אנחנו רוצים לתת תודות לחברים ישנים יותר של המעבדה המסייעים לשפר, לשכלל את הטכניקות האלו למצבו בפועל: ד ר סיליה מרטינז-Mora; ד ר אנה Mrowiec, ד ר קטלינה רואיז-Cañada, ד"ר אנטוניה אלקאראז-גארסיה.... . אנחנו חבים החולים Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca לתמיכה בחריפות את הפיתוח של טכניקות אלה. גם אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III, Fondo דה Investigaciones Sanitarias. תוכנית Estatal אני + D + אני ואת אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי-Subdirección גנרל דה Evaluación y מטאליסט de la Investigación (מענק מס: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos פדר "Una בדרך זו דה ש אירופה". אנו מודים גם למד דה מורסיה, IMIB-Arrixaca ו- FFIS עבור מנהלי תמיכה וסיוע. לבסוף, אנחנו רוצים לתת תודה ד ר איזבל Martínez-Argudo, את Facultad עצמה Ambientales y Bioquímica, קמפוס Tecnológico de la Fábrica דה ארמאס, למד קסטיליה לה מנצ'ה, טולדו על תמיכתם סוג של ויתור מרצון מיוחדת וההתערבות והמעבדה ביוטכנולוגיה לעשות אפשרי החלק מצולם של מאמר זה.

