>Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+targets+for+mucosal+healing+and+therapy+in+inflammatory+bowel+diseases.">New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).</li><li>Bryant, A., Moore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+and+its+potential+for+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).</li><li>Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+versatile+platforms+for+cancer+immunotherapy.">Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).</li><li>Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+activation+following+macrophage+FcgammaR+ligation+leads+to+chromatin+modifications+at+the+IL-10+locus.">ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus.</a> J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+macrophage+function+with+IgG+immune+complexes.">Modulating macrophage function with IgG immune complexes.</a> J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).</li><li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+interleukin-12+induction+after+macrophage+receptor+ligation.">Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation.</a> J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).</li><li>Riquelme, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-&#947;-induced+iNOS+expression+in+mouse+regulatory+macrophages+prolongs+allograft+survival+in+fully+immunocompetent+recipients.">IFN-&#947;-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients.</a> Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro.">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors.">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li><li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms.">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).</li><li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+intravenous+immunoglobulin.">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li><li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF&#954;B+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin.">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NF&#954;B and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

מקרופאג הפעלה הברית תפקיד חשוב הן רקמה הומאוסטזיס ומחלות22. מקרופאגים יכולים להיות ברורים כמו גם חופפים הברית הפעלה, בהתאם רמזים שלהם microenvironment3. . יש להם תפקידים ברורים בכל שלבי התגובה דלקתיות: ההגנה נגד פתוגנים, פצע ריפוי ורקמות פיצוי, ויש גם מצב הפעלה אנטי דלקתי מ...

