מימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIH: K01-DK087814-01A1 כדי D.L.S.), התוכנית אוניברסיטת מדינת קליפורניה עבור חינוך ומחקר בתחום הביוטכנולוגיה (CSUPERB: בקרה מולקולרית של הגומחה Hematopoietic חוליות כדי D.L.S.) מ במשרד לתארים צ'יקו באוניברסיטה של מדינת קליפורניה (ל A.C.B.).

טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) חבר הוועדה המייעצת באוניברסיטת קליפורניה, צ'יקו, אישר כל השיטות המתוארות להלן.
1. מלבין 48 hpf דג זברה עוברי
<ol><li>עם 15 ס מ x 15 (w) ס"מ (l) x 7 ס מ (h) מיכלי פלסטיק ליצור תחנות שטיפת 3: 1) עם 1 מ"ל של 5% אקונומיקה במדיום העובר 1000 מ"ל (E3; ראה טבלה 1), 2) עם E3 סטרילי, ועם 3) E3 סטרילי. להבטיח לכל מכולה מכילה 500 מ של פתרון ומטביעים את העוברים ב. הערה: עבור כל תנאי נבדק, לפחות 10 עוברי יהיה צורך. הליך זה כביסה יכול להכיל עד 200 עוברי.</li>
	<li>עם פיפטה העברה, להכניס העוברים בתוך מסננת תה ויציפו ביצים בתחנת רחיצת #1 עבור 5 דק. להסיר את מסננת תה (עם העוברים בתוך) ומניחים לתוך תחנת רחיצת #2 עבור 5 דקות; חזור על תחנת רחיצת #3 עבור דקה 5 הסופי.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה העוברים שטיפה של תה מסננת על ידי מסובבים אותו הפוך נקי 10 ס"מ פטרי ושטיפה בעדינות עוברי הנחה את מסננת תה עם E3 סטרילי, פיפטה של העברה.</li>
</ol>2. Dechorionate עוברי
<ol><li>עם פיפטה העברה, להסיר, למחוק כמה שיותר E3 ככל האפשר מתוך הפטרי ולהוסיף 500 μL של dechorionation פרוטאז (10 mg/mL) העוברים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק טפח בעדינות את הצד של הפטרי כדי להסיר לחלוטין את chorions.</li>
	<li>פיפטה סרולוגית, להוסיף 20 מ של E3 סטרילי כדי לדלל פרוטאז. לאפשר עוברי להתיישב, ולהסיר E3 עם פיפטה העברה. חזור על שלב זה שטיפת 3 פעמים כדי להסיר כל עקבות הפרוטאז dechorionation.</li>
</ol>3. הכנת דוגמאות העובר
<ol><li>באמצעות פיפטה P1000, מניחים 10 עוברי לתוך צינור microcentrifuge יחיד mL 1.5 סטרילי.</li>
	<li>הסרת E3 עם פיפטה וזורקים. התראה: פיפטה בזהירות ככל עוברי יכול בקלות להיות שנעקרו מבתיהם במהלך שטיפת בשלבים הבאים.</li>
</ol>4. הכנת העוברים דיסוציאציה
<ol><li>העברת דגימות למינארי, ולשטוף העוברים על-ידי הוספת 1 מ"ל E3 סטרילי. לאפשר עוברי ליישב לחלק התחתון של צינור ולהסיר תגובת שיקוע עם פיפטה P1000. חזור על סך של 3 מנקי.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה להסיר E3 וזורקים. להוסיף 1 מ"ל של 10 מ מ dithiothreitol (DTT) ב- E3 להסיר את הציפוי ריר (וכל נבגים, שמרים, או חיידקים, כי אמנם כלואה בתוכו) המקיפים את דג זברה עובריים. פרופיל microcentrifuge צינור אופקי, דגירה בטמפרטורת החדר למינארי במשך 25 דקות.</li>
</ol>5. עובר דיסוציאציה
<ol><li>רחץ מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של DPBS סטרילי (עם Ca2 + ו Mg2 +). לאחר השטיפה האחרונה להוסיף 500 μL של DPBS (עם Ca2 + ו Mg2 +) ולהוסיף 5 μL של 5 מ"ג/מ"ל (26 U/mL) דיסוציאציה פרוטאז. התראה: אנזים זה זקוק Ca2 + ו- Mg2 +, אז ודא כי DPBS מכיל יונים אלה.</li>
	<li>דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על אופקי מטרף מסלולית-180 סל ד עבור 60 דקות דגימות מקום בשכונה זרימה שכבתית, triturate עוברי עם P1000 עד מלא חלופה מועדפת דגימות. התראה: בדוק עוברי מעת לעת כדי לקבוע מתי הם הופכים חלופה מועדפת. הפתרון העובר צריך כמות מסוימת של רקמת הנוכחי; זה לא צריך להיות הומוגני לגמרי. זה אפשרי תקציר יתר, אשר תהרוס את HSPCs (ראה איור 1 משלימה).</li>
</ol>6. הכנת העוברים חלופה מועדפת
<ol><li>פיפטה 10 הפומבית העוברים אל המאגר העליון פוליסטירן מ ל סיבוב התחתית התחתונה עם כובע מסננת תא 35 μm.</li>
	<li>עם פיפטה, יש לשטוף הצינור פטרי עם PBS סטרילי (עם Ca2 + או Mg2 +), פתרון העברת מ ל פוליסטירן שפופרת המכילה מסונן תאים מהשלב 6.1. חזור עד 4 מ של נוזל נמצא בצינור פוליסטירן מ. הערה: PBS, DPBS או פתרונות אחרים במאגר מול עשוי לשמש בשלב זה, כל עוד הם אינם מכילים Ca2 + או מ ג2 +
