עבודה זו נתמכה על ידי מענק SC INBRE מ הלאומית המכון כללי רפואי למדע - NIH (P20GM103499 כדי R.G.), מעניקה CA555536 & CA154664 מן המכון הלאומי לסרטן P.H.H. תוכנית זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מכללת צ'רלסטון הווארד יוז מכון רפואי דרך ה מכללה קדם & לתואר ראשון במדעי החינוך תוכנית על ידי מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (5 P20 RR016461) הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (8 P20 GM103499) מ המכונים הלאומיים לבריאות.

1. תרבות, תיוג מטבולית
<ol><li>לתקוע פעם למרכז הכיפה של צינורות מיקרו-צנטריפוגה mL 1.5 סטרילי עם מחט אל תדאגי כדי לאפשר אוורור נאות. לחסן µL 500 של שהושלם סטרילי 7 שעות 9 מרק עם 5 µL של smegmatis מ מ starter תרבות מבוגר לילה12. הערה: את המתכון ליטר אחד של 7 שעות 9 הוא ציר: 4.7 g מסחרי H 7 9. אבקה, 2 מ ל גליצרול, 1 מ"ל Tween 80, g 0.85 NaCl, 5 g אלבומין, 2 גרם דקסטרוז, H2O (להביא את הנפח הכולל עד 1 ליטר).<ol>
<li>
(זהירות) בעקבות שיטות המכון להגנת סטנדרטי, ספייק התקשורת תרבות עם µCi/mL 20 [32P] נה2HPO4. לגדול חיידקים על העצבנות 37 ° C ו- 1,200 סל ד, ב חממה שאכר מאחורי מגן אקרילי בעובי 9 מ מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בשלב midlog (O.D.600 ננומטר ~ 0.5), להעביר את תרבות שלמה לתוך צינור 2-mL בורג-קאפ ואת הצניפה חיידקים רדיואקטיבי בטמפרטורת החדר על ידי צריך שתוציאו במשך 2 דקות ב- 10,000 x ג לאסוף supernatant האורטו רדיואקטיבי המכיל טריטוריה ב פח אשפה המתאים.</li>
</ol>2. הכנת RNAs סה
הערה: RNAs הכולל המחולצים כדורי חיידקי באמצעות ריאגנט החילוץ RNA מסחרי (מכיל guanidinium thiocyanate, פנול, כלורופורם) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
<ol><li>להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט החילוץ RNA מסחרי ו כ-200 µL של חרוזי זכוכית על גבי בגדר. קאפ הצינור בצורה מאובטחת, לשבש את בקטריאלי ב מהמגן למשך 2 דקות תחת עצבנות המרבי, (קביעת מספר חמש על המכשיר שבחרת (ראה את הטבלה של חומרים)).</li>
	<li>צנטריפוגה מדגם ב g x 12,000 10 דקות ב 4 º C. להעביר את תגובת שיקוע צינור 2-mL וזורקים את החרוזים כראוי. להוסיף 0.2 מ של כלורופורם, לנער צינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס' 15 ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>לאסוף את פאזה מימית של המדגם לתוך צינור חדש על ידי לדוג את הצינור ב- 45 מעלות. להימנע מהדפסת לאטמוספרה או שכבה אורגני. להוסיף 2 µL של precipitant בצבע ו- 0.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל 100%. לנער את הצינור נמרצות על ידי יד צנטריפוגה ס' 5 ב 12,000 x g 10 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע מהצינור ולמחוק כראוי כפי השבר נוזלי עשוי להכיל עקבות של קרינה רדיואקטיבית. אוויר יבש גלולה עבור 5 דקות ואז resuspend ב 200 µL של 2 X תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס), 0.1% (w/v) dodecyl סולפט נתרן (מרחביות) הסופי. הערה: ההרכב של המניה 20 X האס הוא 3.0 M NaCl, 0.3 M סודיום ציטרט, pH 7.0.</li>
</ol>3. הכנת לוחות מדפסת טוב 96
הערה: מיקרו-מערכים tRNA מודפסים באופן ידני עם ארבעים ושניים 70-מר דנ א משלים 3' בסוף כל tRNA smegmatis מ' (מסוף המרכז לאמנות עכשווית נכלל) באמצעות arrayer 8 פינים של oligonucleotides. מסדרות את הגששים oligonucleotide דנ א, כמו גם את הפריסה החוקרת את הצלחת-. ובכן, את המערך מסופקים (1 קובץ משלים - גיליון 1 עד 3 בהתאמה).
