עבודה זו נתמכה על ידי &quot;מענק סיוע למחקר&quot; מ קרוהן קוליטיס קרן של קנדה LMS, אשר נתמכת על ידי האגודה הקנדית לגסטרואנטרולוגיה / הקנדי איגוד הבריאות של מחקר / קרוהן ו קוליטיס קרן פרס החוקר חדש בקנדה.

1. המקרופאגים באוזון באמצעות Clodronate המכיל ליפוזומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליפוזומים מאוחסנים 4 ° C. שעתיים לפני ההזרקה, הסר clodronate המכיל ליפוזומים, PBS המכיל ליפוזומים או סטרילית PBS (בקרת הזרקה) מהמקרר כדי לאפשר להם להסתגל לטמפרטורת החדר (18 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את צינורות המכילים ליפוזומים 8-10 פעמים כדי להבטיח חלוקה עוד לפני טעינת 200 μl לתוך מזרק 1 מ&quot;ל. צרף מחט מד 26 לחלק העליון של המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש, בעורפו ביד שמאל את העכבר ממש מתחת לאוזניים המחזיקים העור מספיק כדי לשתק את הראש והגפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטות את העכבר כדי ראשו מעט כלפי מטה, כך האיברים הפנימיים להתרחק הזריקה, הנמצא ברביע הימני התחתון של הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדדים את המזרק בין כפות הידיים שלך להפוך את זה 6 פעמים כדי לפזר את הפתרון liposome לפני באופן שווה כדי הזריקה. </li> &lt;li&gt; להכניס את המחט בצד הימני התחתון של הבטן העכבר בזווית של 30-40 מעלות. להזריק 200 μl של פתרון liposome או PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך המודל דלקת הנגרמת, כמו קוליטיס DSS-Induced, עכברים להזריק 4 ימים לפני הופעת הדלקת ניסיוני על מנת להבטיח צמצום של מקרופאגים תושבים וכל 2 ימים במהלך פרוטוקול לכלות מקרופאגים שחדרו חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הניסוי, יחד עם ניתוחים ניסיוניים המתוכננות, להסיר רקמות מהאתר של עניין ולתקן עם paraformaldehyde לאשר דלדול מקרופאג ידי immunohistochemical מכתים. </li></ol> 2. הגזירה של מקרופאגים מקוטב aspirates מוח עצמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מח העצם מעכברים בין 8 ל 12 שבועות של גיל מספק את התשואה הגבוהה ביותר של מוח עצם שמקורם מקרופאגים. להרדים את העכבר, ולהניח אותה על הגב שלה, להצמיד את רגליו, מותח את איבריו ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה סטרילית הוד, להסיר עצמות הירך ושל tibias, חיתוך משם השריר עד כמה שניתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מח פלאש מהעצמות באמצעות IMDM עם FCS 10% נטען לתוך מזרק 5 מ&quot;ל מצויד במחט 26 מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מח עצם aspirates ל 40 מ&quot;ל ב IMDM עם FCS 10%, תאים במקום ב 75 2 בקבוק ס&quot;מ רקמות תרבות, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 4 שעות. צעד זה מסיר תאים mesenchymal חסיד או מאקרופאגים בוגרים מכל אבות היווצרות הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות העברת supernatant המכיל שאינו חסיד אבות על צינור 50 מ&quot;ל פלקון חרוטי ו צנטריפוגות במשך 5 דקות על סל&quot;ד 1200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תא גלולה של 5 מ&quot;ל IMDM, FCS 10% ו לספור תאים גרעיני על ידי דילול ההשעיה תא 1 ב 20 בחומצה אצטית. הליך זה lyses כל התאים, כולל כדוריות דם אדומות וכן גרעינים הנותרים ניתן לסמוך על hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend בריכוז של 0.5 × 10 6 תאים / מ&quot;ל במדיום מלאה; IMDM, FCS 10%, 150 מיקרומטר monothioglycerol (MTG), ו - 10 ננוגרם / מ&quot;ל ​​או MCSF, GM-CSF, או IL-3. MCSF הנגזרות מקרופאגים מופעלים קלאסי מקרופאגים בעוד מקרופאגים GM-CSF או IL-3-הנגזרות מופעלים לסירוגין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני ביום 4, מסתובב כלפי מטה לא חסיד התאים ומחזיר אותם בבקבוק, ואת יום ב 7, משליכים לא חסיד תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, IFNγ (10 ng / ml) או IL-4 (10 ng / ml) ניתן להוסיף שהכילו MCSF הנגזרות תאים ביום 7 כדי ליצור הטיה המקרופאגים כדי להפעיל קלאסי או הפנוטיפ מופעל לחילופין, בהתאמה. דגירה התאים למשך 3 ימים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 10, להסיר תאים התקשורת ולהרים את הבקבוק של רקמת התרבות באמצעות סלולרי דיסוציאציה חוצץ (Gibco-BRL). מקום 5 