1. מלאכותי הפצע Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים
<ol>
	<li>הכנת טפט תא
	<ol>
		<li>עובד תחת תנאים סטריליים, זרע ולגדול Mv1Lu או HaCaT תאים אפיתל מבחנות תרבות באמצעות בתוספת-סרום בינוני. רענן בינוני פעם כל 24-48 שעות. לאחר תאים להגיע למפגש 80%, ניתוק תאים באמצעות של השיטה המתאימה, כלומר, trypsinization9. הערה: Mv1Lu HaCaT שורות תאים אפיתל מתורבתים באמצעות EMEM ו- DEMEM תרבות בינוני, בהתאמה, בתוספת 2 מ מגלוטמין ו מודגרות ב 37 ° C עם אווירה מבוקרת של 5% CO2. כל קו תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-4 x 104 או 4-6 x תאים4 10/טוב, בהתאמה, הם נזרע בבקבוקון תרבות2 175 ס' ' מ, ב- 80% הנהרות מניב עד 35 x 106 Mv1Lu או עונה 1 פרק 107 HaCaT תאים.</li>
		<li>בצלחת או תרבות טוב 12 או 24-ובכן, זרע היטב כל 2 מ"ל של תאים. רענן בינוני לאחר כל ה 24-48 מספרי הטלפון הנייד ודא גבוה מספיק כדי להגיע למפגש 100% לאחר 2-3 ימים.</li>
		<li>אחרי התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיום בתוספת-סרום, לשטוף פעמיים עם בינונית ללא סרום טריים. לשמור תאים ללא סרום בינוני במשך 24 שעות לפני גירוד. הערה: תאים Mv1Lu או HaCaT אין דרישות מיוחדות המצע; עם זאת, עבור שורות תאים רגישים ניתוק באופן ספונטני בתנאים ללא סרום, ציפוי מראש של המשטח צלחת תרבות באמצעות פתרון פולי-L-ליזין יש לשקול10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>טפט מגרד
	<ol>
		<li>עובד בסביבה סטרילית, לגרד את טפט תרבות על-ידי בחוזקה גרירת הקצה הצר של µL 20 או 200 עצה micropipette עקר µL, בהתאם הרוחב הרצוי מאפס. שמור על הקצה בניצב למשטח תרבות להגדיל את הפער הומוגניות.<ol>
			<li>מקם את הצלחות התרבות על-גבי משטח כהה לעקוב בבירור את טפט תא. במידת הצורך, לבצע שתי שריטות בניצב (בצורת צלב) על כל טוב ללמוד עד 4 תחומי ההעברה.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>רחץ מנותקת תאים על-ידי הסרת בעדינות תרבות בינונית, הוספת בעדינות בינוני טריים ללא סרום. חזור על שתי פעמים, או עד ביותר כעיגולים בצבע תאים הוסרו.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הליך ניסיוני ואיסוף נתונים
	<ol>
		<li>לקחת עד 4 תמונות ההפניה טיפול טרום שבמרכזה הפער גירוד כל טוב להשתמש במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוך שילוב מצלמת CCD. בחר תחומי עניין על ידי יישור הקצה של מיקרוסקופ שדה לצומת הסמוך של שריטות. הערה: בדרך כלל, תמונות נרכשים באמצעות הגדלה של 10 x וגודל התמונה 1,280 x 1,024 פיקסלים. בחירת אזורים ריבית כפי שתואר לעיל מסייע עבור איתור קל ונוח ואימות של עד 4 מידות לכל טוב.</li>
		<li>לאחר כל התמונות נרכשים, לייעד בארות הטיפול; חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו. הערה: לחלופין, כימיקלים או תרכובות אל תפריעי הומוגניות תרבות בינוני, טיפולים ניתן לקבל חיסון ישירות לתוך המדיום תרבות.</li>