<ol><li>עיצוב ה-DNA רגשים הראשון רצפים tRNA איחזור או גנים קידוד tRNA ממסדי tRNA כגון tRNA גנומית מסד הנתונים13. לקצץ שנשמרת 3' סוף המרכז לאמנות עכשווית, אם מקודד. הפוך משלים הרצף שנוצר. . בדיקת סדר בהתבסס על נוקלאוטידים תחילה 70</li>
	<li>Resuspend יבש DNA הגששים במים. להתאים את הגששים ריכוז 100 מיקרומטר. ב- 96 טוב-צלחת, להכין µL 120 של 50 מיקרומטר oligos ב 3 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות הסופי (שתדללו 60 µL של הגששים מניות בודדות היטב עם 60 µL של 6 X האס, 0.01% (w/v) מרחביות.</li>
	<li>מכסים בצלחת בנייר כסף כדי למנוע אידוי או זיהום, להקפיא מיידית ולשמור ב-20 ° C עד שהוא נדרש.</li>
</ol>4. מערך ההדפסה
<ol><li>להפשיר את הצלחת 96-ובכן בטמפרטורת החדר (לוקח בערך 20 דקות).</li>
	<li>תווית שקופיות זכוכית מצופים אמין עם עט יהלום. במקום מגלשות לתוך יחידה יצירת אינדקס. בצע את מיקומי רשת, לעשות כדלקמן.<ol>
<li>בזהירות טובלים הפינים משכפל הבארות.</li>
		<li>הדפס בעדינות את המערך בשקופיות זכוכית, באמצעות לחץ מינימלי (אתם תרגישו התנגדות קטנה). להמשיך בהדפסה ללא ניקוי את arrayer עד גמר עם בלוק א</li>
	</ol>
</li>
	<li>כשתהיה מוכן להמשיך הלאה הבלוק הבא, בצע את ההליך כביסה המתוארים להלן.<ol>
<li>טובלים משכפל לבן 5% ומנערים בעדינות.</li>
		<li>לחץ משכפל לנייר סופג.</li>
		<li>טובלים משכפל במים מזוקקים, לנער בעדינות, והקש לתוך נייר. חזור על שלב זה פעם אחת.</li>
		<li>טובלים משכפל ב אלכוהול איזופרופיל, לנער בעדינות, והקש לתוך העיתון.</li>
		<li>יבש המשכפלים על המאוורר עבור 20 s לפני שהמשכנו הבלוק הבא של צלחת 96-ובכן. להמשיך מספר הדפסים הרצוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאפשר את השקופיות להתייבש ואז crosslink oligos אל השקופית באמצעות crosslinker UV של 254 ננומטר.<ol>
<li>הגדר את רמת האנרגיה µJ/cm 999,9902.</li>
		<li>לשים את הפנים שקופיות על משטח נקי ב crosslinker. לחץ על "התחל".</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחסום את מערכי לילה ב 450 מ של חסימת פתרון על פגים, בטמפרטורת החדר ותחת עצבנות איטי. לאסוף ולהשתמש פתרון חסימה עד פי ארבעה. הערה: המתכון עבור הפתרון החסימה היא: 125 מ מ פוספט מאגר (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25% מרחביות (w/v), 0.5 מ מ EDTA, האס X 0.5, 1% BSA (w/v).</li>
	<li>לשטוף את השקופיות פי 2 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר 500 מ ל מים מזוקקים. יבש את השקופיות על-ידי צריך שתוציאו בשביל 10 s בטמפרטורת החדר ומפרידה microarray. מאגר מערכי במקום חשוך ויבש עד 6 חודשים.</li>
</ol>5. מערך הכלאה
<ol><li>לפני הכלאה השקופיות במים רותחים, שוטפים ומייבשים על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6).</li>
	<li>במקום מערך בתוך קלטת הכלאה וטען radiolabeled מדגם ה-RNA.</li>
	<li>להפעיל תחנת הכלאה-כביסה אוטומטיים הפארמצבטית המרבי.<ol>
<li>תוכנית השלבים להלן. אטמים תנאי למשך 2 דקות ב 75 º C. להציג את המכשיר ב 60 מעלות צלזיוס. Denature הגששים ודוגמאות 5 דקות ב- 90 ° C. Hybridize דוגמאות עבור h 3 ב 60 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>לשטוף שקופיות ב 50 מעלות צלזיוס פעמיים עם 2 X האס, 0.1% (w/v) מרחביות, זרימה 10 s והחזק 20 ס' שטיפת שקופיות ב 42 ° C פעמיים עם 0.1 X SSC, 0.1% מרחביות, זרימה 10 s והחזק שקופיות שטיפת ס' 20-42 ° C פעמיים עם 0.1 X האס , זרימה 10 s ו- s להחזיק 20.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יבש שקופיות על ידי צנטריפוגה (כמו 4.6).</li>
</ol>6. מערך כמת
<ol><li>גלישת טקסט שקופיות באמצעות סרט פלסטיק דק. בדוק שקופיות לאות רדיואקטיבי בעזרת מונה גייגר על ההגדרה הרגישים ביותר שלה. חושפים את השקופיות על מסך פוספור אחסון במגרה חשיפה בטמפרטורת החדר במשך 10-90 h בהתאם עוצמת האות. הערה: כפי הרגישות של מוני גייגר משתנים בין מכשיר אחד למשנהו, פעמים חשיפה חייב להיות מותאם מדעית.</li>
	<li>סריקת שקופיות ברזולוציה 50 מיקרומטר, באמצעות phosphorimager. לכמת ולחסר רקע-עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה באמצעות תוכנה J תמונה חופשית משודרג עם פרופיילר microarray.</li>
	<li>לארגן, לעבד נתונים באמצעות גיליון אלקטרוני אלקטרונית. צור מפות חום באמצעות כלי עיצוב מותנה. מייצגים לדוגמה כל אות בדיקה כשבר (המתבטא וניתן) של האות הכולל בדיקה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

אין ניגוד אינטרסים הכריז.

