L.K. British Columbia Üniversitesi 4 yıllık arkadaş grubu (4YF) lisansüstü öğrencilik Ödülü alıcı olduğunu. L.M.S. olduğunu Kanadalı bir Gastroenteroloji Derneği alıcı / Crohn ve kolit Kanada / CIHR yeni araştırmacı maaş Ödülü ve biyomedikal bilim adamı Michael Smith Vakfı Sağlık Araştırma için. Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık (# CIHR2016-LS vermek) araştırma ile işbirliği içinde Kanada kan Hizmetleri, bir proje hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kemik iliği makrofaj türetme ve ile antikor etkinleştirme
<ol>
	<li>Ötenazi CO2 boğulma kullanarak gerçekleştirin.<ol>
		<li>İndüksiyon odasında yerde fare. Derin ve yavaş hareketsiz ve nefes kadar fare ile 60-90 s, % 5 isoflurane anestezi ötenazi.</li>
		<li>İsoflurane anestezi açmak ve fare nefes durana kadar 6-8 L/dak CO2 yönetmek. Fare CO2 ile en az 5 dk. doğrula için orada olduğunu artık bir kalp atışı veya solunum çıkarma. Ölüm sağlamak için servikal yerindençıkmasına gerçekleştirin. Not: 8-12 hafta yaşlı fareler makrofajlar en yüksek verimi sağlamak.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprey fare bacaklar % 70 etanol ve sırtüstü pozisyonda bir köpük tahta üzerinde onlarla kollar ve bacaklar gergin PIN ile. Makas ve cilt tutulacağı pensler, deri ve kürk her şiir yüzeyinden kaldırmak için sığ kesim (0.2 cm) olun. Not: Bu yordam ve tüm doku kültürü manipülasyonlar steril bir mahallede gerçekleştirin.</li>
	<li>Yırtılmalarıteşhis ve uyluk görünür kılmak için kas kırpın. Yırtılmalarıteşhis ve uyluk, kemik ve kas Kalça eklemi hemen altında ve ayak bilekleri üzerinde keserek çıkarın. Mümkün olduğu kadar kas döşeme.</li>
	<li>Kemikleri % 70 etanol ile sprey ve buharlaşmasına sonra kemik floş orta (Iscove'nın Dulbecco'nın orta (IMDM), % 10 fetal sığır serum (FBS) değiştirilmiş) 6 iyi tabağına koyup 1 dakika bekleyin.</li>
	<li>Kemikleri biter böylece kemik boşluğu maruz kemik ayak bileği ve femur üst kapalı 0.1 cm kesim tarafından kırpın. Kemik iliği görülür ve 26 gauge iğne-ebilmek var olmak konulmak kemik boşluğunda emin olun.</li>
	<li>Kemikler ve kaslar yırtılmalarıteşhis ve kalça diz eklemleri dan ayırmak için kesti. Bir 10 mL şırınga boşluğuna bağlı 26 gauge iğne yerleştirin. Kemik iliği kemiğin floş orta 5 mL ile 50 mL konik tüp içine sifonu çek. İki yırtılmalarıteşhis ve bir fareden iki uyluk her 50 mL tüp içine boşalt.</li>
	<li>Yukarı ve aşağı birkaç kez veya girdap yavaşça kümeleri dağıtmak için yavaş hızda iliği pipette. Dizeleri iliği kemik iliği küçük (daha az 0,5 mm) lekeler kırık. 50 ml konik tüp floş orta kemik ile doldurun. Konik tüp 75 cm2 doku kültürü içine içeriğini pipet şişesi tedavi ve 37 ° c, % 5 CO2 1 h için kuluçkaya. Not: Olgun makrofaj ve Mezenkimal hücreler olacak şişeye yapışık ve atılır, istenen hematopoetik ataları süspansiyon kalırken.</li>
	<li>Hematopoetik ataları ile orta 50 mL konik tüp içine pipette. 300 x g, oda sıcaklığında 5 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) kültür orta 5 mL resuspend (IMDM, %10 FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 150 mikron monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Bir hemasitometre18kullanarak hücreleri saymak. 0.5 x 106 hücre/mL, 1.5 x 107 hücreler/şişeye 30 mL orta, bir konsantrasyon hücrelere resuspend ve yukarı ve aşağı yavaşça pipet için orta ekleyin. 30 mL süspansiyon yeni bir 75 cm2 doku kültürü tedavi şişe pipet.</li>