מ&quot;ל של המאגר על תאים של 5 דקות בטמפרטורת החדר (18 מעלות) ואז לדפוק את הצד של הבקבוק עם העקב של כף היד מספר פעמים בחוזקה. ודא כי התאים לא המריא של הבקבוק על ידי בחינת הבקבוק תחתמיקרוסקופ. Pipet resuspended התאים לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל פלקון חרוטי ולשטוף את הבקבוק עם 10 מ&quot;ל נוספים של IMDM, 10% FBS. בריכת ומסובב את התאים דקות ב 300 × 5 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים קיימא באמצעות hemocytometer ו resuspend בריכוז של 10 -7 תאים / מ&quot;ל PBS סטרילית pH7.4. מקרופאגים מוכנים להזרקה לעכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמורת 1.0 × 10 6 מקרופאגים להערכת פנוטיפ מקרופגים. מקרופאגים מופעל קלאסי מגורה עם מפרישים רמות גבוהות של lipopolysaccharide תחמוצת החנקן ורמות IL-12p70 נמוך של IL-10 לעומת מקרופאגים המופעלים לסירוגין. מקרופאגים מופעל לחילופין constitutively להביע YM1 ו arginase אני (ArgI), אשר ניתן לאתרם באמצעות Western immunoblotting. </li></ol> 3. Tranferring המקרופאגים לעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרופאגים Resuspend ב PBS סטרילית בריכוז של 10 7 תאים למ&quot;ל. זה מאפשר בהזרקת travenous של 10 6 מקרופאגים בנפח כולל של 100 μl, שהוא נפח כי ניתן להזריק באופן שליו ובטוח לעכברים ידי וריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים חמים באמצעות כרית חימום או הברכיים חום למשך 5-10 דקות כדי להרחיב את הווריד הזנב. לפקח על העכבר בכל עת סימנים של היפרתרמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר על המכשיר הרחקה המאפשר גישה הוורידים הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הזנב 90 ° כך הווריד פונה כלפי מעלה. ורידים רוחבית להפעיל את שני צידי הזנב ו או וריד ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את ההזרקה עם ספוגית אלכוהול לאט להזריק 100 μl (10 6 מקרופאגים) באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט 26 או 28 מד. הכנס את המחט עם הצד שיפוע כלפי מעלה בזווית קלה, כמעט במקביל הוריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המחט מוחדרת כראוי התנגדות צריך להיות לבד ברוח צריך להיות ברור לאחר ההזרקה. אם המחט אינהוריד, הזנב יהיה הבליטה. אם זה יקרה, להוציא את המחט ולנסות שוב הפרוקסימלי לניסיון האחרון או ברוח אחרת. מחט חדשה יש להשתמש עבור כל הזרקה כמו הזנב הוא קשוח המחטים להיות משעמם במהירות במהלך ההזרקה לווריד הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הזריקה, להוציא את המחט, להפעיל לחץ עדין על הזריקה עד שהדימום ייפסק, ולנטר את העכבר על 5min נוסף על מנת להבטיח כי הדימום הפסיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על זריקות מקרופאג כל 4 ימים על מנת להבטיח אספקה ​​רציפה של מקרופאגים מקוטב במהלך ההליך הניסויי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הניסוי, יחד עם ניתוחים ניסיוניים, להסיר רקמות מהאתר של עניין ולתקן עם paraformaldehyde או פורמלין כדי לאשר משלוח יעיל של מקרופאגים מקוטב על ידי immunohistochemical מכתים. </li></ol> 4. נציג תוצאות מספר הפנוטיפ של macrop תושבhages ברקמות נתון תלוי הרקמה נבחנות ו ישתנה בזמן זיהום או דלקת. כמו כן, היכולת של clodronate המכיל ליפוזומים לכלות מקרופאגים מרקמות יהיה תלוי במסלול של ניהול ואספקה ​​יעילה לרקמת המטרה. הזרקת Intraperitoneal של clodronate המכילים תוצאות ליפוזומים לירידה F4/80 + מקרופאגים במעי הגס העכבר במהלך קוליטיס DSS-Induced ניכר ידי מכתים immunohistochemical לסמן מקרופאג, F4/80 (איור 1 א). צביעה היסטולוגית יכול לשמש גם כדי לקבוע הבדלים כמותיים במספר מקרופאג ו פנוטיפ בסעיפים רקמות. איור 1 ב מראה כי בממוצע 55% של מקרופאגים תיגמר ידי clodronate המכיל ליפוזומים לעומת דלדול לא זוהה נקודתיים העכבר כאשר העכברים מוזרקים עם PBS לבד כמו בקרת זריקה. כל ערך נקבע על פי ספירת F4/80 ו ArgI כתםאד תאים חיוביים בסעיפים רקמות סדרתי של 6 עכברים ב 3 נקודות, ב 3 חלקים לכל עכבר עם ספירת המבוצעת על ידי שני אנשים שהתעוורו למצב הניסוי. תוצאות אלו מראות כי זריקות intraperitoneal של ליפוזומים clodronate לרוקן מקרופאגים הגס בעכברים. גזירת מקרופאגים ממח העצם בנוכחות גורמי גדילה שונים מקרופאגים