</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות-4 ° C ו- g x 300 במשך 5 דקות כדי הצניפה המדגם תא הומוגני. עם פיפטה, להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ברכבת התחתית התחתונה עגול. לטפל כדי לא לשבש את התאים מגורען בתחתית הצינורית. Resuspend תאי μL 100 ל- PBS.</li>
</ol>7. הכנת Methylcellulose
<ol><li>צור 1 x פתרון מלאי מלאה methylcellulose (טבלה 1) ולהוסיף 2.5 מ ל צינורות סטרילי סיבוב המדרגה 14 מ עם 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם. להשתמש שפופרת אחת עבור כל תנאי נבדק.</li>
	<li>
הוסף ציטוקינים, מולקולות קטנות או סוכנים אחרים כדי לחקור כדי כל דגימה.
	<ol>
<li>התמיינות תאים מיאלואידים, הוסיפו 1% קרפיון סרום ו- 0.3 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי גרנולוציט המושבה מגרה פקטור (Gcsf)34 methylcellulose לבינוני. ראה Svoboda. et al. 37 עבור תיאור מלא על איך ליצור ציטוקינים סרום ו רקומביננטי קרפיון.</li>
		<li>עבור בידול erythroid, להוסיף 1% קרפיון סרום ו- 0.1 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי אריתרופויאטין (Epo)38 methylcellulose בינונית.</li>
		<li>לבחון אבות multilineage, מוסיפים Epo Gcsf. התראה: ציטוקינים ותוספים צריך לא סה כ יותר מ-10% מהנפח הכולל, כפי המדיום לא יהיה מספיק צמיגה להבחין מושבות בודדות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. תוספת של חלופה מועדפת העוברים אל Methylcellulose
<ol><li>בעזרת פיפטה של, להוסיף 100 μL של העוברים 10 dissociated אל פני השטח של methylcellulose מוכן עם סרום ציטוקינים, קרפיון רקומביננטי. כובע המכסה, מערבולת בעדינות כדי homogenize באופן מלא דוגמאות. כל שפופרת עכשיו להכיל הרקמה dissociated של 10 עוברי.</li>
	<li>באמצעות 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם, aliquot 1 מ"ל מדגם פטרי נפרד 35 מ מ 2. ודא כי המדגם באופן מלא מפוזרים על צלחת פטרי. חזור על כל דגימה.</li>
	<li>מקום 35 מ מ צלחות פטרי עם תאים methylcellulose לתוך 15 ס מ פטרי. על כל מנה 15 ס מ, להוסיף אחד צלחת פטרי 35 מ מ עם 5 מ ל מים סטריליים כדי ללחלוח הדגימות. תקופת דגירה-32 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 של 7-10 ימים.</li>
</ol>9. ויזואליזציה של המושבה, נגזר HSPC ויוצרים יחידות (CFUs)
<ol><li>לאחר המקננת 7 ימים, במקום דוגמאות על גבי מיקרוסקופ הפוכה בגיל 40-100 X עבור ויזואליזציה וספירה. בשלב זה, מושבות בודדות יכול להיות מבודדת עם פיפטה ונחשפו ניתוח מכתים ו/או הגן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition.">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li><li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41++cmyb++precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis.">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo.">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li><li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+characterization+of+zebrafish+hematopoietic+stem+cells.">The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells.</a> Blood. 118, 289-297 (2011).</li><li>Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Runx1+expression+in+the+dorsal+aorta+tracks+the+emergence+of+blood+progenitors+from+endothelial+cells.">Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells.</a> Blood. 116, 909-914 (2010).</li><li>Lam, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+runx1+promoter-EGFP+transgenics+mark+discrete+sites+of+definitive+blood+progenitors.">Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors.</a> Blood. 113, 1241-1249 (2009).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. 