	<li>4. gün ve 7 gün sonra ilk adım 1.9 kültüründe, hücreleri yapışık ve biraz dallı bir ters faz kontrast parlak alan mikroskop kullanarak olduğundan emin olun. Yapışık olmayan hücreleri içeren orta atın. IMDM hücrelerle bir kez yıkama ve MCSF kültür orta 30 mL ekleyin.</li>
	<li>Ne zaman hücreleri olgun 10 gün (&#62; % 95'i F4/80 ve Mac-1 için pozitif), tekrar hücreleri olduğunu doğrulayın yapışık ve biraz.</li>
	<li>Hücreler elektrodlar için plaka, kültür orta balonun kaldır ve enzim ücretsiz, EDTA tabanlı cep ayrılma arabelleği (Tablo reçetesi) 8 mL eklemek için. 37 ° c, % 5 CO25 min için hücreleri kuluçkaya.</li>
	<li>Hücreleri nazikçe, basınç, steril hücre kazıyıcı kullanarak küçük bir miktar ile kazı. Hücreleri şişesi yüzeyden ayırdıktan mikroskop iade edin. Disosiye hücreleri 50 mL konik tüp içine pipet. Şişesi 3 kez 5 mL IMDM de ile durulayın ve durulama çözüm hasat edildi hücreleri ile havuz. 300 x g 5 min için oda sıcaklığında hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Hücre Pelet MCSF kültür orta 50 mL konik tüp başına 3 mL resuspend. Bir hemasitometre18kullanarak canlı hücreleri hesaplama. 1 x 106 hücre/mL ve plaka 100 μL hücre süspansiyon (1 x 105 hücreleri/de) bir konsantrasyon hücreleri bir 96-iyi doku kültürü düz alt plaka tedavi, kuyu resuspend. Not: Bir fare kemiklerinden 100 kuyuları için yeterince hücre üretir. İstenirse, hücre 1 mL 6-şey plaka (doku kültürü tedavi, düz alt) kaplama. Hücreler (1 x 106 hücreleri) daha çok sayıda Batı Leke analizleri için yararlı olabilir.</li>
	<li>Yapisan bir kez yinelenen veya onaylatılacak Wells'le her 10 ng/mL IMDM, 30 mg/mL IVIG, veya IVIG + LPS LPS teşvik. LPS veya IVIG dozlarda yanıt optimize etmek için titre. Yinelenen veya onaylatılacak kuyu unstimulated denetimi olarak bırakın. Onları 24 saat (37 ° C, % 5 CO2) kuluçkaya. Not: Yeniden kaplama hücre doku kültürü wells 1s içinde uygun olmalıdır.</li>
	<li>Hücre supernatants her kuyudan bireysel 1.7 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak ve Partiküler madde herhangi bir iplik 10.000 x g 5 min için de çıkarın.</li>
	<li>Hücre süpernatant kaldırmak ve Pelet rahatsız edici kaçının. Açıklanan bir steril microcentrifuge tüp süpernatant yerleştirin. Not: Cep supernatants sitokinler, IL-10 ve sitokin alt birimi, IL-12/23 p 40, enzim bağlı immunosorbent assay tarafından (ELISA) hemen denetlesinler, veya-80 ° C uzun vadeli saklı. ELISA Protokolü piyasada bulunan Seti'nden (Tablo reçetesi) izleyin. Diğer pro-inflamatuar sitokinlerin, Il-6 ve TNF, gibi denetlesinler gibi onlar da IVIG ile ortak tedavi tarafından azaltılır + LPS stimülasyon ile karşılaştırıldığında stimülasyon ile LPS yalnız. Stimülasyon sonra yapışık hücreleri western Blot veya nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) 19,20gibi teknikleri için hazırlanabilir.</li>
</ol>
2. fare Vivo içinde IVIG ile zorlu ve Periton makrofajlar hasat
<ol>
	<li>Her fare tartın.</li></ol>Son doz 2,5 g/kg vücut ağırlığı için her fare sağlamak için gerekli IVIG (100 mg/mL hisse senedi toplama) hacmi hesaplamak. Not: Örneğin, bir 20 g fare için IVIG 500 µL gereklidir.