		<li>דגירה לצלחת שרוט (37 ° C עם אווירה מבוקרת המכילה 5% CO2) עד התנאים תחת תצפית יד 90% פער מאפס הסגר. הימנע הסגר מלא. הערה: סגירת הפער הכולל יבטל אוסף התמונות שלאחר הטיפול התייחסות לתחומים שאינם לזיהוי, אין אפשרות להקים את ההפניה זמן עד לסגירת הפער. במקרה של תאים Mv1Lu או HaCaT, 16-19 h נדרשים להגיע למפגש 90%.</li>
		<li>לעצור את נדידת תאים על-ידי תיקון התאים; בעדינות להחליף המדיום תרבות ניסיוני 1 מ"ל של פורמלין 4% ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT.</li>
		<li>לשטוף את התאים כדי להסיר עודפי פורמלין; בעדינות להחליף את הפתרון ב הבארות PBS טריים. חזור על פחות פעמיים. הערה: בשלב זה, לאחר איטום, צלחות שניתן לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
		<li>קח תמונות הפניה שלאחר הטיפול של כל טוב מאזורי ההפניה המקורית כבשו לאחר גירוד. השתמש באותו הציוד (מיקרוסקופ הפוכה ניגודיות שלב אופטי שילוב מצלמת CCD) התאמת הגדרות תמונה (הגדלה ו רזולוציה דיגיטלי/צפיפות). הערה: עבור תאים נודדים בנפרד, ממלא את הפער ללא תלות היווצרות של חזית קוהרנטית (למשל, תאים אנושיים של סרטן השד של מד א-MB-231), התמונות כמובן זמן עשוי לאפשר את החישוב של מהירויות העברה תא בודד.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ניתוח תמונות, כימות של ההעברה
	<ol>
		<li>באמצעות עיבוד תוכנה (לדוגמה, ImageJ) תמונה, להגדיר הפער מאפס הגבולות ולקבוע על פני פער מידות עד ארבע תמונות טיפול קדם. לרשום את הנתונים כמו "טיפול קדם הפער השטח" (PREGAP). חזור על הפעולות אותן לתמונות שלאחר הטיפול. לרשום את הנתונים כמו "gap שלאחר הטיפול השטח" (POSTGAP).<ol>
			<li>פתחו את התמונה נרשם באמצעות ImageJ. בתפריט 'תמונה', להגדיר סוג תמונה 8 סיביות. בתפריט "תהליך", פתח את תפריט המשנה "מסננים" ו להחיל סינון "סטיה".</li>
			<li>תפריט 'תמונה', הזן "להתאים" את תפריט המשנה ואת סף הגדרת שחור-לבן (B &#38; W), ודא "רקע כהה" לא נבחרה. בתפריט "תהליך", ללכת המשנה "בינארי" ובחר "מלא חורים".</li>
			<li>בתפריט "לנתח", בחרו "לקבוע מידות", להפעיל את "אזור". ואז לצייר את האזור מדיד בעקבות קו המתאר הקצה נודדים ובכך-שתוחם את הפער.</li>
			<li>בתפריט "לנתח", בחר "לנתח חלקיקים" והקלטה של "שטח" ערכים עבור השטח אזור מצוירות.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>להציג את ערכי השטח הכולל PREGAP ו- POSTGAP בגיליון לכמת ההעברה מוחלטת עבור כל ערכה של דוגמאות בודדות כהפרש של פער מידות משטח: − PREGAP POSTGAP [יחידות שרירותי]. בנוסף, לנרמל מוחלט העברת הנתונים של כל תנאי כדי לשלוט דגימות: (לטעום / לשלוט) * 100 [%]. הערה: עבור תאים נודדים בנפרד, ממלא את הפער ללא תלות היווצרות של חזית קוהרנטית, (למשל, תאים אנושיים של סרטן השד של מד א-MB-231), ההעברה מוחלט יכול להיות מחושב על ידי ספירת תאים פולשים מרכזי להתפשט גם ב הפקד או דגימות שטופלו.</li>
		<li>מגרש כימות פלטי (ראה איור 1). לבצע ניתוח סטטיסטי במידת הצורך.</li></ol></li></ol>שקול מבחן t של סטודנט בעת השוואת שני תנאים או השונות לבדיקת מספר גדול יותר של מצבים.
	
