המועצה הדנית למען מחקר עצמאי, טכנולוגיה, ייצור, להעניק #4005-00029

הגדרת הניסוי נערך מסכים עם אוניברסיטת רוסקילדה, ויש אין מגבלה אתית ומשפטית. סקירה כללית של הסידור ניסיוני ניתן לראות באיור 1 ואת המנגנונים של המצלמה אופטי באיור2.
1. הכנה
<ol><li>לבצע את כל הצעדים זרימה שכבתית-ספסל סטרילי על-ידי ניקוי הספסל, חסכון כל עם 70% אתנול לפני התחלת הניסוי.</li>
	<li>מקם את המצלמה אופטי חממה קונבנציונאלי ב 37 ° C עם 5% CO2 ליצירת תנאים אופטימליים עבור התאים.</li>
	<li>לגדל תאים HaCaT בתקשורת DMEM עם 10% FBS ואנטיביוטיקה 1 x (פניצילין, סטרפטומיצין) בבקבוקון T75.</li>
	<li>השתמש טריפסין 1 x 1 מ"ל כדי לנתק את התאים ואת תת מטפח אותן כל 3-4 ימים, על ידי פיזור זה מעל השכבה הסלולר. מחממים מראש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
</ol>2. יצירת של טפט של HaCaT תאים בצלחת Microtiter 48-ולס
<ol><li>הסר את המדיום של הבקבוק T75 עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>רחץ התאים חסיד הבקבוק על-ידי הוספת מ ל 1 x PBS עקר הבקבוקון T75. הערה: ודא PBS חינם של סידן ומגנזיום.</li>
	<li>הפיצו את PBS ולהסיר אותו עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>חזור על שלב 2.2-2.3.</li>
	<li>להוסיף הבקבוקון טריפסין 1 x 1 מ"ל ומעוררים אותה לאורך השכבה התא.</li>
	<li>דגירה. הבקבוק ב- 37 מעלות צלזיוס חממה קונבנציונאלי עד התאים הם צמודי קרקע (5-8 דקות מספיקה עבור מרבית שורות תאים).</li>
	<li>להציג במיקרוסקופ אם התאים הם צמודי קרקע. ברגע התאים מנותקים, להוסיף 9 מ של התקשורת תרבות קבוע עם 10% FBS כדי להשבית את טריפסין 1 x.</li>
	<li>לספור את התא עם, או hemocytometer קולטר-מונה או דומה. הערה: Trypan blue יכול לשמש כדי להציג תאים מתים. עם זאת, טריפסין 1 x HaCaT תאים הם לגמרי בסיבוב כאשר בחיים.</li>
	<li>העברה 7.5 x 104 תאים/טוב בתקשורת FBS 10% µL 250 צלחת תרביות רקמה של 48-ובכן להטלטל עגול (צלחת רגילה). הערה: Assay גם ניתן להגדיר ב- 6-, 12-, 24- או צלחות 96-ובכן, אשר כולם יכולים להיות לבדיקה במיקרוסקופ אופטי.</li>
	<li>להניע בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להבטיח שהתאים מתפשטים באופן שווה בתוך הבארות, או התאים אנקה במרכז הבארות. לבדוק תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהתא מופצת באופן שווה בתקשורת</li>
	<li>לשים את הצלחת חממה2 CO קונבנציונאלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד התאים יש דבקה בתחתית הבארות.</li>
</ol>3. תוספת של גירויים לאפקטים ההעברה
<ol><li>בדוק אם הבארות הן 90-95% confluent תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>הכינו 10 µg/mL של מיטומיצין C בהכמות המתאימה של המדיום. הערה: במחקר זה, מיטומיצין C נשמרת ב 4 ° C בפתרון מניות ב 1 מ"ג/מ"ל. מיטומיצין C בתמיסה ניתן לאחסן שבוע בחושך ב 2-8 ° c</li>
	<li>הסר את המדיה בילה עם פיפטה פסטר מכל קידוח.</li>
	<li>להוסיף 250 µL של µg/mL 5 של מיטומיצין C בכל טוב.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל 2 h-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>הכן גירויים של פפטידים על ידי דילול אותם בסכום המתאים של המדיום. הערה: במחקר זה, נבדקו שור ואנושי לקטופרין והן Lactoferricin-µg/mL 25 בנפח של 250 µL</li>
	<li>הסר את המדיום עם מיטומיצין C עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>לשטוף את הבארות x 1 עם µL 250 1 x PBS (טמפרטורת החדר) ולהסיר לשטוף עם פסטר פיפטה.</li>
	<li>להוסיף µL 250 ל- 1 x PBS ותגרד באופן ידני את הבארות אנכית עם טיפ פיפטה µL 200. השתמש טיפ פיפטה חדש עבור כל טוב.</li>
	<li>להסיר את PBS ולהוסיף 250 µL פפטיד גירויים.</li>
	<li>לטעון את הצלחת במערכת אופטי מצלמה על-ידי התאמת את הברגים משני צידי הלוח. להשאיר את המכסה הצלחת microtiter. הערה: המצלמה יכולה לפעול עם מכסה פתוח במידת הצורך.</li>
</ol>4. להגדיר את התוכנית עבור המצלמה אופטי במחשב
<ol><li>לחץ על לחצן ייבוא בשורת המשימות בצד השמאל.</li>
	<li>בחר בפונקציה ריפוי פצעים בשורת המשימות בצד השמאל.</li>
	<li>בחר את סוג הלוח על ידי לחיצה מתחת לצלחת איור.</li>