	<li>Beraberlik IVIG gerekli miktarda içine steril 1 mL şırınga steril 26 ile donatılmış iğne ölçmek. IVIG almazsınız kontrol fareler için steril fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 IVIG yerine eşit dozu hacmi yönetmek.</li>
	<li>Scruff fare derisi başparmağınız ve işaret parmağı ile boyun arkasında kapma ve onun kuyruk ve kalan parmaklarınızla arka ayakları tutan tek elle. Yere doğru onun beden eğ.</li>
	<li>Fare karın, sağ alt kadranda göre 30-40 ° açıyla iğne yer kadar yükseltin, eğin ve 1,5 cm iğne yerleştirin. IVIG veya PBS intraperitoneally enjekte. 1 saat bekleyin.</li>
	<li>6-8 L/dak CO2 boğulma tarafından takip %5 isoflurane anestezi ile fareler ötenazi (bkz. Adım 1.1.1 - 1.1.2) veya kurumun etik kurallarına göre.</li>
	<li>PIN bir köpük tahta, bacaklarda fare dağılın. Parçalar % 70 etanol ile sprey. Not: steril bir mahallede yordamı gerçekleştirin.</li>
	<li>Periton boşluğuna kesme önlemek için fare, orta çizgi boyunca makasla cilde (0,2 cm) sığ bir kesim yapmak. Böylece sağlam Periton duvar astar görülebilir forseps, kullanarak fare göbek karın derisini çek.</li>
	<li>5 mL şırınga steril PBS (pH 7,4) 5 mL ile doldurulması. Bir 25 eklemek veya 27 kadar iğne sol veya sağ tarafına iğne eğimi ile fareyi merkezden boşluğundan üstündeki ölçer. Not: organları içine, ama yerine, Periton uzaya PBS enjekte değil iğne dikkatle fare yerleştirin.</li>
	<li>Sıvı Periton boşluğuna itin. İğne kavite dışarı çekin ve karın zarını 10 için masaj s herhangi bir hücre çıkarmak için. İğne kavite ekleyebilir ve organları kaçının. Toplamak ve buz üzerinde 15 mL konik tüp içine kurtarıldı lavaj sıvı yerleştirin. Not: sıvı enjekte her 5 mL için yaklaşık 3.75 mL elde edilebilir.</li>
	<li>Enjeksiyon ve kurtarma (Adım 2.8-2,9) tekrar 3 (20 mL toplam enjeksiyon hacmi), kez daha lavaj sıvı toplam 15 mL kurtarmak için. Lavaj her fare--dan bir ayrı 15 mL konik tüp içine toplamak. Not: son enjeksiyon sonra sıvı nerede sıvı birikmiş fare kadar sol ve sağ taraftan ayıklamak daha kolay olabilir. Organları bu konumda iğne ile daha az girişim neden olur.</li>
	<li>Hücreleri aşağı 300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin Kaplama orta 500 μL hücrelerde resuspend (IMDM, %10 FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin) temizlenen fare başına. Bir hemasitometre18kullanarak uygun makrofajlar saymak. Not: Makrofajlar daha diğer Periton hücre biraz daha büyük olacaktır. 5 x 105 - 1 x 106 makrofajlar/fare vahşi türü C57BL/6 fare kullanma tipik verimidir. İsteğe bağlı: kırmızı kan hücreleri, çok sayıda hücre Pelet varsa, bunları, 1 x kırmızı kan hücre lizis tampon üreticinin yönergelerine uygun kullanarak kaldırmak için lizis adımı gerçekleştirin.</li>
	<li>1 x 106 makrofajlar/mL orta kaplama hücreler resuspend ve iyi bir 96-şey düz dipli doku kültürü tedavi plaka başına 100 μL plakası. Not: Bu havuzu için gerekli olabilir ineklemek kullanıyorsanız bir deney için birden fazla fare hücrelerden kuyu veya titrating uyarıcı. Örneğin, tek bir fare 5 x 105 makrofajlar olsaydı, kaplama orta 500 μL gerekli olacaktır. 5 kuyu veya yinelenen bir LPS doz ile 1 deneyde için yeterince hücre olur.</li>
