Diese Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (, A.G.) unterstützt.

Maus-Zucht von der Regierung Unterfranken genehmigt wurde, und alle Analysen wurden unter strikter Einhaltung aller deutschen und Europäischen Union geltenden Gesetzen und Vorschriften rund um Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
(1) Beschichtung der Mikrotiter-Platten mit α4β1 Integrin für Ex Utero Allantois Explant Kultur
<ol><li>Bereiten Sie die lyophilisierten murinen α4β1 Integrin bei 200 µg/mL in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Um eine Endkonzentration von 10 µg/mL im vorgewärmten (37 ° C) PBS verdünnen. Pipette 20 µL/Well der verdünnten α4β1 Integrin-Lösung in die erforderliche Anzahl von Brunnen von einer Mikrotiterplatte (1 Allantois/Na). Hinweis: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen, wenn die Vertiefungen der Mikrotiterplatte Beschichtung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mikrotiter-Platten für 60 min bei 37 ° C werden, indem sie in einem befeuchteten Gewebekultur Inkubator.</li>
	<li>Aspirieren Sie sorgfältig den Überstand mit einer Pipette. Verwenden Sie sanfte Saugwirkung und Neigung der Platte zu vermeiden, berühren die Näpfchenboden mit der Pipettenspitze. Waschen Sie Brunnen zweimal durch Zugabe von 50 µL vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium wie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Entscheidender Schritt: Block frei Bindungsstellen durch Zugabe von 50 µL/Well von 0,1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) / DMEM und ≥ 30 min bei 37 ° C inkubieren, indem man die Mikrotiter-Platten in einem Inkubator befeuchtete Gewebekultur. Hinweis: Allantois Explantaten können verschiedene Oberflächen in Anwesenheit von Serum zuordnen. Es ist daher unerlässlich, unspezifischen Bindungsstellen blockieren, nach der Beschichtung die Brunnen mit Integrin und vor dem Hinzufügen der seziert Allantois für explant Kultur im Serum-haltigen Medium (siehe Punkt 4.4).</li>
	<li>Halten Sie die beschichteten Vertiefungen in der blockierenden Lösung bei 37 ° C bis in Schritt 4.4 benötigt.</li>
</ol>(2) Gebärmutter Dissektion von schwangere Maus bei Dpc 8
Hinweis: Einkochen Sie falsch-Positive Schwangerschaftsrate Gewicht Gewinn Diskriminierung15.
<ol><li>Die Maus durch zervikale Dislokation zu opfern. Desinfizieren Sie das Fell im Bauchbereich durch Besprühen mit 70 % (V/V) Ethanol. Hinweis: Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit Mäusen. Euthanasie durch zervikale Dislokation ohne Betäubung verhindert chemische Verschmutzung der Allantois, die Allantois Anlage stören kann.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchhaut, indem man einen kleinen Schnitt an der Mittellinie mit einer Schere. Verwenden Sie behandschuhte Fingern, um die Haut oberhalb und unterhalb der Schnitt zu halten, und ziehen Sie die Haut auseinander in Richtung Brust und Ende der Maus.</li>
	<li>Greifen Sie das Bauchfell mit Zange. Mit der anderen Hand einen v-förmigen Einschnitt von anterior in Richtung Posterior mit einer Schere und bewegen Sie das Gewebe entfernt, um die Bauchhöhle aussetzen. Verwenden Sie die Zange um den Darm zur Seite schieben, um Zugriff auf die Gebärmutter.</li>
	<li>Suchen Sie die uterine zwei Hörner. Halten Sie den Gebärmutterhals (kaudalen Segment) mit Zange und schneiden Sie die Bänder mit einer feinen Schere. Lösen Sie dann beide uterinen Hörner durch Durchtrennung der Eileiter mit einer Schere.</li>
	<li>Verwenden Sie Zange, die Gebärmutter in eine sterile 10 cm Schüssel mit sterilen, übertragen Raumtemperatur (RT) PBS. Entfernen Sie Fettgewebe, Gefäße und Nerven rund um die Gebärmutter Hörner mit feinen Pinzette/Schere (Abbildung 1A) oder.</li>
</ol>(3) Embryo Dissektion
Hinweis: Führen Sie folgende Schritte unter einem Stereomikroskop mit einem 8:1 Zoombereich ausgestattet.