תשואות המופעלים קלאסי (MCSF הנגזרות או MCSF הנגזרות ומטופל עם IFNγ) או לחלופין להפעיל (GM-CSF או IL-3-derived או MCSF הנגזרות ו מטופלים עם IL-4). שטיפה מח עצם מ -2 עצמות הירך ו -2 tibias של העכבר בן 8 שבועות בדרך כלל מניבה 6 × 10 7 התאים בעלי הגרעין לכל עכבר ותשואות 8 × 10 6 MCSF הנגזרות מקרופאגים, 10 × 10 6 GM-CSF הנגזרות מקרופאגים, או 12 × 10 6 IL-3-הנגזרות מקרופאגים. איור 2 א מראה הניטריט ויחס IL-12p70/IL-10 ב מקרופאג לסעודernatants שטופלו lipopolysaccharide במשך 24 שעות 2B איור מראה אופייני ניתוח כתם המערבי של 0.5 × 10 6 מקרופאגים MCSF + / -. IL-4 תנאי הגזירה נחקר עם נוגדנים סמנים מקרופאג מופעל לחילופין, ArgI, YM1, או עם GAPDH כמו טעינה מלאה. נתונים אלה מראים כי מוח עצם שמקורם מקרופאגים יכול להיות מוטה על הפנוטיפ מקוטב במהלך הגזירה. העברה יעילה של מקרופאגים לשעבר ב vivo מקוטב הנגזרות לרקמות תלוי במסלול של ניהול גישה רקמות. במהלך קוליטיס DSS-Induced, מקרופאגים מוזרק לווריד לנסוע לאתר של דלקת מקרופאגים מופעל לחילופין להפחית את חומרת המחלה. 3A באיור ניתן לראות את המספר הכולל של מקרופאגים ומספר מקרופאגים ArgI + (מופעל לחילופין) שנמנו בסעיפים היסטולוגית של עכברים שהוזרק עם מקוטב מח עצםהנגזרות מקרופאגים. ההשפעה של העברת מקרופאגים מקוטב אל המעי הגס במהלך קוליטיס DSS-Induced מוצג במדד פעילות המחלה, ציון תוסף על בסיס ירידה במשקל, דימום רקטלי, ועקביות שרפרף קטן (איור 3 ב). תוצאות אלו מראות כי vivo לשעבר נגזרים, מקרופאגים שהועברו adoptively תנועה המעי הגס ודלקת הפגיעה הנגרמת יכול. מקרופאגים M1 לא להשפיע על דלקת ואילו מקרופאגים מסוג M2 להפחית באופן משמעותי את פעילות המחלה ראשי. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Clodronate המכיל ליפוזומים ביעילות לרוקן F4/80 + ו-F480 + + ArgI התאים נקודתיים עכבר in vivo. בדור F2 של עכברים מסוג בר על C57BL מעורבת / 6 × רקע 129Sv קיבלו DSS 5% למשך 7 ימים ו-IP הזריקו PBS (בקרה) או clodronate המכיל ליפוזומים (Clodronate) 4 ימים לפני הטיפול DSSעל 0 ימים, 2, 4, ו -6 במהלך הטיפול DSS. (א) נקודתיים הוסרו קבועה, וחתכים הוכתמו על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור מקרופאגים בוגרים (F4/80) וכן את הסמן מקרופאג M2, ArgI. (ב) לכמת את F4/80 + ו + ArgI מקרופאגים. תאים מוכתמים חיובי נספרו על ידי שני אנשים שהתעוורו למצב ניסיוני בהגדלה 40 × 6 שדות ב 3 חלקים / עכבר ומ 6 עכברים / קבוצה. * P &lt;0.01. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. MCSF הנגזרות מקרופאגים להביע פנוטיפ מופעל קלאסי ו MCSF הנגזרות מקרופאגים שטופלו IL-4 להביע את הפנוטיפ מקרופאג מופעל לחילופין. (א) בהתאם פנוטיפ מופעל קלאסי, MCSF הנגזרות מקרופאגים לייצר רמות גבוהות של תחמוצת החנקן בתגובה lipopolysaccharide והוא יכול להימדד על ידי assay Griess, אשר מזהה המטבוליט במורד הזרם שלו, הניטריט. הם ALSהו לייצר יחס IL-12p70/IL-10 גבוה, אשר ניתן למדוד ELISA. * P &lt;0.01 עבור n = 3. (ב) בהתאם פנוטיפ מופעל לחילופין, MCSF הנגזרות מקרופאגים שטופלו IL-4 constitutively אקספרס YM1 ו ArgI, אשר ניתן לאתרם באמצעות immunoblotting המערבי. הנתונים מייצגים 3 ניסויים בלתי תלויים עם תוצאות דומות. <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. מוזרק תוך ורידי, לשעבר vivo הנגזרות מופעל לחילופין התנועה מקרופאגים המעי הגס ולהפחית דלקות מעיים. בדור F2 של עכברים מסוג בר על C57BL מעורבת / 6 × 129Sv רקע קיבלו 5% DSS במי השתייה שלהם במשך שישה ימים. מקרופאגים M1 ו-M2 הוזרקו IV על 0 ימים ו -4 במהלך הטיפול DSS. (א) נקודתיים הוסרו קבועה, וחתכים הוכתמו על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור מקרופאגים בוגרים (F4/80) ו סמן מקרופאג M2 (ArgI).Quantitation של מקרופאגים של עכברים שליטה הזריק PBS (C), עכברים שהוזרק עם מקרופאגים M1 (M1 +) ועכברים הזריקו מקרופאגים M2 (+ M2) בוצעו על ידי ספירת התאים מוכתמים חיובי בהגדלה 40 × ב 6 שדות מ -3 חלקים / עכבר מ 6 עכברים / קבוצה. הספירה נערך על ידי שני אנשים שהתעוורו למצב ניסיוני. (ב) פעילות המחלה היה פיקוח והבקיע מדי יום במהלך הטיפול היא ציון תוסף על בסיס ירידה במשקל, דימום רקטלי, ועקביות שרפרף קטן. * P &lt;0.05 עבור n = 6 עכברים ב -2 ניסויים בלתי תלויים.