	<li>Hücreler 37 ° c, % 5 CO2 makrofajlar olmak izin vermek için 1 h için kuluçkaya yapışık. Periton makrofajlar yapisan hücrelerdir. Hücre supernatants ve yapışık olmayan hücreleri kaldırın. Wells iki kez 200 μL (37 ° C için önceden ısındı) IMDM ile durulayın, 10 bekle s ve yavaş yavaş plaka tilt. Kaplama orta yerine. Hücreleri 37 ° c, % 5 CO2 30 dk önce uyarılması için kuluçkaya.</li>
	<li>LPS IMDM içinde 10 ng/mL ile makrofajlar teşvik veya bir denetim olarak unstimulated bırakın. 24 saat kuluçkaya, toplamak ve (1.16-1.17 adımlara bakın) hücre supernatants IL-10 sitokin analiz tarafından ELISA için açıklamak. ELISA Protokolü piyasada bulunan Seti'nden (Tablo reçetesi) izleyin. Not: stimülasyon sonra yapışık hücreleri gibi Batı leke veya PCR teknikleri için hazırlanabilir.</li>

3. fareler içinde Vivo IVIG + LPS ve Periton makrofajlar hasat ile zorlu
<ol>
	<li>Her fare tartın. Son doz 2,5 g/kg vücut ağırlığı sağlamak için gerekli IVIG (100 mg/mL hisse senedi toplama) hacmi hesaplamak. LPS (IMDM 100 μg/mL hisse senedi toplama) 0.2 μg/g vücut ağırlığı son bir doz sağlamak için gereken miktarını hesaplamak. Not: Örneğin, bir 20 g fare için 500 µL IVIG hisse senedi çözüm ve LPS, 100 μg/mL solüsyon 40 μL gereklidir.</li>
	<li>IVIG gerekli miktarı çekmek ve LPS steril 26 ile donatılmış bir steril 1 mL şırınga içine iğne ölçmek. IVIG almazsınız kontrol fareler için IVIG eşdeğer hacmi steril PBS pH 7.4 ile değiştirin.</li>
	<li>Scruff fare derisi başparmağınız ve işaret parmağı ile boyun arkasında kapma ve onun kuyruk ve kalan parmaklarınızla arka ayakları tutan tek elle. Yere doğru onun beden eğ.</li>
	<li>İğne fare karın, alt sağ bölümündeki göre 30-40 ° açıyla, eğim ve eklemek 1,5 cm. ekleme IVIG + LPS, ya da PBS + LPS, intraperitoneally 2.4 adım'olarak yer.</li>
	<li>1 saat sonra adımları 2.5-2,10 gerçekleştirerek Periton makrofajlar hasat.</li>
	<li>Hücreleri aşağı 300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin 1 mL kurtarılan lavaj sıvı kaldırmak ve IL-10 ve ELISA tarafından IL-12/23 p 40 analizleri için üreticinin talimatlarına uyarak kullanmak veya gelecekteki analizleri için-80 ° C'de dondurmak. Not: lavaj sıvı sitokin analiz için Tedaviler arasında doğru karşılaştırma sağlamak için 5 mL flushs Periton boşluğu ve 4 kez 15 mL son bir hacim için gerçekleştirin. Tüm sıvı her floş elde edilebilir.</li>
	<li>Adım 2,11, olduğu gibi resuspend ve uygun makrofajlar saymak. Not: Makrofajlar daha diğer Periton hücre biraz daha büyük olacaktır.</li></ol>5 x 105 - 1 x 106 makrofajlar/fare vahşi türü C57BL/6 fare kullanma tipik verimidir. İsteğe bağlı: kırmızı kan hücreleri, çok sayıda hücre Pelet varsa, bunları, adım 2.11 olduğu gibi kaldırmak için üreticinin yönergelerine uygun lizis adımı gerçekleştirin.