<ol><li>Trennen Sie die Embryonen durch Schneiden zwischen der Implantation Websites mit einer Schere. Greifen Sie die muskuläre Gebärmutterschleimhaut der Gebärmutter Knospen mit Zange und ziehen sie auseinander um die Dezidua (Abbildung 1 b) verfügbar zu machen.</li>
	<li>Mit Pinzette, übertragen Sie die Gebärmutter Knospen in eine neue 10 cm Schale mit sterilen, RT PBS.</li>
	<li>Befestigen Sie die Dezidua um den Embryo mit den Spitzen der Zange.</li>
	<li>Machen Sie einen Einschnitt auf der Anti-Mesometrial der Decidua mit feinen Pinzette (Abbildung 1), und ziehen Sie der Decidua mit Zange um den Embryo (Abbildung 1) verfügbar zu machen ab. Hinweis: Der Mesometrial Pol von der Decidua ist stark durchblutet und kann an der Basis breiter als der Anti-Mesometrial Teil, der enthält des Embryos und blasser erscheint.</li>
	<li>Zerlegen Sie den Embryo mit Zange (Abb. 1E, F).</li>
	<li>Mit einem Mikro-Löffel, transfer des Embryos zu einem Tropfen von sterilen PBS in einer sterilen 3,5 cm Schüssel enthalten.</li>
	<li>Transfer des Embryos zu einem frischen Tropfen von PBS in der gleichen 3,5 cm Schüssel mit einem Mikro-Löffel und sezieren die Embryos aus dem Dottersack mit Pinzette (Abbildung 1, H).</li>
	<li>Optional, bei Bedarf (z.B.für die Genotypisierung durch Polymerase-Kettenreaktion) übertragen der Dottersack in ein steriles Röhrchen durch Absaugen mit ~ 5 µL PBS in einer großen Öffnung 200 µL Pipettenspitze. Shop bei-20 ° C. Hinweis: Mütterlichen Gewebe (d.h. der parietalen Dottersack einschließlich Reicherts Membran und die Ectoplacental Kegel), die die Dottersack Zubereitung verunreinigen kann kann zu fehlerhaften Genotypisierung Ergebnissen führen. Entfernung von diesen Geweben ist am einfachsten vor dem Embryo Dissektion aus dem Dottersack.</li>
</ol>4. Allantois Dissektion und Ex Utero Kultur auf immobilisierte α4β1 Integrin
<ol><li>Schneiden Sie die Allantois aus der basalen Insertionsstelle am hinteren Ende des Embryos mit feinen Pinzette (Abbildung 1 H).</li>
	<li>Optional, wenn Entwicklungsstörungen Inszenierung erforderlich ist, zählen Sie die Somiten Paare des Embryos durch Sichtkontrolle unter Verwendung eines Mikroskops mit Phase Kontrast-Optik und eine 5 × 10 × Ziel ausgestattet. Hinweis: Der Embryo kann mit der Pinzette Somiten zählen zu erleichtern erweitert werden. Chorioallantoic Anlage und Fusion auftreten zwischen E 8.0 und 9.0 E in Embryonen mit ≥ 6 Somiten Paaren. Drehen beginnt beim Embryo mit 6-8 Somiten Paaren.</li>
	<li>Pipette 40 µL/Well des DMEM mit 10 % (V/V) fötalen Rinderserum, L-Glutamin und Antibiotika in der erforderlichen Anzahl von vorbeschichteten Mikrotiter Platte Brunnen (siehe Abschnitt 1) ergänzt.</li>
	<li>Sammeln Sie die schwimmenden Allantois durch Absaugen mit ~ 5 µL PBS in einer großen Öffnung von einer Pipettenspitze 200 µL. 1 Allantois/gut zu übertragen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Allantoides indem man die Mikrotiter-Platten in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5 % CO2) für z.B.6, 12 und 24 h. Zur Vermeidung von Interferenzen mit Allantois Anlage bewegen Sie Mikrotiter-Platten zwischen diesen Zeitpunkten nicht.</li>
	<li>Zu jedem Zeitpunkt der Gäste Allantois Anlage (z.B., keine Anlage/floating Allantois teilweise oder vollständig angehängte Allantois; voll Ausbreitung Allantois) unter Verwendung eines Mikroskops mit Phase Kontrast oder Differential Interferenz-Kontrast-Optik ausgestattet und ein 5 × oder 10 × Ziel (Abbildung 2). Hinweis: Repräsentative Beispiele für frisch isolierte und vollständig angehängte Allantoides sind in Abbildung 2gezeigt. Ex Utero, misst der distalen Spitze Allantoides vom Wildtyp C57BL/6J Mäusen isoliert innerhalb von 4-6 Stunden (Dies wird bezeichnet als partielle Befestigung der Allantois) und vollständige Befestigung des gesamten Allantois erfolgt innerhalb von ~ 12 h von Kultur. Von 18-24 Uhr hat der modellabhängigen abgeflacht und übernahm eine Kreisform (voll Allantois Spread bezeichnet) mit einem CD31-positiven vaskulären Plexus9,16.</li>