המקרופאגים הם תאים חיסוניים מולדת, אשר ממלאים תפקידים מרובים בהתגובה החיסונית זיהום או פגיעה. מקרופאגים אחראים ייזום תגובה חיסונית זיהום או רקמת נזק, לעצור את התגובה דלקתית, וקידום של תגובת ריפוי1. דוגמאות של ההפעלה הטובה ביותר למד מקרופאג שלושת המצבים הם: 1) מקרופאגים שטופלו באינטרפרון גמא (IFNγ) ואת ליפופוליסכריד חיידקי (LPS), המיועד מ' (IFNγ + LPS), אשר תורמים התגובה דלקתית; 2) מקרופאגים מגורה עם אינטרלוקין 4 (IL-4), M(IL-4), בהם יש קשר עם תגובת ריפוי; 3) מקרופאגים מגורה עם מכלולי המערכת החיסונית (IC) ו LPS, מ' (IC + LPS), אשר יש את היכולת לבטל את2,של תגובה דלקתית3. M (IC + LPS) נבדל M(IL-4) פצע ריפוי מקרופאגים, שאינם מבטאים את האנזים arginase (Arg-1) או FIZZ14. הסמן הטוב ביותר של מקרופאגים אנטי דלקתיות אלה הוא הייצור שלהם ציטוקין5. מקרופאגים תפקידים מרובים בשמירה על הבריאות, אבל גם לתרום סרטן3ומחלות דלקתיות. מסיבה זו, המקרופאגים הם מטרה טיפולית מפתח לטיפול במגוון רחב של מחלות. חשוב לחקור את ההשפעות של נוגדנים על מצב ההפעלה שלהם לפתח מקרופאג מבוססי טיפולים למחלה.
המוקד של מאמר זה הוא על השימוש של מח העצם מאתר נגזר מקרופאגים (BMDMs) ו מקרופאגים הצפק כדי לבחון את ההשפעה של תרופות נוגדנים על תגובות דלקתיות חוץ גופית בתוך ועל ויוו. לאחרונה, היו מספר מחקרים המראים את ההשפעות של נוגדנים על מקרופאג הפעלה6,7,8. מקרופאגים מופעל במשותף עם מכלולים חיסוניים, אשר הם נוגדנים ומורכבת עם אנטיגן, ו LPS, גירוי דלקתי בדרך כלל, לייצר רמות גבוהות מאוד של ציטוקין דלקתי, IL-10, רמות נמוכות מאוד של ציטוקינים פרו-דלקתיים. אינטרלוקין 12 (IL-12)9. בנוסף, רמיקייד, של נוגדנים חד שבטיים כנגד TNFα, נמצאה לעבודה, בין השאר, על ידי גרימת מקרופאגים אנטי דלקתיות שלו שבר crystallizable (Fc) אזור7. דיווחנו כי IVIg + LPS זירוז הפעלה מקרופאג אנטי דלקתי הדומה ל- M (IC + LPS), שבו שיתוף מגורה מקרופאגים לייצר כמויות גדולות של IL-10, כמויות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים יחידה משנית אינטרלוקין 12 או 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) ו- TNF8. IVIg היא תרופה מורכבת נוגדנים polyclonal, בעיקר IgG, אשר יש כבר איחדו מהדם של תורמים יותר מ-1,00010. היא משמשת לטיפול במגוון רחב של מחלות חיסוניות, כגון אידיופטית היווצרות קרישי דם, פולינוירופתיה של המיאלין כרונית, אך את מנגנון הפעולה אינה לגמרי מובן11. השפעת סמים נוגדן מבוסס על הפעלת מקרופאג יכול להידרש באמצעות השיטות המתוארות במסמך זה.
ניתן לבדוק זאת ההשפעות של תכשירים ספציפיים על הפעלת macrophage BMDMs, המקרופאגים הצפק. באמצעות מקורות אלה מקרופאג מאפשרת הערכה של ראשי תאים. בדיקה ראשונית של נוגדנים על תאים בתרבית הראשי דורש פחות זמן והשקעה כספית מאשר דגמים אחרים במחלה זמן רב ויקר. על ידי הזרקת תרופה לתוך יישום עכבר בריא ויוו, ואת לבודד את התאים וניתוח אותם ex-vivo, ניתן לקבוע אם מחקרים הם מוצדקת כדי להעריך אם טיפול עם תרופות/מוצרים ביולוגיים משפיע על ההפעלה מקרופאג במודלים של המחלה.
מחקרים מעטים בוחן את ההשפעה של טיפולים ביולוגיים על מקרופאג הפעלה חוץ גופית בתוך ו ויוו ישירות, טכניקות שלנו לספק יתרון על טכניקות חלופיות. טכניקות הנוכחי כוללות השפעות תרופות וחיסונים בדיקה על מעורבות לתאים אוכלוסיות במבחנה, כגון השפעת רמיקייד תגובת לימפוציטים מעורבת (MLR) או IVIg על אנושי מקרופאגים בתאים תאי דם היקפיים, איפה האפקט לא ניתן לייחס ל-7,סוג תא מסוים12. באמצעות BMDMs ו מקרופאגים הצפק יש יתרון על פני שימוש שורות תאים, כגון תאים RAW264.7, אשר אינם מייצרים את ציטוקינים פרו-דלקתיים, IL-12, בתגובה LPS8,13. בדיקת השפעת סם נוגדן מבוסס על מקרופאג תגובות שמחוץ יתרונות בגלל תגובות ציטוקין ניתן לייחס ישירות מקרופאגים, יותר מאשר מסיקים מקרופאג תגובות על ידי מדידת רמות ציטוקינים סרום14 . BMDMs ו מקרופאגים הצפק יכולים להיות נגזר, מבודד עכברים מהונדסים כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של חלבון מקרופאג אנטי דלקתיות הפעלה. לדוגמה, השתמשנו Il10 לקויה(- / -) BMDMs כדי להדגים כי IVIg-induced הפחתה של ייצור ציטוקינים פרו-דלקתיים תלויה חלקית IL-108. מנגנון הפעולה של התרופה יכול ייחקרו באמצעות סופג המערבי, בו ניתן לקבוע את התפקיד של חלבונים ספציפיים ואירועים איתות. ניתן לבצע תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) BMDMs או מקרופאגים הצפק כדי להציג דפוסים של ביטוי גנים כתוצאה מהפעלה נוגדן. מודלים המחלה בעכברים יכול לספק מידע על יעילות פוטנציאל של נוגדן מבוססי טיפולים ביולוגיים במודלים למחלות מעי דלקתיות, דלקת מפרקים שגרונית מחלות סרטן15,16, 17. אולם, מהטכניקות שתוארו כאן יספק מידע על מנגנון הפעולה של תכשירים אלה על-ידי קביעת אם הם זירוז פעילות מקרופאג אנטי דלקתיות.

<table><tbody><tr><td>Iscove&amp;rsquo;s modified Dulbecco&amp;rsquo;s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X red blood cell lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation buffer</td><td>Life technologies</td><td>13150016</td><td>Enzyme-Free, Hanks&#039;s-based, EDTA</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>From E. coli 0127:B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Gammagard liquid)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>IVIg (Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Received from BC Children&#039;s Hospital, Transfusion Medicine</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>mouse IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anti-Erk1/2 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anti-pp38 antibody</td><td>Cell signalling technology</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH antibody</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>26 g needle</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge tube (1.7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;tissue culture treated flask</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>fine tip, dissecting&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Delicate, 4 &lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&quot;</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Inverted phase contrast</td></tr><tr><td>Scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler&amp;nbsp;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