	<li>Adım 2.12 olduğu gibi orta kaplama hücreler yeniden askıya alma. Not: Bir deney için birden fazla fare havuzu hücrelere gerekli olabilir. Örneğin, tek bir fare 5 x 105 makrofajlar olsaydı, kaplama orta 500 μL gerekli olacaktır.</li>
	<li>2.13 olduğu gibi hücreleri makrofajlar olmak izin vermek için 37 ° C % 5 CO2 1 h için kuluçkaya yapışık.</li>
	<li>Toplamak ve adımları 1,14-1.15, tüm Periton hücrelerden göre şartına orta açıklık. Not: Örnekleri hemen kullanılabilir veya dondurulmuş ve sitokin analiz için-80 ° C'de ELISA tarafından saklanır.</li>
	<li>Adım 2.11 yerine hücreleri 24 h unstimulated için kuluçkaya Toplamak ve hücre supernatants, sitokin analiz tarafından ELISA için adım 1.16-1.17, aynı derecede açıklamak. Not: Hücreleri adımları 1.16-1.17 ve 2.14 olduğu gibi Batı leke veya PCR, gibi teknikleri için hazır olun.</li>

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation:+time+for+reassessment.">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations.">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li><li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+murine+macrophages.">Activation of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gallo, P., Gon&#231;alves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+IgG+density+and+macrophage+Fc+(gamma)+receptor+cross-linking+on+phagocytosis+and+IL-10+production.">The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production.</a> Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-tumor+necrosis+factor-&#945;+antibodies+induce+regulatory+macrophages+in+an+Fc+region-dependent+manner.">Anti-tumor necrosis factor-&#945; antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner.</a> Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).</li><li>Kozicky, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+skews+macrophages+to+an+anti-inflammatory,+IL-10-producing+activation+state.">Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).</li><li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+proinflammatory+responses+by+ligating+the+macrophage+Fcgamma+receptor+type+I.">Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I.</a> J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).</li><li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiinflammatory+activity+of+IgG:+the+intravenous+IgG+paradox.">The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox.</a> J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).</li><li>Gelfand, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immune+globulin+in+autoimmune+and+inflammatory+diseases.">Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases.</a> N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).</li><li>Andersson, J., Skans&#233;n-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immune+globulin+affects+cytokine+production+in+T+lymphocytes+and+monocytes/macrophages.">Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages.</a> Clin Exp Immunol. 104, 10-20 (1996).</li><li>Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+by+activation+of+repressor+element+GA-12+through+hyperactivation+of+the+ERK+pathway.">Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway.</a> Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).</li><li>Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB1+(p50)+homodimers+differentially+regulate+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+in+macrophages.">NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages.</a> J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).</li><li>Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+targets+for+mucosal+healing+and+therapy+in+inflammatory+bowel+diseases.">New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).</li><li>Bryant, A., Moore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rituximab+and+its+potential+for+the+treatment+of+rheumatoid+arthritis.">Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis.</a> Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).</li><li>Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+versatile+platforms+for+cancer+immunotherapy.">Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).</li><li>Louis, K. S., Siegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+analysis+using+trypan+blue:+manual+and+automated+methods.">Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods.</a> Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).</li><li>Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).</li><li>Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK+activation+following+macrophage+FcgammaR+ligation+leads+to+chromatin+modifications+at+the+IL-10+locus.">ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus.</a> J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+macrophage+function+with+IgG+immune+complexes.">Modulating macrophage function with IgG immune complexes.</a> J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).</li><li>Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+suppression+of+interleukin-12+induction+after+macrophage+receptor+ligation.">Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation.</a> J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).</li><li>Riquelme, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-&#947;-induced+iNOS+expression+in+mouse+regulatory+macrophages+prolongs+allograft+survival+in+fully+immunocompetent+recipients.">IFN-&#947;-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients.</a> Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).</li><li>Vos, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+macrophages+induced+by+infliximab+are+involved+in+healing+in+vivo+and+in+vitro.">Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro.</a> Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).</li><li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li><li>Gerber, J. S., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversing+lipopolysaccharide+toxicity+by+ligating+the+macrophage+Fc+gamma+receptors.">Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors.</a> J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).</li><li>Durandy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulins--understanding+properties+and+mechanisms.">Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms.</a> Clin Exp Immunol. 158, 2-13 (2009).</li><li>Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+uses+of+intravenous+immunoglobulin.">Clinical uses of intravenous immunoglobulin.</a> Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).</li><li>Murakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+immunoglobulin+preparation+prevents+the+production+of+pro-inflammatory+cytokines+by+modulating+NF&#954;B+and+MAPKs+pathways+in+the+human+monocytic+THP-1+cells+stimulated+with+procalcitonin.">Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NF&#954;B and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin.</a> Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Makrofaj harekete geçirmek Birleşik her iki doku homeostazı ve hastalık22içinde önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar bağlı olarak kendi microenvironment3ipuçlarını etkinleştirme Birleşik örtüşen yanı sıra farklı olabilir. İnflamatuar yanıt tüm aşamalarında farklı rollere sahip: savunma patojenlere karşı yara iyileşmesi ve doku restitüsyon ve da inflamatuar yanıt2 dönüm için önemli bir farklı anti-inflamatuar etkinle?...