</ol>5. Bestätigung Färbung der explantierten Allantois für die Endothelzellen Markers CD31
<ol><li>Aspirieren Sie das Kulturmedium voll Ausbreitung Explantaten und beheben Sie die Zellen durch Zugabe von 40 µL/Well von 4 % (w/V) Paraformaldehyd/PBS zu. Hinweis: Paraformaldehyd ist giftig. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille zu Haut- und Augenkontakt vermeiden.</li>
	<li>10 min bei RT inkubieren Sie, dann aspirieren Sie überstand. Waschen Sie dreimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS, und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Permeabilize der Zellen und unspezifischen Bindungsstellen durch Zugabe von 40 µL/Well von 0,1 % (V/V) Triton X-100/0.1% (w/V) BSA/10% (V/V) normalem Ziegenserum mit PBS-Puffer für 30 min bei RT. Wash zweimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS zu blockieren und entfernen das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung. Hinweis: Das Protokoll kann über Nacht an dieser Stelle angehalten werden.</li>
	<li>Beflecken Sie Zellen durch Zugabe von 20 µL/Well des primären Anti-CD31 Antikörper 01:50 in 0,1 % (w/V) BSA/PBS verdünnt über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie dreimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS, und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Gebundenen primären Antikörper durch Zugabe von 20 µL/Well Eindringmittel beschriftet sekundäre Ziege Antikörper Anti-Ratte verdünnt 1: 200 in 0,1 % (w/V) BSA/PBS für 1 h bei RT. Protect Mikrotiter-Platten aus Licht indem einwickeln in Alufolie oder in einer dunklen Kammer zu erkennen. Waschen Sie dreimal durch Zugabe von 40 µL/Well des PBS, und entfernen Sie das Waschmedium durch sanfte Saugwirkung.</li>
	<li>Betten Sie Zellen durch Zugabe von 20 µL/Well Eindeckmedium ein. Inkubieren ~ 1 h bei RT bis das Eindeckmittel erstarrt ist. Bewahren Sie Mikrotiter-Platten bei RT oder bei 4 ° C, vor Licht geschützt auf.</li>
	<li>Bild der vaskulären Plexus der Allantois explants unter dem Fluoreszenzmikroskop mit einer 5 × oder 10 × Ziel und geeignete Fluoreszenz-Filter ausgestattet. Hinweis: Repräsentative Bilder der CD31-positiven vaskulären Plexus der voll Ausbreitung Allantois sind in Abbildung 3gezeigt. Andere Marker für den vaskulären Plexus, z. B. Antikörper gegen Flk-1, Flt, Tie-1 oder Tie-2 kann als gut16verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation.">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160 (2016).</li><li>Kane, S. V., Acquah, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene:+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation.">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes &amp; development. 9 (1), 1-14 (1995).</li><li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+(VCAM-1)+deficient+mice.">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li><li>Downs, K. M., Gardner, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allantois+and+chorion,+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion,+have+hematopoietic+potential.">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li><li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+atlas+of+the+integrin+adhesome.">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In Anwesenheit von Serum, das ist eine reiche Quelle von pro-Kleber extrazelluläre Matrix Moleküle wie Fibronektin, werden Allantois Explantaten leicht verschiedenen Kunststoff, Glas oder Filter Oberflächen9,16beimessen. Deshalb wenn der durchgeführten Test speziell die Auswirkung einer genetischen Veränderung zu untersuchen soll oder eine andere Behandlung auf Allantois Bindung an α4β1 immobilisiert, kritische, unspezifischen Bindungsstellen (z. B.</e...