	

2. מלאכותי ההעברה Assay קבלה ללימודי טופוגרפיים
<ol>
	<li>הכנת טפט תא
	<ol>
		<li>עבודה בתנאים סטריליים, מקום שכבה אחת של סטיריליים coverslips סיבוב צלחות ריקות תרבות עד פני השטח של הלוח מכוסה לגמרי. הערה: עד 12 ו- 33 coverslips להתאים 5 ס מ וצלחות בקוטר 10 ס מ, בהתאמה.</li>
		<li>על הצלחת תרבות בעדינות זרע אמצעי אחסון נאותים של תאים על ריכוז המאפשר זרימה 100% לאחר 2-3 ימים. לוודא ש-coverslip לא חופף coverslips שכנים ולמנוע coverslips צף על ידי הפעלת לחץ עדין עם טיפ micropipette סטרילי. רענן המדיום כל 24-48 שעות. הערה: בכל שורה תא חייב להיות לבדיקה ביסודיות כדי לקבוע ריכוז התא ואת התזמון הנדרש כדי להגיע confluency מלא. בדרך כלל עבור תאים Mv1Lu או HaCaT, 2-3 x 106 או 2.5-4 x 106 תאים/10 ס מ קוטר צלחת, בהתאמה, הם נזרע. עבור לוחות קטנים יותר, מספרי הטלפון הנייד חייב זה מדע פשוט.</li>
		<li>לאחר התאים להגיע למפגש, להסיר את המדיום בתוספת-סרום והחלף בינונית ללא סרום טריים. שמור את התאים ללא סרום בינונית במשך 24 שעות לפני הפציעה מלאכותיים מתבצע. הערה: תאים Mv1Lu או HaCaT אין דרישות מיוחדות המצע; עם זאת, עבור שורות תאים רגישים של ניתוק באופן ספונטני בתנאים ללא סרום, ציפוי מראש של המשטח תרבות באמצעות פתרון פולי-L-ליזין יש לשקול10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>טפט ופצעו
	<ol>
		<li>באמצעות פינצטה סטרילי, להעביר בעדינות coverslip צלחת 10 ס מ נקי המכיל בינונית ללא סרום טריים. למנוע פגיעה של טפט על-ידי החזקת את coverslip בפריפריה עם פינצטה. הימנע לחץ רב מדי אשר עלולה לגרום coverslip שבירה.</li>
		<li>ליצור פצעים מלאכותי על-ידי גרירת תער סטיריליים בקו רוחבי של מרכז coverslips. גרור 3-4 מ מ מאחור וושוב, על מנת להסיר לחלוטין את רצועת טפט המרכזית. ודא שאין שאריות תאים נשאר צמוד לקצוות פצועים. הערה: על קוטר 12-מ מ מסביב coverslip, החתך מתבצע בדלפק אמצע של coverslip. הקפד להשאיר פס של תאים מול החזית הראשית גדול מספיק (לפחות 2 מ מ רחב) כדי למנוע הטיה של coverslip בשלבים הבאים.</li>
		<li>העבר את הפצועים coverslips תאים פונה כלפי מעלה, למדיום נקי 6-ובכן צלחת המכיל לפחות 2 מ"ל טריים ללא סרום. מתאים ל-4 פצועים coverslips/טוב.</li>
		<li>בעדינות לשטוף פעמיים שימוש במוצרים טריים ללא סרום בינוני כדי להסיר תאים מנותקת.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ניתוח ניסיוני ודגימה
	<ol>
		<li>בעדינות חילופי המדיום ב הבארות בינונית טרייה הכולל טיפולים שנבחרו. הערה: לחלופין, כימיקלים או תרכובות אל תפריעי הומוגניות תרבות בינוני, טיפולים ניתן לקבל חיסון ישירות לתוך המדיום תרבות. . המשך בזהירות כדי למנוע כל ניתוק התא פוטנציאליים.</li>
		<li>לשמור את הצלחת בתוך חממה התא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) העיתוי ניסיוני הרצוי.</li>
		<li>לעצור את נדידת תאים על-ידי תיקון התאים; בעדינות להחליף המדיום תרבות ניסיוני 1 מ"ל של פורמלין 4% ב- PBS. תקופת דגירה של 15 דקות ב- RT. הערה: זמן הקורס ניסויים, להסיר את הדגימות לצלחת תרבות ותקן אותן בצלחת נפרדת כדי להימנע האדים פורמלין להשפיע על התנאים ניסיוני אחרים, שוטף.</li>
		<li>לשטוף את התאים כדי להסיר עודפי פורמלין; בעדינות להחליף את הפתרון ב הבארות PBS טריים. חזור על פחות פעמיים. הערה: בשלב זה, לאחר איטום, צלחות שניתן לאחסן ב 4 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunofluorescence (אם) וניתוח טופולוגי
	<ol>
		<li>לבצע אם מכתים, הדמיה על coverslips בודדים כפי שתואר במקומות אחרים3,4,11.<ol>
			<li>Permeabilize 10 דקות במועט coverslips בפתרון טריטון X-100 0.3% ב- PBS.</li>
			<li>בלוק למשך 30 דקות באמצעות חסימת הפתרון הבאים: 0.3% אלבומין שור; סרום שור עוברית 10%; חלב רזה 5%; 0.3 פתרון טריטון X-100% ב- PBS. הערה: חסימת פתרון ללא החלב ניתן להכין מראש, המאוחסנים ב-20 ° C.</li>
			<li>תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר בתוך תא לחה, עם נוגדן ראשוני מדולל בפתרון חסימה ללא חלב. מקם את coverslips הפוך בפתרון נוגדן 15 µL כדי להבטיח חלוקה נכונה. הערה: דילול עבודה נוגדן משתנה, תלוי הנוגדן בשימוש. כך למשל, נוגדן anti-c-יוני ארנב דורש לדילול 1/100.</li>
			<li>רחץ שלוש פעמים על ידי שילוב של coverslips בפתרון טריטון X-100 0.1% בתוך ב- PBS.</li>
			<li>דגירה על coverslips ב נוגדנים משניים מדולל במאגר חלב נטול החוסמים למשך 30 דקות. הערה: דילול עבודה נוגדן משתנה, תלוי הנוגדן בשימוש. לדוגמה, העז-נגד-הארנב (488) מחייב לדילול 1/400 רזולוציה מיטבית. ריאגנטים תיוג אחרים כגון phalloidin ו- Hoechst 33258 ניתן להוסיף למאגר הדגירה בשלב זה.</li>
			<li>רחץ שלוש פעמים על ידי שילוב של coverslips בפתרון טריטון X-100 0.1% ב- PBS.</li>
			<li>הר coverslips על ההפוכות ב- 10 µL הרכבה מדיה טיפה (למשל, Vectashield) מניחים על שקופית מיקרוסקופ. להשאיר את השקופיות בחשיכה בטמפרטורת החדר למשך הלילה עבור הרכבה בינונית התקשות. לאחר מכן, לאחסן ב 4 ° C בחושך ללא הגבלת זמן.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>להשיג epifluorescence או מיקרוסקופיה קונפוקלית תמונות של שינויים מבניים המתרחשים בקצה הקדמי נודדים. הערה: מחקרים טופולוגי יכול להתבצע על ידי ריצוף תמונות מהחזית העברת טפט הפנימי. מחקרים כמותיים למחצה אפשריים על ידי ניתוח תוכנה המבוססת על עוצמות קרינה פלואורסצנטית מקומיים.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+wound+healing.">Cutaneous wound healing.</a> N Engl J Med. 341 (10), 738-746 (1999).</li><li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+wound+repair.">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290, S1-S11 (1998).