ניסוי זה מדגיש את הערך הטיפולי של נוגדן Anti-c-fms במחלות של הפרעה דלקתית בעצמות, כגון דלקת מפרקים שגרונית ודלקת קרום המוח. התהליך שבו מח עצם מופק המשמש לייצור מבשרי osteoclast, מניב כמויות גדולות של osteoclasts טהור, אשר ניתן להשתמש ביישומים מרובים במורד הזרם. פרוטוקול זה מספק שתי שיטות חלופיות של osteoclastogenesis, או באמצעות ליגנד RANKL או אלפא TNF.
בנוסף לכך, שיטה זו מספקת תובנה לגבי ההשפעה של נוגדן נגד c-fms על osteoclastogenesis. הדגמה חזותית של הליך זה מכירה את החוקר עם תהליך הניתוח וקבלת תאי מח עצם בכמויות גדולות. כדי להתחיל למלא צלחת שתשמש מיכל איסוף עם כ 50 מיליליטר של אלפא MEM, בהתאם לגודל של המיכל, ולה מניחים אותו על קרח.
השתמש סיכות לנקב דרך כפות הידיים והרגליים של עכבר המתת דם כדי לתקן את זה במצב סופי, לרסס ביסודיות עם 70% אתנול. השתמש מספריים כירורגיים סטריליים פינצטה לעשות חתך בעור ברמה של הירך ולהרחיב אותו אל הרגליים, חשיפת השרירים. לאתר לחתוך את הגיד חיבור שריר הארבע ראשי.
לקלף את השריר לחתוך אותו ברמה של הירך. לאחר מכן לאתר את הגיד חיבור שריר הברך לעצם. מקלפים את השרירים החושפים את העצם, ומשחררים את מיתר הברך מההחזקה שלו, ומוודאים לא לחתוך לתוך העצם.
מקם את המספריים בין ראש עצם הירך לבין המרחב המשותף. חותכים לתוכו לשחרר את עצם הירך, אבל שמירה על העצם שלם, אשר יאפשר ניתוק העצמות ללא סיכון של חשיפת מח העצם. חותכים את השרירים המחוברים השוקה באופן דומה.
ואז לחתוך את השוקה ללא ההחזקה שלה במפרק הקרסול, תוך שמירה על העצם שלם, כדי למנוע זיהום. השתמשו בליבי המספריים ומגבוני המעבדה כדי לגרד את כל הרקמה הרכה שנותרה מעצם הירך ומהטיביה ולהניח אותם בצלחת המוכנה עם אלפא MEM המונח על קרח. הניתוח צריך להתבצע בזהירות כדי למזער את הזיהום.
לכן הסרת רקמות רכות יסודית לוקליזציה העצם הם קריטיים. מלא מזרק מחט 30 מד עם אלפא MEM. נתק את השוקה ועצם הירך ממפרק הברך, וגזור את קצות העצם הארוכה משני הצדדים באמצעות מספריים.
השתמש פינצטה להחזיק את העצם מהפיר. הכנס את המחט לחלל מח העצם ושטף באיטיות את תוכן מח העצם לתוך צלחת תרבות של שישה סנטימטרים וחזור על עצמות. העצם תהפוך ללבן, מה שמצביע על החילוץ של כל תוכן מח העצם.
השתמש מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר כדי לאמץ את תמצית מח העצם לתוך צינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי.
כדי לשטוף, להוסיף חמישה מיליליטר של אלפא MEM לכדור. פיפטה התאים כדי לנתק אותם, צנטריפוגה, ולחזור על לשטוף במשך סך של פעמיים. לאחר ספירת תאים מבודדים אלה, כמתואר בכתב היד, זרע 10 מיליון תאים לכל 10 מיליליטר, בצלחת תרבות של 10 ס"מ, והוסף M-CSF לתאים.
דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. הסר את המדיום לאחר שלושה ימים, ולשטוף את התאים פעמיים במרץ עם 10 מיליליטר של PBS כדי להסיר תאים לא עקביים. מוסיפים חמישה מיליליטר של טמפרטורת החדר 0.02% טריפסין-EDTA ו- PBS, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך חמש דקות.
ביסודיות pipette התאים לנתק אותם. שים לב לתרבות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נותקו והופיעו מעוגל וצף במדיה. כאשר התאים נותקו, בטל את התגובה על-ידי הוספת חמישה מיליליטר של אלפא MEM.
לאסוף את התאים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר השלכת supernatant, לשטוף עם חמישה מיליליטר של אלפא MEM, ו צנטריפוגה שוב ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. להשעות מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של אלפא MEM.
זרעים 1 מיליון תאים לכל 10 מיליליטר בצלחת תרבות 10 ס"מ, ולהוסיף M-CSF. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. לקצור את התאים המצורפים, המייצגים BMMs כמבשרי osteoclast לאחר שלושה ימים, כפי שנעשה בעבר במהלך הדור של BMMs.
זרע את BMMs ב 50, 000 תאים לכל 200 מיקרו ליטרים של אלפא MEM בצלחת 96 גם ל הבאר. לכל באר, מוסיפים את הגירויים הרצויים. ולאחר מכן להוסיף M-CSF לריכוז סופי של 100 ננוגרם למיליליטר.
מוסיפים נוגדן נגד c-fms לכל באר. הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני במשך ארבעה ימים, תוך החלפת מדיה כל יומיים במשך ארבעה ימים. ואז להמשיך עם כתמים וראיות, כמתואר בכתב היד.
היווצרות osteoclast בתרבות M-CSF ו RANKL מטופלים, עם נוגדן נגד c-fms, הוערך. עם 101, 000 ננוגרם למיליליטר נוגדן נגד c-fms, ירידה משמעותית במספר osteoclasts נצפתה בהשוואה לשליטה. בעוד שעם אחד מכל 10 ננוגרם לנוגדן אנטי-c-fms מיליליטר, לא הייתה ירידה משמעותית.
לאחר מכן, הוערך היווצרות האוסטאוקלסט בתרבות M-CSF ו- TNF אלפא, עם נוגדן אנטי-c-fms. עם 10, 100, 1, 000 ננוגרם לנוגדן נגד c-fms מיליליטר, ירידה משמעותית במספר osteoclasts נצפתה בהשוואה לשליטה, ללא ירידה משמעותית בננוגרם אחד למיליליטר. ותרבות M-CSF עם 1, 10, 100 ננוגרם לנוגדן אנטי-c-fms מיליליטר, לא הייתה ירידה משמעותית במספר מבשרי osteoclast בהשוואה לשליטה.
עם זאת, ב 1, 000 ננוגרם למיליליטר, חלה ירידה משמעותית במספר מבשרי osteoclast, המציין כי ריכוז גבוה ככל 1, 000 ננוגרם למיליליטר יש צורך לעכב באופן משמעותי התפשטות של מבשרי osteoclast. הקפד לשחרר את הקשרים תוך שמירה על העצם ללא פגע, אשר ימזער את הסיכוי לזיהום.