	<li>ביטול בחירה של וולס, לא נעשה בו שימוש, על-ידי סימונן ולחץ לאפשר בצד השמאלי העליון על המסך. הערה: וולס כל נבחרות כברירת מחדל.</li>
	<li>התאם את המוקד של העדשה על הבארות כדי להתאים את המיקום של התאים על-ידי לחיצה ימנית על אחת הבארות. הערה: פוקוס אוטומטי יכול גם להיות מותאם באופן ידני על-ידי הזזת הסרגל בצד ימין של האיור צלחת.</li>
	<li>הגדר את תקופת הזמן לתמונות תחת התמונות מרווח (למשל (00: 30:00)).</li>
	<li>להגדיר את מספר החזרות שיתאימו תקופת הרצוי (למשל 97 חזרות).</li>
	<li>התחל ההפעלה על ידי לחיצה על לחצן ' התחל ' בפינה הימנית התחתונה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+the+Treatment+of+Chronic+Wounds.">Challenges in the Treatment of Chronic Wounds.</a> Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).</li><li>da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neuropeptides+in+skin+inflammation+and+its+involvement+in+diabetic+wound+healing.">Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.</a> Expert opinion on biological therapy. 10 (10), 1427-1439 (2010).</li><li>Vyas, K. S., Wong, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Biofilm+in+Wounds+as+an+Early+Indicator+for+Risk+for+Tissue+Infection+and+Wound+Chronicity.">Detection of Biofilm in Wounds as an Early Indicator for Risk for Tissue Infection and Wound Chronicity.</a> Annals of Plastic Surgery. 76 (1), 127-131 (2016).</li><li>Paul, C. D., Mistriotis, P., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+motility:+lessons+from+migration+in+confined+spaces.">Cancer cell motility: lessons from migration in confined spaces.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (2), 131-140 (2016).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis.">Angiogenesis.</a> Annual review of medicine. 57, 1-18 (2006).</li><li>Monsuur, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+differences+in+cell+mobility+during+skin+wound+healing+in+vitro.">Methods to study differences in cell mobility during skin wound healing in vitro.</a> Journal of Biomechanics. 49 (8), 1381-1387 (2016).</li><li>Tang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lactoferrin+stimulates+skin+keratinocyte+function+and+wound+re-epithelialization.">Human lactoferrin stimulates skin keratinocyte function and wound re-epithelialization.</a> The British journal of dermatology. 163 (1), 38-47 (2010).</li><li>Ashby, W. J., Zijlstra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Established+and+novel+methods+of+interrogating+two-dimensional+cell+migration.">Established and novel methods of interrogating two-dimensional cell migration.</a> Integrative Biology. 4 (11), 1338-1350 (2012).</li><li>Klettner, A., Tahmaz, N., Dithmer, M., Richert, E., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+aflibercept+on+primary+RPE+cells:+toxicity,+wound+healing,+uptake+and+phagocytosis.">Effects of aflibercept on primary RPE cells: toxicity, wound healing, uptake and phagocytosis.</a> British Journal of Ophthalmology. 98 (10), 1448-1452 (2014).</li><li>Doyle, W., Shide, E., Thapa, S., Chandrasekaran, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+energy+beverages+on+cultured+cells.">The effects of energy beverages on cultured cells.</a> Food and Chemical Toxicology. 50 (10), 3759-3768 (2012).</li><li>Zordan, M. D., Mill, C. P., Riese, D. J., Leary, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput,+interactive+imaging,+bright-field+wound+healing+assay.">A high throughput, interactive imaging, bright-field wound healing assay.</a> Cytometry Part A. 79 (3), 227-232 (2011).</li><li>Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+wound-healing+assay+for+cells+in+vitro.">Electrical wound-healing assay for cells in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (6), 1554-1559 (2004).