Enfeksiyon ya da yaralanma bağışıklık yanıtında birden çok rol oynamak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri makrofajlar vardır. Makrofajlar, enfeksiyon veya doku hasarı bir bağışıklık yanıtı başlatmak, inflamatuar yanıt durdurma ve şifa yanıt1teşvik için sorumludur. Üç en iyi okudu makrofaj harekete geçirmek durum örnekleri şunlardır: 1) ile interferon gama (IFNγ) ve bakteriyel lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS), inflamatuar yanıt; katkıda belirlenmiş tedavi makrofajlar 2) şifa yanıtıyla ilişkili olan makrofajlar ile İnterlökin 4 (Il-4), M(IL-4), uyarılmış; 3) makrofajlar bağışıklık kompleksleri (IC) ile uyarılmış ve LPS, M (IC + LPS), inflamatuar yanıt2,3kapalı açmak seçeneğine sahipsiniz. M (IC + LPS) makrofajlar şifa M(IL-4) yaradan farklıdır ve enzim arginase (Arg-1) veya FIZZ14ifade değil. En iyi bu anti-enflamatuar makrofajlar için onların sitokin üretim5belirtecidir. Makrofajlar sağlığı korumak birden çok rol var, ama aynı zamanda inflamatuar hastalıkları ve kanser3katkıda. Bu nedenle, çok çeşitli hastalıkların tedavisi için anahtar bir terapötik hedef makrofajlar vardır. Makrofaj dayalı tedaviler hastalığı için geliştirmek için onların harekete geçirmek durum antikorlar etkilerini araştırmak önemlidir.
Bu kağıt fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve inflamatuar yanıt içinde in vitro ve in vivoantikor ilaçların etkisi test etmek için Periton makrofajlar kullanımı üzerinde odaklanmıştır. Son zamanlarda, makrofaj harekete geçirmek6,7,8antikorların etkilerini gösteren birden çok çalışma yapılmıştır. Makrofajlar harekete geçirmek antikorlar bir antijen ve LPS, normalde inflamatuar bir uyarıcı ile complexed olan bağışıklık kompleksleri ile birlikte çok yüksek düzeyde anti-inflamatuar sitokin, IL-10 ve pro-inflamatuar sitokin düzeyi çok düşük üretmek, İnterlökin 12 (IL-12)9. Ayrıca, infliksimab, Monoklonal antikor TNFα karşı iş, kısmen, ile onun parçası crystallizable (Fc) bölge7anti-inflamatuar makrofajlar inducing tarafından tespit edilmiştir. IVIG + LPS neyin ortak uyarılmış makrofajlar IL-10 büyük miktarda ve pro-inflamatuar sitokin alt birim İnterlökin 12 veya 23 p40 (düşük miktarda üretmek M (IC + LPS), için benzer anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek neden bildirdin Il-12/23p40), İnterlökin-6 (Il-6) ve TNF8. IVIG poliklonal antikorlar oluşan bir havuza 1.000'den fazla bağış10kandan IgG öncelikle ilaçtır. Çok çeşitli idiyopatik trombositopenik purpura ve kronik demiyelinizan polinöropati, gibi immünolojik hastalıkların tedavisinde kullanılan ama onun etki mekanizmaları tamamen anlaşılır11değil. Antikor dayalı ilaçların etkileri makrofaj etkinleştirme hakkında burada açıklanan yöntemleri kullanarak tespit edilebilir.
Makrofaj etkinleştirme belirli destekte etkilerini BMDMs ve Periton makrofajlar içinde test edilebilir. Bu makrofaj kaynaklarını kullanarak Primer hücre değerlendirilmesi izin verir. Antikor kültürlü Primer hücre üzerinde ön test daha az zaman ve daha başka zaman alıcı ve pahalı hastalık modelleri parasal yatırım gerektirir. Sağlıklı fare vivo içindebir uyuşturucu enjekte etme ve hücreleri izole ve ex vivoanaliz, kimse çalışmalar destekte tedaviyle makrofaj harekete geçirmek içinde hastalık modelleri etkiler değerlendirmek için gerekip gerekmediğinin belirleyebilirsiniz.