Die Plazenta ist unverzichtbar für embryonale Wachstum und Entwicklung in der Gebärmutter. Es bildet die Schnittstelle für Sauerstoff, Metaboliten und Nährstoffaustausch zwischen fetalen und mütterlichen Kreislauf, und auch Funktionen als endokrine und immunologische Organ. Jede endogene oder exogene Beleidigung, die plazentaren Entwicklung beeinträchtigt führen zu intrauterine Wachstumsverzögerung, fetale Verlust oder Komplikationen während der Schwangerschaft, bei Mäusen und Menschen1. Während die Zahl der gezielten Maus Mutationen, abnorme plazentar Physiologie verursachen, weiter erhöht2, 219 Genotypen, die derzeit auf der Website der Maus Genom Informatik (MGI) aufgeführt (http://www.informatics.jax.org/vocab/ Mp_ontology / MP:0010038), viele von diesen Phänotypen sind nicht gut verstanden, aus einem mechanistischen Sicht. Neben der genetischen Veränderungen, niedermolekulare Medikamente, monoklonale Antikörper, Toxine beeinträchtigen Krankheitserreger, überschüssige Stoffwechselprodukte oder verschiedene Umweltfaktoren Plazenta-Entwicklung und Funktion3,4,5 , 6 , 7. doch einfach in-vitro- Tests, dass Modell wichtige Schritte in der Entwicklung der Plazenta knapp sind.
Murine plazentar Entwicklung im frühen Midgestation beginnt, wenn die Allantois (developmental Vorläufer der Nabelschnur) vom hinteren Ende des Embryos als eine Knospe entsteht, die in Richtung der Chorion8wächst. Chorioadhesive Zellen in der äußeren Schicht der Viruswenig Knospe vermitteln die Befestigung und Verbreitung der Allantois auf der Oberfläche des Chorion (chorioallantoic "Fusion"). Das Chorion faltet sich anschließend in Zotten in die das Gefäßsystem der Allantois wächst, das Labyrinth, die innere Schicht der Plazenta zu bilden, wo Nährstoffe und Sauerstoff zwischen eng nebeneinander angeordnete mütterlichen Blut Sinusoide und embryonale Gefäße9 ausgetauscht werden ,10.
Die Befestigung der Allantois an das Chorion ist der erste und entscheidende Schritt in Labyrinth Bildung und Mängel in diesem Prozess gehören zu den häufigsten Ursachen von embryonalen Tödlichkeit in midgestation1. Obwohl eine Reihe von Maus-Mutanten beschrieben worden, denen chorioallantoic Anlage scheitert10auftreten, und die MGI-Datenbank listet derzeit 108 Maus-Mutanten, die durch abnorme chorioallantoic Fusion (http:// gekennzeichnet sind Www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), die interzelluläre Interaktion zwischen die vaskuläre Zelle Adhäsion Molekül-1 (VCAM-1, drückte auf den Viruswenig Mesoderm) und α4β1 Integrin (ausgedrückt auf die Chorion Mesothelium, die abgeleitet von extraembryonic Mesoderm) scheint für chorioallantoic Anlage und Fusion11,12,13unverzichtbar sein. Immunhistochemische Färbung des gesamten-Mount Wildtyp Embryonen hat gezeigt, dass VCAM-1 innerhalb der distale zwei Drittel der Viruswenig Stiel etwa embryonale Tag (E) 7,5 ausgedrückt wird13 (1-4 Somiten Bühne) und seinen Ausdruck bleibt hoch während chorioallantoic Anlage und -Fusion11,12. Ausfall der Viruswenig Bindung an das Chorion ist in der Regel durch histologische Analysen der Gebärmutter Knospen erkannt. Jedoch Allantois Größen sind physiologisch sehr variabel zwischen und sogar innerhalb Würfe von der gleichen Entwicklungsstufe14, und die Allantois kann nur an die Chorion anfügen, wenn sie eine ausreichende Größe, körperlichen Kontakt zu machen erreicht hat. Reflektieren diese natürliche Variabilität, chorioallantoic Anlage findet irgendwann zwischen ~ E 8.0 und 9.0 E in der Gebärmutterund eine statistisch zuverlässige Beurteilung dieses Verfahrens durch Histologie ist also abhängig von der Analyse einer großen Anzahl von Conceptuses, genügend Exemplare in den entsprechenden Entwicklungsstadium zu erhalten.
Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung Viruswenig Anlage ex Utero , die Allantois Größe weniger abhängig ist. Wir demonstrieren das Sezieren von Mäuseembryonen und ihre Allantoides aus Uteri von schwangeren Mäusen ~ 8 Tage post Coitum (Dpc; Dpc 0,5 bezeichnet die Erkennung von einem vaginalen Stecker), und die nachfolgende Kultur der Allantois explants auf immobilisierte α4β1 Integrine. Diese Methode ermöglicht eine schnelle, funktionale Bewertung der Anlage und Verhalten von mehreren Allantois Explantaten parallel und zu verschiedenen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verbreiten. Das Protokoll kann verwendet werden zum Bildschirm für die Auswirkungen von gezielter Mutationen, Drogen oder verschiedene Umweltfaktoren auf Allantois Anlage ex Vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J wildtype mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&amp;nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forceps used to open the abdominal cavity.</td></tr><tr><td>Micro dissecting forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Straight blades.</td></tr><tr><td>Spring scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.</td></tr><tr><td>Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Spoon diameter.</td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 &amp;micro;L) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-&amp;#945;4&amp;#946;1-mediated binding to plastic.</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>3.5 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>Large orifice pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Low binding pipette tips, 200 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>&amp;#945;4&amp;#946;1 integrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &amp;#945;4&amp;#946;1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; but no L-glutamine, which is added separately.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 &amp;micro;g/mL streptomycin) stock solution.&amp;nbsp;Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>We use heat-inactivated FBS (heated to 56 &amp;deg;C for 30 min with mixing to inactivate complement).</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 &amp;micro;m pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>To make a formaldehyde solution in PBS, weigh &lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 &amp;deg;C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 &amp;deg;C for approximately four weeks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.</td></tr><tr><td>&amp;#945;-CD31 Antibodies</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rat antibodies</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.</td></tr></tbody></table>