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>R&#228;s&#228;nen, K., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta1+causes+epithelial-mesenchymal+transition+in+HaCaT+derivatives,+but+induces+expression+of+COX-2+and+migration+only+in+benign,+not+in+malignant+keratinocytes.">TGF-beta1 causes epithelial-mesenchymal transition in HaCaT derivatives, but induces expression of COX-2 and migration only in benign, not in malignant keratinocytes.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 97-104 (2010).</li><li>Tochio, T., Tanaka, H., Nakata, S., Hosoya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fructose-1,6-bisphosphate+aldolase+A+is+involved+in+HaCaT+cell+migration+by+inducing+lamellipodia+formation.">Fructose-1,6-bisphosphate aldolase A is involved in HaCaT cell migration by inducing lamellipodia formation.</a> Journal of Dermatological Science. 58 (2), 123-129 (2010).</li><li>Tomasz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C:+small,+fast+and+deadly+(but+very+selective).">Mitomycin C: small, fast and deadly (but very selective).</a> Chemistry and Biology. 2 (9), 575-579 (1995).</li><li>Stamm, A., Reimers, K., Strau&#223;, S., Vogt, P., Scheper, T., Pepelanova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+wound+healing+assays+-+state+of+the+art.">In vitro wound healing assays - state of the art.</a> BioNanoMaterials. 17 (1-2), 79-87 (2016).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+Cell+Migration+and+Invasion+Assays.">In vitro Cell Migration and Invasion Assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), 1-8 (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 8 (5), 440-451 (2016).</li><li>Hong, J., Kandasamy, K., Marimuthu, M., Choi, C. S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+cell-substrate+impedance+sensing+as+a+non-invasive+tool+for+cancer+cell+study.">Electrical cell-substrate impedance sensing as a non-invasive tool for cancer cell study.</a> The Analyst. 136 (2), 237-245 (2011).</li><li>Fredborg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+antimicrobial+susceptibility+testing.">Real-time optical antimicrobial susceptibility testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (7), 2047-2053 (2013).</li><li>Jenssen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti+herpes+simplex+virus+activity+of+lactoferrin/lactoferricin+-+An+example+of+antiviral+activity+of+antimicrobial+protein/peptide.">Anti herpes simplex virus activity of lactoferrin/lactoferricin - An example of antiviral activity of antimicrobial protein/peptide.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3002-3013 (2005).</li><li>Jenssen, H., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+properties+of+lactoferrin.">Antimicrobial properties of lactoferrin.</a> Biochimie. 91 (1), 19-29 (2009).</li><li>Delva, E., Tucker, D. K., Kowalczyk, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+desmosome.">The desmosome.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 1 (2), 1-17 (2009).</li><li>Ponti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+Distinct+Actin+Networks+Drive+the+Protrusion+of+Migrating+Cells.">Two Distinct Actin Networks Drive the Protrusion of Migrating Cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Canali, C., Spillum, E., Valvik, M., Agersnap, N., Olesen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whitepaper a Digital Time-Lapse Bright Field Technology To Drive Faster, Higher Throughput Bioanalysis. , (2016).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance.">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3203-3208 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