123, 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype.">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1, 661-673 (1994).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Gansner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+zebrafish+thrombocyte+lineage+cells+with+a+Cd41+monoclonal+antibody+enriches+hematopoietic+stem+cell+activity.">Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity.</a> Blood. 129, 1394-1397 (2017).</li><li>Smith, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).</li><li>de Jong, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune-matched+hematopoietic+transplantation+in+zebrafish.">Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish.</a> Blood. 117, 4234-4242 (2011).</li><li>Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Caudal+Haematopoietic+Embryonic+Stromal+Tissue+(CHEST)+Cells+Support+Haematopoiesis.">Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis.</a> Sci Rep. 7, 44644 (2017).</li><li>Campbell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryonic+stromal+trunk+(ZEST)+cells+support+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+(HSPC)+proliferation,+survival,+and+differentiation.">Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation.</a> Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+vertebrate+hematopoiesis+using+zebrafish+thrombopoietin.">Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin.</a> Blood. 124, 220-228 (2014).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+granulocyte+colony-stimulating+factors+(Gcsfs):+2+paralogous+cytokines+and+their+roles+in+hematopoietic+development+and+maintenance.">The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance.</a> Blood. 122, 3918-3928 (2013).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118, 1274-1282 (2011).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis.">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li><li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development.">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מערכת דגם דג זברה הפך מודל יעיל, יעילה וזולה עבור הלומדים hematopoiesis חוליות פרימיטיביים ומוחלטת. דור של מבחני מהיר, זול, והוא מציג כמה בעיות טכניות יכול להיות מנוצל עבור בדיקות מולקולות קטנות, ניתוח מוטציה עוברי שחקרתי חשוב HSPC ביולוגיה מולקולרית מסלולים. במבחנה ציפוי של HSPCs של דג זברה בוג?...

Hematopoiesis היא התהליך של ביצוע ריבוי של תאי דם בוגר נדרש להישרדות של אורגניזם. זה תהליך התפתחותי מפתח המערבת את הבידול של תאי גזע hematopoietic (HSCs) במגוון רחב של סוגי תאים מוגבלת מבחינת המרכיבים דם בוגרים. אלה HSCs עצמית לחדש, כך המערכת לעולם אינו הם חייבים להתמיד של התפתחות עוברית מוקדמת עד מותו. גולגולת, בידול קבוע והתפשטות של תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) יש צורך לחדש בצורה הולמת את רוב תאי דם הם שלאחר mitotic להיות ממוחזרים בכל יום. HSCs יצירת תאי דם בוגרים על-ידי המבדילים הראשון לערכות משנה של ובתאים מוגבלת; נפוץ אבות הלימפה (CLPs)1, אשר בסופו של דבר לייצר תאי T, B, ו- NK, ונפוץ מיאלואידית אבות (CMPs)2 היוצרים גרנולוציטים, אריתרוציטים, מקרופאגים, megakaryocytes. אבות אלה מחויבים יצירת שושלות תאים מסוים, להבדיל עוד יותר לתוך יותר ובתאים מוגבלת מבחינת כגון erythroid מיאלואידית אבות (פיגל) היוצרים אריתרוציטים, טסיות דם, או גרנולוציט אבות מקרופאג (Gmp) היוצרים בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים ומקרופגים2. זיהוי ובידוד אבות אלה מאפשר זיהוי מסלולים מולקולריים חשוב מעורב בידול hematopoietic, מחלות hematopoietic רבות כגון לוקמיה מתעוררות כאשר אלה ובתאים להיכשל כראוי להבדיל.