המקרופאגים הם phagocytic תאים חיסוניים מולדת, אשר ליזום תגובות חיסוניות פתוגנים ולתרום פיצוי ריפוי ורקמות. מקרופאגים חשובים באותה מידה ביטול תגובות דלקתיות. הראינו כי מקרופאגים מגורה עם עירוי אימונוגלובולינים (IVIg) ניתן לייצר כמויות גבוהות של ציטוקין דלקתי, אינטרלויקין 10 (IL-10), רמות נמוכות של ציטוקינים פרו-דלקתיים בתגובה lipopolysaccharides חיידקי ( LPS). IVIg היא שנוגדנים ערכיות, בעיקר בנוגדנים Gs (IgGs), איחדו בין הפלזמה של יותר מ-1,000 תורמים דם. הוא משמש כדי להשלים נוגדנים אצל חולים עם ליקויים החיסונית או לדכא את תגובות מערכת החיסון אצל חולים עם תנאים אוטואימוניות או דלקתיות. רמיקייד, נוגדן אלפא (TNFα) גורם טיפולי אנטי הגידול נמק, גם הוכח להפעלת מקרופאגים לייצר IL-10 בתגובה לגירויים דלקתיות. IVIg, תכשירים אחרים נוגדן מבוססי יכול להיבדק כדי לקבוע והשפעותיהם על מקרופאג ההפעלה. מאמר זה מתאר שיטות נגזרת, גירוי של הערכה של מקרופאגים מח עצם מאתר מופעל ע י נוגדנים במבחנה ומקרופגים הצפק מאתר מופעל עם נוגדנים בתוך vivo. לבסוף, נדגים את השימוש סופג המערבי כדי לקבוע את התרומה של תא מסוים מסלולי לפעילות אנטי דלקתיות מקרופאג איתות. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש עם עכברים מהונדסים, כדי לקבוע את ההשפעה של protein(s) ספציפי על הפעלת מקרופאג אנטי דלקתיות. טכניקות אלה יכולים לשמש גם כדי להעריך אם תכשירים ספציפיים רשאית לפעול על-ידי שינוי מקרופאגים למצב IL-10-הפקת הפעלה אנטי דלקתי אשר מפחית את תגובות דלקתיות בתוך vivo. זה יכול לספק מידע על עצמו את התפקיד של הפעלת מקרופאג ביעילותם של תכשירים במהלך המחלה במודלים עכברים, ומספקים תובנה מנגנון חדש פוטנציאלי פעולה אצל אנשים. לעומת זאת, זה ייתכן מתריעים מפני השימוש ביולוגיים מבוססי נוגדן ספציפי לטיפול במחלות זיהומיות, במיוחד אם מקרופאגים לשחק תפקיד חשוב בהגנה מארח נגד הזיהום הזה.

מאתר עצם מח נגזר מקרופאגים יכול להיות מחונן מ מבשרי תא hematopoietic ב aspirates מח עצם מח עצם aspirates איחדו בין עצמות הירך tibias של עכבר C57BL/6 אחד בדרך כלל תשואה 10 מקרופאגים מח עצם נגזר7 , הפיכתם מקור נוח של מקרופאגים לניסויים. BMDMs יכול לשמש כדי לבדוק תגובות סמים נוגדן מבוסס כאשר לערע?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation at JoVE.com

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

נוגדן מבוססי תרופות מהפכה לטיפול במחלות דלקתיות. בנוסף יש השפעה ישירה על מטרות מוגדרות, נוגדנים ניתן להפעיל מקרופאגים להיות אנטי דלקתיות. פרוטוקול זה מתאר איך אנטי דלקתיות מקרופאג ההפעלה יכולה להיות המוערך במבחנה, באמצעות העכבר מח עצם, מאקרופאגים ויוו, באמצעות מקרופאגים הצפק.

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Views.  University of British Columbia. נוגדן מבוססי תרופות מהפכה לטיפול במחלות דלקתיות. בנוסף יש השפעה ישירה על מטרות מוגדרות, נוגדנים ניתן להפעיל מקרופאגים להיות אנטי דלקתיות. פרוטוקול זה מתאר איך אנטי דלקתיות מקרופאג ההפעלה יכולה להיות המוערך במבחנה, באמצעות העכבר מח עצם, מאקרופאגים ויוו,

Video: Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Bioengineering

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

הערכת בדיקה פגוציטית של מקרופאגים הנגזרים ממח עצם בילוד 

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

זרקור על המחבר: פיתוח שיטה ניתנת לשחזור לבידוד מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים ילודים לקידום תגובות חיסוניות בגיל צעיר

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

הערכה של נוגדן מבוססי תרופות השפעות על מח העצם מאתר והפעלה מקרופאג הצפק

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

ההשפעה של נוגדן Anti-c-fms על היווצרות אוסטאוקלסט והתפשטות של קודמן אוסטאוקלסט במבחנה

בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

חיזוי מובהקות נוגדנים של כדוריות דם אדומות באמצעות בדיקת מונוציטים-מקרופאגים