</li><li>Alcaraz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+Membrane+Modifies+the+Genetic+Program+Induced+by+TGFss,+Stimulating+Keratinocyte+Proliferation+and+Migration+in+Chronic+Wounds.">Amniotic Membrane Modifies the Genetic Program Induced by TGFss, Stimulating Keratinocyte Proliferation and Migration in Chronic Wounds.</a> PLoS One. 10 (8), e0135324 (2015).</li><li>Ruiz-Canada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+stimulates+cell+migration+by+modulating+Transforming+Growth+Factor-beta+signaling.">Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating Transforming Growth Factor-beta signaling.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2017).</li><li>Schmierer, B., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta-SMAD+signal+transduction:+molecular+specificity+and+functional+flexibility.">TGFbeta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 970-982 (2007).</li><li>Hu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAK+and+paxillin+dynamics+at+focal+adhesions+in+the+protrusions+of+migrating+cells.">FAK and paxillin dynamics at focal adhesions in the protrusions of migrating cells.</a> Sci Rep. 4, 6024 (2014).</li><li>Martinez-Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroin+and+sericin+from+Bombyx+mori+silk+stimulate+cell+migration+through+upregulation+and+phosphorylation+of+c-Jun.">Fibroin and sericin from Bombyx mori silk stimulate cell migration through upregulation and phosphorylation of c-Jun.</a> PloS one. 7 (7), e42271 (2012).</li><li>Bernabe-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+induces+migration+in+Mv1Lu+and+MDA-MB-231+epithelial+cells+involving+EGF+receptor+and+MAP+kinases+activation.">Oleanolic acid induces migration in Mv1Lu and MDA-MB-231 epithelial cells involving EGF receptor and MAP kinases activation.</a> PLoS One. 12 (2), e0172574 (2017).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J Biomed Sci. 17, 36 (2010).</li><li>Liberio, M. S., Sadowski, M. C., Soekmadji, C., Davis, R. A., Nelson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+tissue+culture+coating+substrates+on+prostate+cancer+cell+adherence,+morphology+and+behavior.">Differential effects of tissue culture coating substrates on prostate cancer cell adherence, morphology and behavior.</a> PLoS One. 9 (11), e112122 (2014).</li><li>Pierreux, C. E., Nicolas, F. J., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta-independent+shuttling+of+Smad4+between+the+cytoplasm+and+nucleus.">Transforming growth factor beta-independent shuttling of Smad4 between the cytoplasm and nucleus.</a> Mol Cell Biol. 20 (23), 9041-9054 (2000).</li><li>Barrientos, S., Stojadinovic, O., Golinko, M. S., Brem, H., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+and+cytokines+in+wound+healing.">Growth factors and cytokines in wound healing.</a> Wound repair and regeneration: official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 16 (5), 585-601 (2008).</li><li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it?.">Animal models of wound repair: Are they cutting it?.</a> Exp Dermatol. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Insausti, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+induces+epithelialization+in+massive+posttraumatic+wounds.">Amniotic membrane induces epithelialization in massive posttraumatic wounds.</a> Wound Repair Regen. 18 (4), 368-377 (2010).</li><li>Wu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+arrest+in+G0/G1+phase+by+contact+inhibition+and+TGF-beta+1+in+mink+Mv1Lu+lung+epithelial+cells.">Cell cycle arrest in G0/G1 phase by contact inhibition and TGF-beta 1 in mink Mv1Lu lung epithelial cells.</a> Am J Physiol. 270 (5 Pt 1), L879-L888 (1996).</li><li>Boukamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line.">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li><li>Marshall, J., Wells, C. M., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Migration: Developmental Methods and Protocols. , 97-110 (2011).</li><li>Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+accurate+quantification+of+cell+migration+using+human+small+intestine+cells.">An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells.</a> Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).</li><li>Szybalski, W., Iyer, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinking+of+DNA+by+Enzymatically+or+Chemically+Activated+Mitomycins+and+Porfiromycins,+Bifunctionally+"Alkylating"+Antibiotics.">Crosslinking of DNA by Enzymatically or Chemically Activated Mitomycins and Porfiromycins, Bifunctionally "Alkylating" Antibiotics.</a> Fed Proc. 23, 946-957 (1964).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chem Biol. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Sherry, D. M., Parks, E. E., Bullen, E. C., Updike, D. L., Howard, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption.">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li><li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction.">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li><li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro.">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין אין ניגוד אינטרסים.