החשיבות של ההגירה במחקרים של פיתוח, ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וסרטן הוביל מספר שיטות שונות ללמוד ההעברה. ההעברה יכול להיות ביטוי של ההתרחבות או סגירת הפער על ידי התאים. לרוב הסגר על השריטה נבדק, כפי שהוא קל יותר לגדל תאים חד שכבתי ולאחר מכן לבצע שריטה יותר גוברת התאים לטופס מסוים8</...

ההעברה היא תהליך חשוב המשפיע מספר היבטים פיזיולוגיים. בריפוי הפצע, העברת מקל epithelization מחדש של העור. הפצעים ללא ריפוי, כגון לפצעים כרוניים, חיידקים הזדמנותית לגרום לזיהום הפצע, פצעים פתוחים הם אידיאליים עבור גידול חיידקים ועל היווצרות biofilm1,2. Biofilm הוא אחד הגורמים להתפתחות חיידקים עמידים, אשר הוא אחד האיומים הגדולים ביותר שלנו בחברה המודרנית3. בריפוי הפצע, תאים חיסוניים לא יכול לחדור את biofilm. ב סרטן, העברה של תאים סרטניים הוא צעד מכריע של גרורות, שהוא הגורם העיקרי למוות אצל חולים עם גידולים מוצקים4,5. לכן, זה הכרחי להיות מסוגל ללמוד ההעברה.
גירוד וזמינותו משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את נדידת תאים כי זה זול וקל לביצוע על שורות תאים חסיד, כגון פיברובלסט, אנדותל, ותא אפיתל קווים6,7. כיום, קיימות מספר שיטות לביצוע שריטות8, חומרים שונים דווח לשמש, לרבות קיסמים9, מגרדים תא10, לייזרים11זרמים חשמליים12. כל אחת מהשיטות יש והחסרונות השונים, השיטה צריכה להיות החליט על פי הכלי סוג תקציב, ניתוח התא. לדוגמה, אם סוג התא בשימוש דורש ציפוי, הסרת לחץ ידני, למשל עם טיפ קיסם או פיפטה, ישפיע הדבר על הגירה בתוך האזור, יש להשתמש בשיטה שונה. במחקר זה, אנו נתמקד גירוד ידנית.
חסרון עבור גירוד ידני הוא וריאציה של גודל, צורות של השריטות, הצטברות של תאים בקצוות של השריטה. קיימים פרוטוקולים רבים, ומייעץ מאמר מצוטט מאוד מהירות מוגברת ו/או שטיפה לאחר גירוד13. בנוסף, מספר שיטות השתמשו כדי לצמצם את התפשטות, כיוון התפשטות התאים ניתן להבחין בין הגירה ולכן עלולה להחזיר תוצאות חיוביות שגויות של הגירה. כמה דיווח שיטות הרעבה סרום שקדמו מאפס14 ולאחר הפחתת כמות הנסיוב15. עם זאת, אף אחת מהשיטות האלה תוכל להבטיח שיש אין התפשטות. לכן, אנחנו מדווחים על טיפול טרום התאים עם מיטומיצין C כדי להבטיח תוצאות אמת של הגירה. מיטומיצין C הוא אנטיביוטיקה כי מעכב סינתזת ה-DNA על ידי יצירת של קשר קוולנטי עם ה-DNA, ומונע את הדנ א של הפרדת16. על ידי טיפול מראש עם מיטומיצין C ושטיפת תסיים לפני גירוד, הסגר שזוהו על הפער מדגים את ההעברה נכון של התאים (איור 1).
