이 작품은 도이치 가운데 SFB688 (ag는)에 의해 지원 되었다.

마우스 사육 Regierung 인 운터 프랑 켄에 의해 승인 되었다 그리고 모든 분석 모든 독일과 유럽 연합 해당 법률 및 규정 관리 및 실험 동물의 사용에 따라 실시 했다.
1. 결정의 코팅 전 Utero Allantois Explant 문화에 대 한 α4β1 Integrin와 플레이트
<ol><li>멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 200 µ g/mL에서 동결 건조 된 murine α4β1 integrin reconstitute 미리 데워 진된 (37 ° C) PBS에에서 10 µ g/mL의 최종 농도에 희석. 피 펫 20 µ L/결정 플레이트 (1 allantois/잘)의 우물의 필요한 수에 희석된 α4β1 integrin 솔루션의 음. 참고: 결정 접시의 우물을 코팅 할 때 기포의 형성을 피하십시오.</li>
	<li>습도 조직 문화 인큐베이터에 그들을 배치 하 여 37 ° C에서 60 분에 대 한 결정 번호판을 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 발음 한 피 펫과 상쾌한. 부드러운 흡입을 사용 하 고 경사 접시 피 펫 팁 잘 하단을 만지지 마십시오. 두 번 미리 따뜻하게 (37 ° C) 문화 매체와 같은 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)의 50 µ L을 추가 하 여 우물을 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>중요 한 단계: 블록 무료 50 µ L / 0.1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 음을 추가 하 여 사이트 바인딩 / DMEM 습도 조직 문화 인큐베이터에서 결정 접시를 두어서 ≥ 37 ° C에서 30 분 품 어 및. 참고: Allantois explants는 혈 청의 다양 한 표면에 첨부할 수 있습니다. 일반적인 바인딩 사이트를 차단 하는 것이 필수적 이므로, 코팅 후 웰 스 integrin, 그리고 대 한 해 부 allantois를 추가 하기 전에 포함 하는 혈 청에서 문화 explant 중간 (단계 4.4 참조).</li>
	<li>4.4 단계에서 필요할 때까지 37 ° C에서 차단 솔루션에 코팅된 우물을 유지.</li>
</ol>2. 자 궁 해 부 Dpc 8에서 임신 마우스에서
참고: 체중 증가 차별15거짓 양성 임신 율을 줄일 수 있습니다.
<ol><li>자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 희생. 70% (v/v) 에탄올을 분사 하 여 복 부 지역에 코트를 소독. 참고: 마우스를 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다. 마 취약 없이 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 allantois allantois 첨부 파일을 방해할 수 있는의 화학 오염을 방지 합니다.</li>
	<li>가 위는 중간에 작은 절 개를 하 여 복 부 피부를 엽니다. 피부 절 개, 위아래를 gloved 손가락을 사용 하 고 가슴과 마우스의 꼬리 쪽으로 떨어져 피부를 당겨.</li>
	<li>집게와 복을 파악. 다른 한편으로는, 만들어 앞쪽에서 V 자형 절 개 후부 쪽으로 위를 사용 하 여와 이동 멀리 복 부 구멍을 노출 하는 조직. 집게를 사용 하 여 자 궁에 액세스 내장 한쪽으로 밀어.</li>
	<li>두 개의 자 궁 뿔을 찾습니다. 집게와 자 궁 경부 (꼬리 세그먼트)를 누른 괜 찮 아 요가 위 인 대를 잘라. 그런 다음가 위는 oviducts severing 모두 자 궁 뿔 분리 합니다.</li>
	<li>실내 온도 (RT) PBS 살 균, 멸 균 10cm 요리 포함으로 궁 전송 집게를 사용 합니다. 지방 조직, 혈관, 신경 주변 미세 집게 /가 위 (그림 1A)와 자 궁 뿔을 제거 합니다.</li>
</ol>3. 태아의 해 부
참고: 8:1 확대/축소 범위를 갖춘 stereomicroscope에서 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>가 위는 배아 이식 사이트 사이 절단 하 여 구분 합니다. 집게와 자 궁 싹의 근육 자 궁 안 대기를 잡고 고 (그림 1B) decidua 노출 떨어져 그것을 끌어.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 전송 궁 싹 살 균, 포함 된 새로운 10 cm 접시에 RT PBS.</li>