על העור או קרום רירי השיבושים, הפונקציה מכשול משוחזר על ידי הפעולות של סוגי תאים רבים, לרבות fibroblasts תאים אפיתל ואת המערכת החיסונית. בצמדים, תאים אלו עוברים מתחם פרוצס מעורבים אפופטוזיס, התפשטות, בידול, חשוב, פיברובלסט ואפיתל תא ההעברה, אשר הוא מנגנון האולטימטיבי האחראי על שיקום של הרקמה שיב?...

נדידת תאים דרוש לריפוי הפצע, כפי שהוא אחראי על הסגר הסופי של הפער אפיתל ושיקום של פני השטח שיבשו1. ביצוע פצעים מלאכותי בבעלי חיים מאפשר להקים את ההעתק של תהליך מורכב זה ליד בתנאים פיזיולוגיים2. עם זאת, גישה זו לעתים קרובות התוצאות נהלים ניסיוני יקר ומסובך, שעשוי להיות חסרי דיוק לחקר תהליכים ברורים, בשל אופיו המורכב של תהליך ריפוי פצע.
In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק אלטרנטיבה מועיל חייתיים לחקור את התפקיד כי תאים אלה לשחק ב ריפוי הפצע ואת ההשפעות של טיפול להתנהגות הנדידה התא. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת על ידי טכניקות מולקולריות באמצעות התרבויות הלא-confluent3,4,5,6; עם זאת, שיבוש שלמות אפיתל בדרך כלל מושגת על ידי חתכים מכני טוב. בתרבות תא, זה מרמז כי עלול להיות חשוף זניח מספר התאים הפער הפצע, הם מייצגים מדגם קטן מדי עבור שיטות בביולוגיה מולקולרית. עם זאת, נגעים אלה ניתן יהיה ללמוד את קנה המידה מיקרוסקופיים, מנצל המאפיינים נודדות מולדת של שורות תאים אפיתל מסוימים, כגון התא מינק ריאות אפיתל (Mv1Lu) או את התא באופן ספונטני מונצחים אנושי תקין (HaCaT) קווים.
כאן אנחנו תיאר שיטה מיקרוסקופ מתאימה לקבל נתונים כמותיים על ההעברה של תאי אפיתל כנגד בהקשר של3,-4,-7,-8ריפוי הפצע. יתר על כן, אנו מציגים נוספים בשיטות שאינן מועילות ללמוד שינויים מורפולוגיים המולקולריים איכותית המתרחשים monolayers אפיתל במהלך ההעברה. בסך הכל, שיטות אלה מספקים מסגרת ללמוד dynamics והן שינויים מורפולוגיים מעורב עם תאים אפיתל התנהגות בתגובה טיפולים במהלך ריפוי הפצע.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Biowest, Nuaill&#233;, France</td>
			<td>L0102-500</td>
			<td>Optional 10 % FBS supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagles&#8217;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12 -662F</td>
			<td>Optional 10 % FBS supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td>Use at 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>DE17603A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>T4049</td>
			<td>Dilute as appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14200-067</td>
			<td>Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>BD FALCON//SARSTED</td>
			<td>734-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83-3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Used 10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glass</td>
			<td>MENZEL-GL&#196;SER</td>
			<td>MENZCB00120RA020</td>
			<td>SHORT DEPTH OF FIELD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforced razor blade no. 743</td>
			<td>Martor (through VWR)</td>
			<td>MARO743.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l sterile aerosol pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;l sterile aerosol pipet tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-0528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera coupled phase contrast microscope</td>
			<td>Motic Spain</td>
			<td>Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>ZEISS Microimaging, Germany</td>
			<td>LSM 510 META</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Culture dish</td>
			<td>BD FALCON</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-1694</td>
			<td>Used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Used 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst-33258</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>14530</td>
			<td>Used 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Used 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-2323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, USA</td>
			<td>Release 1.50i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen LSM 510 image processing software</td>
			<td>ZEISS Microimaging, Germany</td>
			<td>Release 5.0 SP 1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscopy based methods for the assessment of epithelial cell migration during in vitro wound healing