dissection and explant culture of murine allantois for the in vitro analysis of allantoic attachment

Die Plazenta ist essentiell für das Wachstum und die Entwicklung von Säugetier-Embryonen. Aus diesem Grund können zahlreiche genetische Veränderungen und wahrscheinlich auch ökologische Beleidigungen, die Plazenta-Entwicklung oder Funktion stören frühen Schwangerschaft bei Mäusen und Menschen verloren gehen. Dennoch fehlen einfache in-vitro- Assays für mögliche Auswirkungen auf die Bildung der Plazenta auf den Bildschirm. Hier konzentrieren wir uns auf die Modellierung der ersten und entscheidenden Schritt in Plazenta-Formation, bestehend aus der Befestigung des die Allantois an der Chorion. Wir beschreiben eine Methode, um schnell die Befestigung der Viruswenig Explantaten an immobilisierte α4β1 Integrin, bewerten die als Chorio-mimetischen Substrat dient. Dieser in-vitro- Ansatz ermöglicht eine qualitative Bewertung der Anlage und Verhalten von mehreren Allantois Explantaten zu verschiedenen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verbreiten. Das Protokoll kann verwendet werden, untersuchen die Wirkung von gezielten Maus Mutationen, Drogen oder verschiedene Umweltfaktoren, die zu Komplikationen während der Schwangerschaft oder fetale Verlust aus der Allantois Anlage ex Vivoverknüpft wurden.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum isolieren und explant murinen Allantoides ex Vivound details die qualitative Bewertung der Allantois Bindung an α4β1 Integrin, ein kritischer Prozess bei der in Vivo chorioallantoic Fusion. Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 1A–H zeigen die aufeinander folgenden Schritte der Allantois Isolation der schwangeren Gebärmutter ab. Mütterlichen Gewebe, d...