מאפיין של כל השיטות הוא הצורך עבור מערכת לנתח את תהליך ההעברה17. נפוצה שיטה זולה כדי לנתח את ההתקדמות הוא להשתמש במיקרוסקופ אור-השדה לקחת תמונות של השריטה בנקודות זמן שנקבע מראש, ואחריו ניתוח של סגירת הפער התמונה תוכנה18,19. שיטה זו גוזלת זמן, אמין לגבי לצלם באותו מקום, מיקוד, התנועה מן החממה המצלמה כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה בזמן מצולמות התמונות. פותחו שיטות אחרות כדי לזהות ההעברה על ידי מדידת הזרם הנוכחי. השינויים הנוכחיים, כתאי לכסות יותר שטח על הצלחת, אשר קרא כמו עלייה עכבה20. על ידי מדידת התנגדות, הסביבה של התאים אינו מושפע, השיטה ולכן היא נחשבת לא פולשנית. שיטה זו מסתמכת על צלחות מיוחדות עם אלקטרודות זהב, אשר יקר, אבל הם מאפשרים זיהוי של תהליכים רבים, כגון הדבקות הסלולר, הפצה, העברה מוות של תאים. חיסרון גדול של שיטה זו הוא כי המדידה עכבה לא ישירות מצביעות על ההעברה, כמו גורמים כמו טמפרטורה יש השפעה רבה על עכבה. שינויים עכבה יכולה להיגרם על ידי מספר גורמים אשר לא נבדקות על ידי התוכנה, יותר מקשה על הניתוח של הנתונים. לפיכך, היעדר ויזואליזציה דורש מיקרוסקופ אור קונבנציונלי כדי לוודא העברה.
כדי להתגבר על רוב המגרעות של טכניקות זמינים, אנו משתמשים במצלמה אופטית אוטומטית בזמן אמת. המצלמה אופטי היא מערכת זיהוי עם מיקרוסקופ תפוקה גבוהה ב פלטפורמה קטן עם עדשה, יחידת תאורה של מצלמה דיגיטלית. יש תוכנה מובנית, אשר ניתן לבחון ההגירה והתפשטות בין היתר. כדי לזהות את ההעברה, שני אלגוריתמים משמשים כדי לנתח את הצמיחה וקינטיקה ההעברה של תאים, אשר נקראים ההתפשטות ו הפצע ריפוי ניתוח, בהתאמה. ניתוח התפשטות הוא מבוסס על אלגוריתם פילוח תמונה בשני שלבים שחל במרקם ניתוח כדי לזהות את ההבדל בין שטחים מכוסי תא (מוצג בצהוב) וריק רקע אזורים על-ידי ניתוח ההיסטוגרמה מתקדם. הפצע ריפוי ניתוח מבוססת על אלגוריתם שלושה שלבים מזהה את טפט תא, מאתרת את הפער הפצע, והוא קובע את רוחב המרווח. השלבים נערכים אצל המוגדרות על-ידי המשתמש בזמן נקודות, הנתונים מוצג באזור מקורה, רוחב המרווח ואזור הפער. אחד היתרונות הגדולים של מחשב זה הוא כי הוא מאפשר הדמיה של תאים חסיד דרך נוזלי בגלל זווית המצלמה21. תמונות lenstakes בעת הטיית המצלמה מוקרנים אל ערימה-z של z-מטוס בודד ליצור כדי להבטיח כי התמונות בפוקוס (איור 2). z-במחסן נוצרות על-ידי מיזוג הסדרה של תמונות (למשל 40) שצולמו בניצב לקצה הפצע, ועל -פני כל הפצע. Z-הערימות מאפשר לכידה של העומק של השכבה תא, כמו גם מטוס בפוקוס על פני הפצע. יתר על כן, הסדרה של תמונות שאפשר להרכיב על אוסף וידאו של התמונות, בלחיצה על כפתור.
נדגים פרוטוקול ממוטבת גילוי של ההעברה בקו תא תקין HaCaT. בדקנו לקטופרין, שלה N-מסוף פפטיד, Lactoferricin, בני האדם, פרות, כדי לנתח את השפעתם על הגירה כמו מולקולות אלה הוכחו יש יישומים רבים מיקרוביאלית ו החיסונית להתכוונן מולקולות22 , 23. תרכובות ארבע, לעומת תאים HaCaT אינו מטופל, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) שימש פקד חיובי.