נדידת תאים הוא היבט חובה עבור ריפוי הפצע. יצירה מלאכותית פצעים בדגמים בעלי חיים למחקר לעיתים קרובות תוצאות בפרוצדורות ניסיוני יקר ומסובך, בעוד פוטנציאלי חסר דיוק. In vitro לקשרי תרבות של שורות תאים אפיתל מספק הפלטפורמה המתאימה עבור חוקר ההתנהגות נודדות תא ריפוי הפצע, את ההשפעה של טיפולים על תאים אלה. הפיזיולוגיה של תאים אפיתל לעיתים קרובות נלמדת בתנאים שאינם-confluent; עם זאת, גישה זו אולי לא מזכירים ריפוי בתנאים טבעיים הפצע. לשבש את תקינות אפיתל באמצעים מכניים יוצר מודל מציאותי, אך עשוי לעכב את היישום של טכניקות מולקולריות. כתוצאה מכך, טכניקות במיקרוסקופ מבוסס הם אופטימליים ללימוד נדידת תאים אפיתל במבחנה. כאן אנחנו מפרטים שתי שיטות ספציפיות, וזמינותו גירוד פצע מלאכותי, וזמינותו קבלה העברה מלאכותית, תועמד נתונים כמותיים ואיכותניים, בהתאמה, על הביצועים הנדידה של תאים אפיתל.

הפצע מלאכותי Assay מאפס עבור מחקרים כמותיים: הערכת גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) קידום של ההעברה:
EGF היא משרן ידועים של התפשטות תאים אפיתל, הגירה, ובכך פקד חיובי לכימות תנועת הגירה קידום. Monolayers תא Mv1Lu, HaCaT שימשו מבחני מאפס הפצע, טיפול קדם תמונות התקב?...

Watch this Scientific Journal Video about Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing at JoVE.com

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

9.2K Views.  IMIB-Arrixaca. כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

Video: Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

מודל עכברי של ריפוי פצע

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

העכברי אנדוסקופיה ל<em&gt; בVivo</em&gt; ריפוי Multimodal הדמיה של היווצרות הסרטן וההערכה של מעיים פצע ודלקת

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The etiology of IBD remains unknown and current therapeutic strategies are based on the unspecific suppression of the immune system. The development of treatments that specifically target intestinal inflammation and epithelial wound healing could significantly improve management of IBD, however this requires accurate detection of inflammatory changes. Currently, potential drug candidates are usually evaluated using animal models in vivo or with cell culture based techniques in vitro. Histological examination usually requires the cells or tissues of interest to be stained, which may alter the sample characteristics and furthermore, the interpretation of findings can vary by investigator expertise. Digital holographic microscopy (DHM), based on the detection of optical path length delay, allows stain-free quantitative phase contrast imaging. This allows the results to be directly correlated with absolute biophysical parameters. We demonstrate how measurement of changes in tissue density with DHM, based on refractive index measurement, can quantify inflammatory alterations, without staining, in different layers of colonic tissue specimens from mice and humans with colitis. Additionally, we demonstrate continuous multimodal label-free monitoring of epithelial wound healing in vitro, possible using DHM through the simple automated determination of the wounded area and simultaneous determination of morphological parameters such as dry mass and layer thickness of migrating cells. In conclusion, DHM represents a valuable, novel and quantitative tool for the assessment of intestinal inflammation with absolute values for parameters possible, simplified quantification of epithelial wound healing in vitro and therefore has high potential for translational diagnostic use.