במהלך העשורים האחרונים, מערכת מודל דג זברה (רזבורה rerio) הפך כלי מחקר מפתח עבור מחקרים hematopoietic עובריים למבוגרים. דג זברה נתונות ניתוח גנטי והם מינים דגם חוליות phylogenetically הנמוך ביותר שיש להערכת דומים ומערכת hematopoietic לבני אדם. דג זברה עוברי לפתח לשעבר עם רחם, וצור בתוך 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. דג זברה גם הם הפוריה ביותר, עם הנקבות שוכב מעל 100 ביצים מצמד בודד, מתן אפשרות עבור מדגמים גדולים ושכפול ניסיוני. דג זברה העוברים הם שטיחות שקוף, המאפשר ויזואליזציה מיקרוסקופיים של מערכת hematopoietic. מספר שורות הטרנסגניים פלורסנט דג זברה סימון HSCs כגון runx1: EGFP דגים9, cd41: EGFP דגים10, ו- kdrl:mCherry; cmyb: בעלי חיים GFP3 כפול-חיובית, לאפשר להמחשת בשידור חי, בזמן אמת של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה והתרחבות ויוו3,4,7,8, 9. של דג זברה דור מהיר זמן ופיתוח לשעבר עם רחם הוביל השימוש בו מוטגנזה מכוונת מחקרים11,12,13,14,15 וסמים הקרנת16,17,18,19,20 שאמורות להחזיק ההבטחה טיפולית בהפרעות דם אנושי. בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, הנוכחות ואת פיתוח קלה של קווים מהונדס, וזמן התחדשות מהירה הפך דג זברה מודל זול, מהיר, גמיש, אידיאלי עבור מחקרים hematopoietic.
פותחו שיטות רבות של בידוד ובדיקה HSCs בתרבית של מערכות hematopoietic. חוקרים יכולים לנצל שילוב של קולטני התא השטח כדי לסמן HSCs21,22,23,24, כמו גם לנצל את היכולת של HSCs בזרימת לצבוע25,26. אחרי, הם מסומנים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) מאפשר הפרדה פיזית שלהם. להוכיח כי תא HSC מחייב בין חיה המארח כדי להרוס את HSPCs אנדוגני, משתילים בשם HSCs, והתבוננות ארוכת טווח, שושלת היוחסין מרובה שיחזור של כל בוגר סוגי תאים בדם. מבחני אלה פועלות היטב עכברים, שכן ישנם רבים תא-פני נוגדנים נגד תאים hematopoietic וללחצים העכבר המפגרים המאפשרים התאמת המערכת החיסונית עבור השתלת. עם זאת, כמה דג זברה hematopoietic תא-פני נוגדנים כבר שנוצר27, הפרעה של זיהוי ובידוד של HSCs. הדרך הנפוצה ביותר כדי לסמן ולבודד דג זברה HSCs היא עם בעלי חיים מהונדס, לפיה רצף ספציפי תא יזם נוהג הביטוי של החלבון הניאון. מחקרים דמיינו, לספור HSCs בקיר הגחון של אבי העורקים הגבי עם מיקרוסקופ ניצול זו טכניקת3,4,8,9. מעבדות אחרות יצרו זנים המשובטים של דג זברה28,29 , אמורה לבצע השתלה מוצלחת ב- MHC-מתאימים לבעלי חיים30. עם זאת, שיטות אלה העלות אוסרני מעבדות רבות, מבחינה טכנית קשה, הם לארוך זמן רב. כדי לטפל בבעיות אלה, מעבדות יצרו מספר במבחנה מבחני לבדיקת הנוכחות, שיעור התפשטות, והיכולת בידול של HSPCs31,32,33, 35, 34,36. מבחני אלה להראות התפשטות ובידול של HSPCs במבחנה31,32,33,34,35,36, חילוץ פגמים hematopoietic36, שיטה יעילה לגילוי ולבדיקה ציטוקינים33,34,35. הם כבר נעזרו גם לזהות את הגנים אחראית HSPC-ביולוגיה-31,-32. במחקר זה, ניקח את אלה מבחני צעד נוסף, המאפשר כימות של HSPCs של העובר מתפתח דג זברה. מבחני אלה גם יכול להיות מנוצל כדי quantitate את המספר של HSPCs חיות, בעלי חיים שמטופלים בתרופות hematopoietic משובש. בעיקרו של דבר, אלה מבחני מהר, נוכח האתגרים הטכניים אחדים הינם דרכים זולות quantitate מספרי HSPC, לבדוק את ההפצה שלהם, ולחקור בלוקים בידול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:741px;" width="741">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#39;s MDM</td>
			<td style="width:115px;">StemCell Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">9300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14080-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HyClone PBS (1x)</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">sh30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;DMEM 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">&#160;Ham&#39;s F12 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Corning CellGrow</td>
			<td style="width:119px;">10-080-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">FBS 500 mL</td>