	<li>태아 주위 decidua 집게의 끝을 함께 해결.</li>
	<li>절 개는 decidua의 안티-mesometrial에 좋은 집게 (그림 1C)와 고 껍질에 decidua 멀리 배아 (그림 1D)를 노출 하는 집게와. 참고:는 decidua의 mesometrial 극 높은 나가도록 하 고 태아를 포함 하 고 더 창백한 나타납니다 안티-mesometrial 부분 보다 그것의 기초에 넓은 수 있습니다.</li>
	<li>집게 (그림 1E, F)와 태아를 해 부.</li>
	<li>마이크로 스푼을 사용 하 여, 살 균 3.5 cm 접시에 포함 된 메 마른 PBS의 한 방울으로 배아를 전송 합니다.</li>
	<li>마이크로 스푼을 사용 하 여 동일한 3.5 cm 접시에 PBS의 신선한 방울에 배아를 전송 하 고 집게 (그림 1G, H)를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 태아를 해 부.</li>
	<li>필요에 따라 필요한 경우 (예를 들어, 연쇄 반응에 의해 유전형), 전송 노른자위 낭 무 균 튜브에와 그것을 발음 하 여 ~ 큰 구멍 200 µ L 피 펫 팁으로 5 µ L PBS. -20 ° c.에 게 참고: 노 른 자 삭 준비를 오염 시킬 수 있는 모성 조직 (즉, 정수 리 른 sac Reichert의 막과 ectoplacental 콘 포함) 잘못 된 유전형 결과 발생할 수 있습니다. 이러한 직물의 제거는 노른자위 낭에서 태아 해 부 전에 더 쉽습니다.</li>
</ol>4. allantois 해 부 및 고정된 α4β1 Integrin에 전 Utero 문화
<ol><li>좋은 집게 (그림 1 H)를 사용 하 여 태아의 뒤 끝에는 기저 삽입 사이트에서는 allantois를 잘라.</li>
	<li>필요에 따라 발달 준비 해야 하는 경우에 somite 쌍 태아의 검사 단계 대조 광학 및 5 ×, 10 × 목표와 현미경을 사용 하 여 계산. 참고: 태아 somite 계산을 촉진 하기 위하여 집게로 확장할 수 있습니다. Chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전 ≥ 6 somite 쌍 태아에서 E 8.0과 9.0 E 간에 발생합니다. 도 6-8 somite 쌍 태아에서 시작 된다.</li>
	<li>피펫은 40 µ L / 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청, L-글루타민, 항생제 미리 코팅된 결정 플레이트 웰 스 (섹션 1을 참조)의 필요한 수에 보충 DMEM의 음.</li>
	<li>그것을 발음 하 여 부동 allantois 수집 ~ 200 µ L 피 펫 팁의 큰 구멍으로 5 µ L PBS. 전송 1 allantois/잘.</li>
	<li>예를 들어에 대 한 습도 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에서 결정 플레이트를 배치 하 여는 allantoides를 품 어 6, 12, 및 24 시간. Allantois 부착을 가진 방해를 방지 하기 위해이 시간 포인트 사이 결정 접시를 이동 하지 마십시오.</li>
	<li>각 시간 점에서 점수 allantois 첨부 파일 (예를 들어, 없음 첨부 파일/부동 allantois; 부분적으로 또는 완전 하 게 연결 된 allantois; 완전히 확산 allantois) 갖춘 위상 대비 또는 차동 간섭 콘트라스트 광학 현미경을 사용 하 고 5 × 또는 10 × 목표 (그림 2). 참고: 갓 격리 하 고 완벽 하 게 연결 된 allantoides의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다. Utero ex, wildtype C57BL/6J 쥐에서 분리 된 allantoides의 원심 끝에 4-6 h (이 라고 하는 allantois의 부분 첨부), 내 연결 및 전체 allantois의 전체 첨부 파일 내에서 이루어집니다 ~ 문화 12 h. 18-24 h는 explant 평평 있으며 CD31-양성 혈관 총9,16원형 (완전히 확산 allantois 함) 가정.</li>
</ol>5. 확실 한 내 피 세포 마커 CD31 위한 Explanted Allantois의 얼룩
<ol><li>완전히 확산 explants의 문화 매체를 발음 하 고 4% (w/v) paraformaldehyde/PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 셀을 해결. 참고: Paraformaldehyde 독성이 있다. 장갑 및 피부와 눈 접촉을 피하기 위해 안전 고글을 착용 합니다.</li>