<ol>
	<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages.">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li><li>Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+dendritic+cells,+macrophages,+and+epithelial+cells+in+the+gut:+implications+for+immune+tolerance.">Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance.</a> Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).</li><li>Heinsbroek, S. E., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+macrophages+in+inflammatory+bowel+diseases.">The role of macrophages in inflammatory bowel diseases.</a> Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).</li><li>Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+putative+role+of+inflammation+in+the+irritable+bowel+syndrome.">The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome.</a> Gut. 49, 743-745 (2001).</li><li>Maeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+cancer-derived+factors+activate+NF-kappaB+in+myeloid+cells+via+TLR2+to+link+inflammation+and+tumorigenesis.">Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis.</a> Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).</li><li>van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes:+perspectives+in+research+and+therapeutics.">Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics.</a> J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).</li><li>Hunter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-derived+alternatively+activated+macrophages+reduce+colonic+inflammation+in+mice.">In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice.</a> Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHIP-deficient,+alternatively+activated+macrophages+protect+mice+during+DSS-induced+colitis.">SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis.</a> J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).</li><li>Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+experimental+colitis+by+intestinal+mononuclear+phagocytes.">Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).</li><li>Van Rooijen, N., Sanders, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+mediated+depletion+of+macrophages:+mechanism+of+action,+preparation+of+liposomes+and+applications.">Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications.</a> J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).</li><li>Smith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+with+a+helminth+parasite+prevents+experimental+colitis+via+a+macrophage-mediated+mechanism.">Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism.</a> J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).</li><li>van Rooijen, N., Hendrikx, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+for+specific+depletion+of+macrophages+from+organs+and+tissues.">Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).</li><li>Kataoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+vitreal+macrophages+and+circulating+leukocytes+in+retinal+neovascularization.">The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).</li><li>Weisser, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+activation+of+macrophages+by+IL-4+requires+SHIP+degradation.">Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation.</a> Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).</li><li>Cailhier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+macrophage+ablation+demonstrates+that+resident+macrophages+initiate+acute+peritoneal+inflammation.">Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation.</a> J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