<table><tbody><tr><td>oCelloScope</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>Optical camera</td></tr><tr><td>UniExplorer software&amp;nbsp;</td><td>BioSense Solution ApS</td><td></td><td>(8.0.0.7144 (RL3))</td></tr><tr><td>HaCaT cell</td><td></td><td></td><td>Donated from Bispebjerg Hospital</td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>Medium for HaCaT</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Fetal bovine serum</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>D837</td><td>Without Mg+ and Ca2+</td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Trypsin (10x)</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Tocris</td><td>3258</td><td>Inhibits proliferation</td></tr><tr><td>Microtiter plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>677 180</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Panasonic</td><td></td><td>37&amp;deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Assistent</td><td></td><td>T&amp;uuml;rk (0.1 mm)</td></tr><tr><td>Pipet boy</td><td>Accu-Jet pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimized scratch assay for in vitro testing of cell migration with an automated optical camera

נדידת תאים הוא תהליך חשוב זה משפיע על היבטים רבים של בריאות, כגון ריפוי הפצע סרטן, וזה, לפיכך, חיוני לפיתוח שיטות ללמוד את ההעברה. וזמינותו מאפס כבר זמן רב השיטה הנפוצה ביותר במבחנה לבדיקת תרכובות בעלות מאפיינים migration נגד פרו בגלל הליך שלו זולה ופשוטה. אולם, לבעיית וזמינותו מדווחים לעתים קרובות היא ההצטברות של תאי מעבר לקצה של השריטה. יתר על כן, כדי להשיג מידע וזמינותו, תמונות של חשיפות שונות חייב להילקח על פני תקופה של זמן, באותו מקום בדיוק כדי להשוות את התנועות של ההעברה. ניתן להשתמש בתוכניות ניתוח שונים כדי לתאר את הסגר מאפס, אך הם עבודה אינטנסיבית, אינו מדויק, ואת כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה. במחקר זה, נדגים שיטה ממוטב עבור בדיקת ההשפעה ההעברה, למשל עם החלבונים המתרחשים באופן טבעי האדם - ו שור-לקטופרין, שלהם פפטיד N-מסוף Lactoferricin על הקו תאים אפיתל HaCaT. אופטימיזציה מכריע היא לשטוף את לגרד ב- PBS, מה שמבטל את הצטברות תאים לאורך הקצה הנ. זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההסרה של קטיונים, אשר הוכחו יש השפעה על חיבור תאים תאים תקין. כדי להבטיח זיהוי נכון של הגירה, בטיפול מראש עם מיטומיצין C, מעכב סינתזת ה-DNA, נוספה לפרוטוקול. לבסוף, נדגים אוטומטיות אופטי למצלמה, מה שמבטל מחזורי בטמפרטורה הקיצונית, כפיים עם ניתוח סגירת מאפס, תוך שהיא משפרת על הפארמצבטית להבטיח ניתוח קטעים זהים של השריטה לאורך זמן.

HaCaT הוא קו תא תקין, אחד הסוגים התא הנפוץ ביותר של העור. כאשר פצע, תאי העור מתחיל להתרבות ולהעביר מעל למיטה הפצע כדי לסגור את הפצע (איור 3). שני התהליכים הם, לכן, חשיבות עליונה עבור ריפוי תקין.
המצלמה אופטי יכול לעקוב אחר שני תהל...

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera at JoVE.com

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for ...

optimized-scratch-assay-for-vitro-testing-cell-migration-with-an

Research

JoVE Journal

Biology

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

22.9K Views.  Roskilde University. כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.

Video: Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Developmental Biology

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

Environment

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

Medicine

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

הבהרת קינטיקה של תאי T: שיטות לניתוח נדידה בזמן אמת

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

מחבר זרקור: הבנת מנגנוני מחלה באמצעות ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

במבחנה לגרד Assay כדי להדגים את השפעת הרעל על נדידת תאים בעור

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

שיטת העברת שריטות וחדר מתקפל לחלל מתורבת בניתוח Vivo של ריפוי פצעים

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8