	<li>RT에서 10 분 동안 incubate 다음은 상쾌한 발음. PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>세포를 permeabilize 40 µ L/잘 PBS의 추가 의해 두 번의 0.1% (v/v) 트리톤 X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) 정상 염소 혈 청 PBS에서 실시간 세척에서 30 분 동안 40 µ L/잘 추가 하 여 비 특정 바인딩 사이트를 차단 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 하룻밤이 시점에서.</li>
	<li>밤새 4 ° c.에 셀 기본 안티-CD31 항 체의 20 µ L/잘 희석 0.1% (w/v) BSA/PBS에에서 1시 50분을 추가 하 여 얼룩 PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>20 µ L/잘 붙일 레이블 보조 염소 반대로 쥐 항 체 희석된 1: 200의 0.1% (w/v) BSA/PBS 배치 하거나 알루미늄 호 일에 포장 하 여 빛에서 실시간 보호 결정 접시에서 1 시간에 대 한 어두운 챔버에 추가 하 여 바운드 기본 항 체를 감지 합니다. PBS의 40 µ L/잘 추가 하 여 세 번 세척 하 고 부드러운 흡입에 의해 세척 매체를 제거.</li>
	<li>20 µ L/잘 장착 매체의 추가 하 여 셀을 포함 합니다. 에 품 어 ~ RT 설치 매체에는 경화 될 때까지에 1 시간. 빛 으로부터 보호 4 ° C, 또는 RT에서 결정 접시를 저장.</li>
	<li>이미지는 allantois의 혈관 총 explants는 5 × 또는 10 × 목표와 적합 한 형광 필터 형광 현미경. 참고: 완전 확산 allantois의 CD31-양성 혈관 총의 대표 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 항 체와 같은 혈관 신경 총에 대 한 다른 마커 Flk-1, Flt에 대 한 감독 잘16넥타이 또는 넥타이-2을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation.">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160 (2016).</li><li>Kane, S. V., Acquah, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene:+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation.">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes &amp; development. 9 (1), 1-14 (1995).</li><li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+(VCAM-1)+deficient+mice.">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li><li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+into+early+placental+ontogeny:+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated.">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants.">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li><li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha.">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li><li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allantois+and+chorion,+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion,+have+hematopoietic+potential.">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li><li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+atlas+of+the+integrin+adhesome.">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li></ol>