מקרופאגים הם תאים phagocytic כי לשחק תפקיד חשוב במערכת החיסונית. הם אחראים ליזום את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. בדרך כלל, מקרופאגים מופעל קלאסי מופעלים על ידי IFNγ או LPS ואחראים על סילוק פתוגנים גובר תגובה דלקתית 1. לעומת זאת, מקרופאגים מופ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Clodronate המכיל ליפוזומים </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS המכיל ליפוזומים </td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> סטרילית PBS pH7.4 </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen </td><td> 12440 </td></tr><tr><td> העובר עגל סרום (FCS) </td><td> Invitrogen </td><td> 12483 </td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td> Monothioglycerol (MTG) </td><td> סיגמא </td><td> 96-275 </td></tr><tr><td> Recombinant Murine MCSF </td><td> Stemcell טכנולוגיות </td><td> 02951 </td></tr><tr><td> רקומביננטי Murine GM-CSF </td><td> Stemcell טכנולוגיות </td><td> 02935 </td></tr><tr><td> רקומביננטי Murine IL-3 </td><td> Stemcell טכנולוגיות </td><td> 02903 </td></tr><tr><td> רקומביננטי Murine IFNγ </td><td> Stemcell טכנולוגיות </td><td> 02746 </td></tr><tr><td> רקומביננטי IL-4 Murine </td><td> Stemcell טכנולוגיות </td><td> 02714 </td></tr><tr><td> תא דיסוציאציה מאגר </td><td> Invitrogen </td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td> להלשין anti-F4/80 נוגדן </td><td> עבד Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td> עכבר נגד ArgI נוגדן </td><td> BD מעבדות התמרה </td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים המסוים של פרוטוקול זה.