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

בשלב הדמיה כמוני מולטימודליות עם דיגיטלי הולוגרפי מיקרוסקופי מדויקת מעריך דלקת מעיים ו אפיתל ריפוי פצעים

The incidence of inflammatory bowel disease, i.e., Crohn&#39;s disease and Ulcerative colitis, has significantly increased over the last decade. The ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

יצירת והשתלות של גיליון נגזר שומן בתאי גזע (ASC) במודל של ריפוי פצע סוכרתי

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is often capped with biocompatible materials in order to expedite pulpal wound healing. The ultimate goal is to regenerate reparative dentin, a physical barrier that functions as a "biological seal" and protects the underlying pulp tissue. Although this direct pulp-capping procedure has long been used in dentistry, the underlying molecular mechanism of pulpal wound healing and reparative dentin formation is still poorly understood. To induce reparative dentin, pulp capping has been performed experimentally in large animals, but less so in mice, presumably due to their small sizes and the ensuing technical difficulties. Here, we present a detailed, step-by-step method of performing a pulp-capping procedure in mice, including the preparation of a Class-I-like cavity, the placement of pulp-capping materials, and the restoration procedure using dental composite. Our pulp-capping mouse model will be instrumental in investigating the fundamental molecular mechanisms of pulpal wound healing in the context of reparative dentin in vivo by enabling the use of transgenic or knockout mice that are widely available in the research community.

We describe a step-by-step method of performing direct pulp capping on mice teeth for the evaluation of pulpal wound healing and reparative dentin formation in vivo.

פיתוח מודל ישיר מכסת-זול עבור הערכת pulpal ריפוי פצע גיבוש מתקנת הדנטין של עכברים

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Targeting Gray Rami Communicantes in Selective Chemical Lumbar Sympathectomy

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the lower extremities, hyperhidrosis, etc. It is commonly practiced to position the puncture needle tip in front of the anterior fascia of the psoas major muscle and inject the inactivating agent around the sympathetic trunk, which is defined as conventional CLS. Although relatively rare, ureteropelvic damage is the most frequently reported complication of conventional CLS and can cause serious harm to patients. We found that injecting the inactivating agent behind the anterior fascia, which only targets gray rami communicantes, helped achieve therapeutic efficacy in&#160;vasodilation, sweat reduction, and pain relief comparable to conventional CLS, and serious complications were largely reduced. We define this procedure as selective CLS. Here, we present a protocol of selective CLS. The precise needle tract and accurate evaluation of the spreading of the contrast agent are critical to ensure that the drug is injected behind the anterior fascia of the psoas major muscle. The needle tip is at approximately one-third the dividing line of the vertebral body in the lateral view of a lumbar X-ray. The contrast is mainly confined around the needle tip and spreads outward and downward along the psoas muscle fibers. In this way, the anterior fascia provides a natural barrier for the ureteropelvic area, and the psoas major muscle provides a natural barrier for the lumbar nerve root. There are several highlights of this article, including 1) a detailed description of the selective CLS procedures, 2) an explanation of the anatomical basis for the implementation of selective CLS, and 3) an explanation of the differences between selective and conventional CLS.

We present a protocol for selective chemical lumbar sympathectomy (CLS), which inactivates only gray rami communicantes and not the sympathetic trunk. Selective CLS can help achieve therapeutic efficacy in vasodilation, sweat reduction, and pain relief that are comparable to conventional CLS, and serious complications, particularly ureteropelvic damages, can be reduced.

פילוח רמי אפור Communicantes ב Sympathectomy סלקטיבית המותני כימי

Chemical lumbar sympathectomy (CLS) is a commonly used, minimally invasive procedure for the treatment of conditions including ischemic diseases of the ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...