Makrofaj harekete geçirmek içinde in vitro ve in vivo biyolojik tedaviler etkisi doğrudan test kaç çalışmalar ile bizim teknikleri alternatif teknikleri üzerinde bir avantaj sağlar. Güncel teknikler içeren karma hücre popülasyonları vitro, karışık lenfosit reaksiyon (MLR) veya IVIG infliksimab periferik kan mononükleer hücrelerinde insan makrofajlar üzerinde etkisi gibi üzerinde test biyolojik uyuşturucu etkileri nerede etkisi bir belirli hücre türü7,12' ye isnat edilemez. BMDMs ve Periton makrofajlar kullanarak avantajlı hücre hatları, pro-inflamatuar sitokin üretmek değil, RAW264.7 hücreleri gibi kullanarak üzerinden IL-12, LPS8,13yanıt olarak. Bir antikor tabanlı uyuşturucu etkisi makrofaj yanıt ex vivo test sitokin yanıtları makrofajlar doğrudan bağlanabilir çünkü avantajları vardır yerine serum sitokin düzeyleri14 ölçerek makrofaj yanıt çıkarım . BMDMs ve Periton makrofajlar türetilen ve anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek bir proteinin belirli bir rolü belirlemek için genetik olarak değiştirilmiş fare gelen izole. Örneğin, biz-si olmak kullanılmış Il10 eksik(- / -) BMDMs IVIG kaynaklı azaltma pro-inflamatuar sitokin üretiminin IL-108tarihinde kısmen bağlı olduğunu göstermek için. Bir ilacın etki mekanizmaları western Blot, spesifik proteinlerin ve sinyal olaylar rolü belirlendiği yerde kullanarak soruşturma olmaktır. Nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) BMDMs ya da Periton makrofajlar antikor aktivasyon neden gen ekspresyonu kalıpları göstermek için gerçekleştirilebilir. Hastalık modelleri farelerde bilgi ilgili modelleri antikor tabanlı biyolojik tedaviler potansiyel etkinliğini inflamatuvar barsak hastalığı, romatoid artrit, kanser15,ve16, gibi hastalıklar için sağlar 17. ancak, burada açıklanan teknikler bilgi bu destekte eylem mekanizması anti-inflamatuar makrofaj aktivitesi neden olup olmadığını belirleyerek sağlayacaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1312px;" width="1311">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Iscove&#8217;s modified Dulbecco&#8217;s medium (IMDM)</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">12440053</td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF)</td>
			<td style="width:209px;">Stemcell technologies</td>
			<td>78059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Monothioglycerol (MTG)</td>
			<td style="width:209px;">Sigma</td>
			<td>88640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1X red blood cell lysis buffer</td>
			<td style="width:209px;">eBioscience</td>
			<td style="width:408px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">13150016</td>
			<td>Enzyme-Free, Hanks&#39;s-based, EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:209px;">Sigma aldrich</td>
			<td style="width:408px;">L 4516</td>
			<td>From E. coli 0127:B8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Gammunex)</td>
			<td style="width:209px;">Grifols</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Gammagard liquid)</td>
			<td style="width:209px;">Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">IVIg (Octagam)</td>
			<td style="width:209px;">Octapharma</td>
			<td>Received from BC Children&#39;s Hospital, Transfusion Medicine</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4</td>
			<td style="width:209px;">Life technologies</td>
			<td style="width:408px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">mouse IL-10 ELISA</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">555252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">mouse IL-12/23p40 ELISA</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">555165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-Erk1/2 antibody</td>
			<td style="width:209px;">Cell signalling technology</td>
			<td style="width:408px;">9101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-pp38 antibody</td>
			<td style="width:209px;">Cell signalling technology</td>
			<td style="width:408px;">9211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:209px;">Fitzgerald industries</td>
			<td style="width:408px;">10R-G109A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">26 g needle</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">305110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">microcentrifuge tube (1.7 mL)</td>
			<td style="width:209px;">Diamed</td>
			<td style="width:408px;">SPE155-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:453px;">75 cm2 tissue culture treated flask</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">353136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:209px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:408px;">353085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Forcepts</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td>82027-386</td>