저자는 공개 없다.

혈 청, fibronectin 같은 프로 접착제 기질 분자의 풍부한 소스는 존재 allantois explants는 다양 한 플라스틱, 유리, 또는 필터 표면9,16에 쉽게 연결 됩니다. 따라서, 수행된 분석 결과의 목표는 구체적으로 유전자 조작의 효과 조사 하는 경우 allantois 첨부 파일에 다른 치료 움직일 α4β1, 그것은 비 특정 바인딩 사이트 (예를 들어, 소 혈 청을 차단 하는 중?...

태 미 발달 성장과 자 궁 환경에서 개발을 위한 불가결 하지 않습니다. 그것은 내 분 비 및 면역 기관으로 산소, 대사 산물, 및 태아 및 산 순환, 그리고 또한 기능 간의 영양 교환을 위한 인터페이스를 구성합니다. Placental 발달을 손상 하는 내 인 성 또는 외 인 모욕 자궁내 성장 지체, 태아 손실, 또는 임신 합병증, 생쥐와 인간1에서 발생할 수 있습니다. 비정상적인 태 반 생리학 시키는 대상된 마우스 돌연변이의 수 증가2, 219 genotypes 현재 마우스 게놈 정보 과학 (MGI) 웹사이트에 나열 된 계속 되는 동안 (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), 기계 론 적인 관점에서 잘 이해 되지 않습니다 많은이 고기. 이외에 유전 변경, 작은 분자 약물, 단일 클론 항 체, 독 소, 병원 체, 과잉 대사 또는 다양 한 환경 요원 영향을 미칠 수 태 반 개발 및 기능3,,45 , 6 , 7. 아직, 간단한 체 외에서 태 반 개발에서 모델 중요 한 단계는 부족 한 분석 실험.
(탯의 발달 전조) allantois chorion8쪽으로 성장 하는 새싹으로 태아의 뒤 끝에서 나올 때 murine placental 개발 초기 midgestation에서 시작 됩니다. Allantoic 새싹의 외부 층에서 Chorioadhesive 셀 중재 첨부 파일 그리고 allantois chorion (chorioallantoic "퓨전")의 표면에의 확산. chorion 이후에 villi는 미로, 영양분과 산소 juxtaposed 밀접 하 게 모성 혈액 사인 및 배아 용기9 사이 교환 되 안 태 반 층을 형성 하는 allantois의 맥 관 구조 성장에 주름 ,10.
allantois의 첨부는 chorion 미로 형성에 중요 한 초기 단계 이며,이 과정에서 결함에 있는 미 발달 치 사 율의 가장 일반적인 원인 중 midgestation1. 어디 chorioallantoic 첨부 파일10, 발생을 실패 하 고 MGI 데이터베이스 현재 나열을 비정상적인 chorioallantoic 퓨전 (http:// 특징으로하는 108 마우스 돌연변이 마우스 돌연변이의 숫자는 설명 www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), 세포 상호 작용은 혈관 세포 접착 분자-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm 표현) α4β1 integrin (chorionic mesothelium는에 표현 extraembryonic mesoderm에서 파생 된) chorioallantoic 첨부 파일 및 퓨전11,,1213불가결 것 같다. 약 배아 날 (E) 7.5 VCAM-1 allantoic 줄기의 원심 2/3 내 표현 된다 나타났습니다 Immunohistochemical 전체 산 야생-타입 배아의 얼룩13 (1-4 somite 단계), 그리고의 식을 여전히 높은 동안에 chorioallantoic 첨부 파일 및-퓨전11,12. chorion에 allantoic 첨부 파일의 오류는 일반적으로 자 궁 싹의 조직학 분석에 의해 감지 됩니다. 그러나, allantois 크기 사이와 같은 발달 단계14의 새끼 내 에서도 순수 높은 변수 이며는 allantois만 연결할 수 있는 chorion 신체 접촉 수 있도록 충분 한 크기에 도달 하는 때. 이 자연적인 변화를 반영, chorioallantoic 첨부 파일 일어난다 언젠가 사이 ~ E 8.0과 9.0 E에서 utero에서, 그리고 조직학이이 과정의 통계적으로 신뢰할 수 있는 평가의 많은 수의 분석에 의존 이므로 적절 한 발달 단계에서 충분 한 표본을 conceptuses.
여기, 우리 allantoic 첨부 파일 utero ex allantois 크기에 덜 의존 하는 평가 하는 방법을 설명 합니다. 우리 임신 쥐의 uteri에서 마우스 배아와 그들의 allantoides의 해 부를 입증 ~ 8 일 coitum 게시 (dpc; dpc 0.5 지정 질 플러그 감지), 그리고 allantois의 후속 문화 explants 고정된 α4β1에 integrins입니다. 이 메서드는 첨부 파일 및 여러 allantois explants 병렬에서 및 다른 연속 시간 점에서 확산의 급속 한, 기능 평가 수 있습니다. 프로토콜을 사용할 수 있습니다 allantois 첨부 비보 전에 대상된 돌연변이, 약물, 또는 다양 한 환경 요인의 영향에 대 한 화면으로.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J wildtype mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&amp;nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forceps used to open the abdominal cavity.</td></tr><tr><td>Micro dissecting forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Straight blades.</td></tr><tr><td>Spring scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.</td></tr><tr><td>Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Spoon diameter.</td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 &amp;micro;L) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-&amp;#945;4&amp;#946;1-mediated binding to plastic.</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>3.5 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>Large orifice pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Low binding pipette tips, 200 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>&amp;#945;4&amp;#946;1 integrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &amp;#945;4&amp;#946;1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; but no L-glutamine, which is added separately.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 &amp;micro;g/mL streptomycin) stock solution.&amp;nbsp;Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>We use heat-inactivated FBS (heated to 56 &amp;deg;C for 30 min with mixing to inactivate complement).</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 &amp;micro;m pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>To make a formaldehyde solution in PBS, weigh &lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 &amp;deg;C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 &amp;deg;C for approximately four weeks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.</td></tr><tr><td>&amp;#945;-CD31 Antibodies</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rat antibodies</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.</td></tr></tbody></table>

dissection and explant culture of murine allantois for the in vitro analysis of allantoic attachment