depletion and reconstitution of macrophages in mice

מקרופאגים הם שחקנים קריטיים בתגובה החיסון המולדת לאתגר פגיעה זיהומית או, שיזם את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. מקרופאג תפקוד יכול להוביל לחוסר יכולת לעלות תגובה חיסונית מתאימה, וככזה, היה מעורב בתהליכים מחלות רבות, כולל מחלות מעי דלקתיות. מקרופאגים להציג פנוטיפים מקוטב כי המחולקים באופן כללי לשני סוגים. מקרופאגים מופעל קלאסי, מופעל על ידי גירוי עם IFNγ או LPS, לשחק תפקיד חיוני בתגובה לאתגר חיידקי בעוד מקרופאגים מופעל לחילופין, מופעלים על ידי IL-4 או IL-13, להשתתף פסולת הדחה שיפוץ רקמות היו מעורבים בהחלטה השלב של דלקת. במהלך התגובה הדלקתית in vivo, מקרופאגים נמצאים בתוך תערובת מורכבת של חדירת תאים חיסוניים ועשוי להשתתף ידי העצמת או resolvinגרם לדלקת. כדי להגדיר את התפקיד של מקרופאגים באתרו במודל חיה שלמה, יש צורך לבחון את ההשפעה של ומכלה מקרופאגים מהסביבה מורכב. לשאול שאלות על תפקידו של הפנוטיפ מקרופאג באתרו, מקרופאגים מקוטב מוגדרים phenotypically ניתן לגזור vivo לשעבר, החל aspirates מח עצם והוסיף בחזרה עכברים, עם או בלי דלדול מראש של מקרופאגים. בפרוטוקול שהוצג clodronate המכיל ליפוזומים, לעומת שולטת PBS מוזרק, שימשו כדי לרוקן מקרופאגים הגס במהלך נתרן גופרתי dextran (DSS) הנגרמת קוליטיס בעכברים. בנוסף, מקרופאגים מקוטב נגזרו vivo לשעבר והועבר עכברים על ידי הזרקה תוך ורידית. הערת אזהרה על גישה זו היא כי clodronate המכיל ליפוזומים לרוקן את כל phagocytes מקצועיים, כולל שני תאים דנדריטים ומקרופגים כך כדי להבטיח את האפקט שנצפה על ידי דלדול הוא מקרופאג ספציפי, הכינון מחדש Oפנוטיפ F על ידי העברת המאמצת של מקרופאגים הכרחי. דלדול מקרופאג מערכתית בעכברים יכול גם להיות מושגת על ידי עכברים backcrossing על רקע CD11b-DTR, שהיא גישה משלימה מצוינת. היתרון של clodronate המכיל דלדול liposome בתיווך הוא שהיא אינה דורשת את הזמן ואת חשבון מעורב עכברים backcrossing והוא ניתן להשתמש בעכברים ללא קשר לרקע של העכברים (C57BL / 6, BALB / c, או רקע מעורב ).

Watch this Scientific Journal Video about Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice at JoVE.com

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה מקרופאגים<em&gt; In vivo</em&gt;, הנובעת מקרופאגים מקוטב aspirates מח עצם, adoptively העברת מקרופאגים לעכברים. טכניקות אלו מאפשרים קביעת התפקיד מקרופאגים מקוטב לשחק בריאות ומחלות.

דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

depletion-and-reconstitution-of-macrophages-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K Views.  University of British Columbia. מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה מקרופאגים In vivo, הנובעת מקרופאגים מקוטב aspirates מח עצם, adoptively העברת מקרופאגים לעכברים. טכניקות אלו מאפשרים קביעת התפקיד מקרופאגים מקוטב לשחק בריאות ומחלות.

Video: Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

שימוש של<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; כדי לחקור אינטראקציות Autophagy-נוגדנים

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

תאי מציגי הרוצח המלאכותי Antigen (KaAPC) ליעיל<em&gt; במבחנה</em&gt; דלדול של תאי T אנושי אנטיגן ספציפי

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

כוונון הירידה כדי להשיג חלבון ספציפי ויעיל המחסור

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...