			<td style="width:115px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">HEPES 100 mL (1 M)</td>
			<td style="width:115px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Penicillin/streptomycin (5000 U/mL 
			and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-009-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td>
			<td style="width:115px;">Corning Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-005-CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">1.5 mL MCF tube</td>
			<td style="width:115px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td>
			<td style="width:115px;">BD Safety Glide</td>
			<td style="width:119px;">305905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Methocel MC</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">14 mL Polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Librease TM</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>dissociation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">Pronase</td>
			<td style="width:115px;">Roche Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11459643001</td>
			<td>dechorionation protease</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:341px;">15 cm Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">Corning Falcon</td>
			<td style="width:119px;">351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:341px;">AB</td>
			<td style="width:115px;">Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td>
			<td style="width:119px;">ZL1</td>
			<td>zebrafish strain used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:341px;">Dithiolthreitol (DTT)</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

Hematopoiesis הוא תהליך הסלולר חיוני שבו תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) להבדיל לתוך ריבוי של שושלות תאים שונים המרכיבים את דם בוגרים. בידוד וזיהוי של אלה HSPCs היא קשה כי הם מוגדרים לשעבר פוסט פקטו; הם רק יכולה להיות מוגדרת לאחר בידול שלהם לתוך שושלות תאים מסוים. במהלך העשורים האחרונים, הפך דג זברה (רזבורה rerio) אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. דג זברה עוברי להתפתח לשעבר עם רחם, וכי על ידי 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) יצרו סופית HSPCs. מבחני להעריך בידול HSPC, פותחו יכולות הפצה, ניצול השתלת ובעקבות שיחזור של מערכת hematopoietic בנוסף להמחיש קווים הטרנסגניים מיוחדים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, מבחני אלה הם העלות אוסרני טכנית וקשה, זמן רב עבור מעבדות רבות. פיתוח מודל במבחנה כדי להעריך HSPCs יהיה העלות האפקטיבית, מהיר, ותיאר נוכח קשיים פחות בהשוואה בעבר שיטות, ומאפשר מעבדות להעריך במהירות מסכי התרופות, מוטגנזה מכוונת להשפיע על ביולוגיה HSPC. זה רומן במבחנה הנועד להעריך HSPCs מתבצע על ידי ציפוי הפומבית דג זברה כל העוברים, הוספת גורמים אקסוגניים לקדם רק HSPC בידול והתפשטות. עוברי הפומבית לתוך תאים בודדים, מצופה HSPC-תומכת גורם ממריץ שגורמים להם לייצר המושבה ויוצרים יחידות (CFUs) הנובעות תאים ובתאים יחיד. מבחני האלה צריך לאפשר בחינה זהירה יותר של מסלולים מולקולריים האחראי על התפשטות HSPC, בידול, התקנה, אשר יאפשר לחוקרים להבין את. הפסיכולוגי של חוליות hematopoiesis ואת dysregulation שלה במהלך המחלה.

כדי להעריך את המספרים HSPC דג זברה עובריים, 48 hpf העוברים היו מתעכל, מצופה ב- methylcellulose עם גורמי גדילה hematopoietic תומכת אקסוגני, מודגרות במשך 7 ימים (איור 1א'). לאחר 7 ימים, יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) היו ספורים (איור 1B), תמונה (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

7.9K Views.  California State University, Chico. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.

Video: Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.

ניתוח מטבוליזם התא של גזע המטפאות

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...