태 반 포유류 배아의 개발과 성장을 위해 필수적 이다. 이러한 이유로 수많은 유전 변경 및 태 반 개발 또는 기능을 방해 하는 가능성이 또한 환경 모욕 쥐와 인간에서 이른 임신 손실을 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 태 반 형성에 미치는 잠재적 영향에 대 한 화면 분석 간단한 체 외에 부족 합니다. 여기, 우리는 allantois의 첨부는 chorion 이루어져 있는 태 반 형성에 중요 한 첫 번째 단계를 모델링에 초점. 빠르게 움직이지 α4β1 integrin chorio 모방 기판 역할에 allantoic explants의 첨부 파일을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 생체 외에서 이렇게 하면 첨부 파일 및 확산 다른 연속 시간 포인트에서 여러 allantois explants의 동작의 질적 평가 수 있습니다. 타겟된 마우스 돌연변이, 약물, 또는 임신 합병증 이나 allantois 첨부 ex vivo에태아 손실에 연결 된 다양 한 환경 요인의 효과 조사 하는 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜 murine allantoides ex vivo, explant를 격리 하는 방법을 설명 하 고 chorioallantoic 융합 vivo에서 동안 α4β1 integrin allantois 첨부, 중요 한 프로세스의 질적 평가 자세히 설명. 그림 1A-H 에서 대표적인 결과 allantois 격리 임신 자 궁에서 시작의 연속 단계를 보여 줍니다. 자 궁 뿔, 지방 조직 등 선박 (...

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Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

생체 외에서 시험 모델 chorioallantoic 첨부 파일, 태 반 형성의 첫 번째 단계를 설명합니다. 프로토콜에 고정된 α4β1 integrin murine allantoides의 해 부 및 explant 문화를 보여 줍니다. 미리 정해진된 시간 포인트 allantois 첨부 현미경으로 평가 됩니다.

해 부와 Allantoic 첨부 파일의 생체 외에서 분석 Murine Allantois Explant 문화

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

7.8K 조회수.  University of Würzburg. 생체 외에서 시험 모델 chorioallantoic 첨부 파일, 태 반 형성의 첫 번째 단계를 설명합니다. 프로토콜에 고정된 α4β1 integrin murine allantoides의 해 부 및 explant 문화를 보여 줍니다. 미리 정해진된 시간 포인트 allantois 첨부 현미경으로 평가 됩니다.

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Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

연구

발생학

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

면역학 및 감염병학

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental treatments. However, because of their small body size, some structures, such as the oviduct with a diameter of 200-400 &#956;m, have proven to be relatively difficult to study except by immunohistochemistry. Recently, immunohistochemical studies have uncovered more complex differences in oviduct segments than were previously recognized; thus, the oviduct is divided into four functional segments with different ratios of seven distinct epithelial cell types. The different embryological origins and ratios of the epithelial cell types likely make the four functional regions differentially susceptible to disease. For example, precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas arise from the infundibulum in mouse models and from the corresponding fimbrial region in the human fallopian tube. The protocol described here details a method for microdissection to subdivide the oviduct in such a way to yield a sufficient amount and purity of RNA necessary for downstream analysis such as reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNAseq). Also described is a mostly non-enzymatic tissue dissociation method appropriate for flow cytometry or single cell RNAseq analysis of fully differentiated oviductal cells. The methods described will facilitate further research utilizing the murine oviduct in the field of reproduction, fertility, cancer, and immunology.

A method for microdissection of the mouse oviduct that allows collection of the individual segments while maintaining RNA integrity is presented. In addition, non-enzymatic oviductal cell dissociation procedure is described. The methods are appropriate for subsequent gene and protein analysis of the functionally different oviductal segments and dissociated oviductal cells.

뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

생물학

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

에 대한 마우스 태아의 전체 소장 문화 시스템<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 신호 전달 경로와 융모 개발의 3 차원 라이브 영상의 조작

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Establishing Villous and Decidual Organ Cultures as Ex Vivo Models of Human Maternal-Fetal Interface

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the establishment of primary human placental villous and decidual organ cultures in ex vivo conditions. These models are well-suited for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface.

융모 및 탈피 장기 배양을 인간 모체-태아 계면의 생체 외 모델로 확립

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...