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Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Wir beschreiben einen in-vitro- Test auf Modell chorioallantoic Anlage, der erste Schritt bei der Bildung der Plazenta. Das Protokoll zeigt die Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantoides auf immobilisierte α4β1 Integrin. Allantois Anlage wird mikroskopisch zu vorher festgelegten Zeitpunkten ausgewertet.

Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

7.8K Aufrufe.  University of Würzburg. Wir beschreiben einen in-vitro- Test auf Modell chorioallantoic Anlage, der erste Schritt bei der Bildung der Plazenta. Das Protokoll zeigt die Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantoides auf immobilisierte α4β1 Integrin. Allantois Anlage wird mikroskopisch zu vorher festgelegten Zeitpunkten ausgewertet.

Serie: Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Verwendung von In Vivo und Gewebe und Zelle Explant Ansätze zur Untersuchung der Morphogenese und Pathogenese der embryonalen und perinatale Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Immunologie und Infektion

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental treatments. However, because of their small body size, some structures, such as the oviduct with a diameter of 200-400 &#956;m, have proven to be relatively difficult to study except by immunohistochemistry. Recently, immunohistochemical studies have uncovered more complex differences in oviduct segments than were previously recognized; thus, the oviduct is divided into four functional segments with different ratios of seven distinct epithelial cell types. The different embryological origins and ratios of the epithelial cell types likely make the four functional regions differentially susceptible to disease. For example, precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas arise from the infundibulum in mouse models and from the corresponding fimbrial region in the human fallopian tube. The protocol described here details a method for microdissection to subdivide the oviduct in such a way to yield a sufficient amount and purity of RNA necessary for downstream analysis such as reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNAseq). Also described is a mostly non-enzymatic tissue dissociation method appropriate for flow cytometry or single cell RNAseq analysis of fully differentiated oviductal cells. The methods described will facilitate further research utilizing the murine oviduct in the field of reproduction, fertility, cancer, and immunology.

A method for microdissection of the mouse oviduct that allows collection of the individual segments while maintaining RNA integrity is presented. In addition, non-enzymatic oviductal cell dissociation procedure is described. The methods are appropriate for subsequent gene and protein analysis of the functionally different oviductal segments and dissociated oviductal cells.

Mikrodissektion und Dissoziation des Murinen Eileiters: Identifizierung einzelner Segmente und Einzelzellisolierung

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Biologie

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Establishing Villous and Decidual Organ Cultures as Ex Vivo Models of Human Maternal-Fetal Interface

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the establishment of primary human placental villous and decidual organ cultures in ex vivo conditions. These models are well-suited for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface.

Etablierung von Zotten- und Dezidualorgankulturen als ex vivo Modelle der menschlichen Maternal-Fetal-Schnittstelle

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage

Zusammenfassung

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