			<td>fine tip, dissecting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:453px;">Scissors</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td>82027-582</td>
			<td>Delicate, 4 1/2&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Brightfield microscope</td>
			<td style="width:209px;">Motic</td>
			<td style="width:408px;">AE31</td>
			<td>Inverted phase contrast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Scale&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Mettler&#160;</td>
			<td style="width:408px;">PE 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of antibody-based drugs effects on murine bone marrow and peritoneal macrophage activation

Makrofajlar fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bağışıklık yanıtı patojenlere başlatmak ve şifa ve doku iadesi için katkıda bulunmaktadır. Makrofajlar inflamatuar yanıt dönüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar intravenöz immünglobulin (IVIG) ile uyarılan yüksek miktarda anti-inflamatuar sitokin, İnterlökin 10 (IL-10) ve yanıt olarak bakteriyel lipopolisakkaritler (pro-inflamatuar sitokinlerin seviyesinin düşük üretebilir göstermiştir LPS). IVIG polivalan antikor, öncelikle immünglobulin Gs (IgGs), 1.000'den fazla kan bağış plazma havuza alınmış olduğunu. Bu antikorlar bağışıklık eksikliği olan hastalarda ek olarak ya da otoimmün veya inflamatuar koşulları olan hastalarda immün yanıt-e doğru bastırmak için kullanılır. İnfliksimab, bir tedavi anti-tümör nekroz faktör alfa (TNFα) antikor, ayrıca IL-10 inflamatuar uyaranlara yanıt üretmek için makrofajlar etkinleştirmek için gösterilmiştir. IVIG ve diğer antikor tabanlı destekte makrofaj harekete geçirmek üzerindeki etkileri belirlemek için test edilecek. Bu kağıt türetme, stimülasyon ve değerlendirme fare kemik iliği makrofajlar tarafından antikorlar vitro aktif ve ile antikor içinde vivoaktif fare peritoneal makrofajlar yöntemleri açıklar. Son olarak, belirli hücre anti-inflamatuar makrofaj aktivitesi yolları sinyal katkısını belirlemek için western Blot kullanımını göstermektedir. Bu protokoller genetiği değiştirilmiş fare ile anti-inflamatuar makrofaj etkinleştirme belirli bir protein(s) etkisini belirlemek için kullanılabilir. Bu teknikler, belirli destekte inflamatuar yanıt içinde vivoazaltan bir IL 10 üreten anti-inflamatuar harekete geçirmek durum için makrofajlar değiştirerek hareket edebilir olup olmadığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu etkinliği sırasında hastalık modelleri farelerde makrofaj etkinleştirme destekte, rolü hakkında bilgi vermek ve bir potansiyel yeni etki mekanizması kişilerde içgörü sağlamak. Özellikle makrofajlar bu enfeksiyona karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamak Eğer tersine, bu belirli antikor tabanlı destekte kullanımına karşı bulaşıcı hastalığı tedavi etmek için dikkat.

Fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar hematopoietik hücre kemik iliği boğulmadan Kara filmin tarih öncesi gelen kültürlü. Kalça ve yırtılmalarıteşhis bir C57BL/6 fare genellikle havuza alınmış kemik iliği örnekleri 107 kemik iliği türetilmiş makrofajlar onları makrofajlar deneyleri için uygun bir kaynak yapma, verim. BMDMs ne zaman ile inflamatuar uyarıcı vitromeydan dayalı antikor uyuşturucu yanıt test etmek için kullanılabilir. <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation at JoVE.com

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Antikor bazlı ilaçlara inflamatuar hastalıkları tedavisinde devrim. Belirli hedefleri üzerinde doğrudan etkileri sahip olmanın yanı sıra, antikorlar makrofajlar anti-inflamatuar olmak için etkinleştirebilirsiniz. Bu protokolü nasıl anti-inflamatuar makrofaj açıklar harekete geçirmek-ebilmek var olmak istimal fare kemik iliği makrofajlar ve Periton makrofajlar kullanarak içinde vivo biçilen in vitro .

Fare kemik iliği ve Periton makrofaj harekete geçirmek antikor bazlı ilaçlara etkileri değerlendirilmesi

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

assessment-antibody-based-drugs-effects-on-murine-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.1K Görüntüleme.  University of British Columbia. Antikor bazlı ilaçlara inflamatuar hastalıkları tedavisinde devrim. Belirli hedefleri üzerinde doğrudan etkileri sahip olmanın yanı sıra, antikorlar makrofajlar anti-inflamatuar olmak için etkinleştirebilirsiniz. Bu protokolü nasıl anti-inflamatuar makrofaj açıklar harekete geçirmek-ebilmek var olmak istimal fare kemik iliği makrofajlar ve Periton makrofajlar kullanarak içinde vivo biçilen in vitro .

Video: Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...