פליטת חלקיקי ביתא ידועים סוכנים אחרים bacteriostatic14, אולם קרינה בטווח שנבדקו יש השפעה משמעותית על כושר התא. נצנוץ ספירת הראה כי הרדיואקטיביות הוא שולב 25% סה כ- cell תמציות ובהמשך, 1% של RNAs הכולל מטוהרים.
את הגששים בגדלים זהים, טמפרטורת ההיתוך דומה ותוכן GC, יחד עם פרוטוקול אחיד לאיתור macroarray, הכלאה, כימות מאפשר למדידת רמות tRNA ישירות מן האותות ספוט לא משוחדת.
המקום הספציפי הדירים. שלה טווח גדול ודינמי, סף מתכוונן בקלות מאפשר יצירת פרופיל נמוך שופע מינים, כגון tRNAs הקשורים polysomes, פשוט על-ידי הארכת מערך החשיפה פעמים9. לאחר ההשקעה הראשונית עבור הציוד הנדרש, הפעלה עלות לדוגמה, כולל מתכלים, הממוצע של 15 דולר לכל דגימות.
ספוט חל כל אורגניזם הגנום של מי זמין עבור עיצוב המכשיר. אורגניזמים דוגמנית מגודלים במבחנה הם מועמדים אידיאליים עבור תיוג מטבולית. כמו הגנום יונקים לעתים קרובות לקודד רבים isodecoders (tRNAs לשתף anticodons זהה, אך הצגת הבדלים קטנים ברצפים הגוף שלהם) הגששים צריך להיות חלקית מנוונת לשמר הומוגנית הכלאה של מינים קרובים tRNA. לבסוף, תאים בתרבית של חסיד תשואה נמוכה יותר בדרך כלל כמויות של RNA הכולל לעומת אורגניזמים גדל ההשעיה כגון smegmatis מ', כך תרבויות צריך להיות קנה המידה באופן משמעותי.

רמות tRNA הסלולר משתנים בהתאם לתנאים כגון סוג התא, הסביבה מתח1,2,3. ספוט, פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA, הוא המקורי, אמין, טכניקה פשוטה המאפשר כימות מהיר ומדויק של העברת RNA רמות אורגניזמים שגודלו במעבדה.
tRNAs יש מבנים משניות ושלישוניות יציב4. הם גם מציגים שינויים post-transcriptional מספר5. תכונות אלה מייצגים מבני משמעותי והמחסומים רצף ממתח או לפעמים מניעת לשחזור הישירים tRNA פרופיל משתמש ביצוע סטנדרטיים RNA כימות טכניקות6. קבוצות מחקר ברחבי העולם נאלצו לפתח טכניקות יצירתי אך לעיתים קרובות מפותל כדי להעריך את רמות tRNA הסלולר. כמה שיטות אלו כוללים: (1) הפרדת tRNAs סמויה שכותרתו electrophoretic דו-ממדית בשילוב עם הקצאה ספוט שיטתי על-ידי חשופה צפון1; (2) כימות בודדים על ידי צפון למחוק משתמש בזהירות מתוקננת רדיואקטיבי DNA הגששים7; (3) לאחר החילוץ תיוג עם cyanine fluorochromes ואחריו microarray ניתוח3ו (4) במבחנה בנוכחות אחר של tRNA ייודע אנזימים demodification רקומביננטי, אשר בשילוב עם שעתוק במהופך רצף תפוקה גבוהה8.
המקום פשוט ומקורי בשילוב של שתי הגישות רגילה וישירה: גוף (1) RNA תיוג, אשר מורכב ב הסינתזה, גדל אורגניזמים, רדיואקטיבי RNAs סה כ ו (2) tRNA macroarrays, כלי גנומית שיטתית, ולמחקר אופטימיזציה עבור tRNA סגרגציה.
דוגמאות בנויים אווירודינמית של אורגניזמים פלטפורמת כמת. הם מנותחים ישירות לאחר החילוץ, לא מעובד רחוק יותר אשר מגביל משמעותית את הטיות לעומת טכניקות הדורשות החילוץ שלאחר הגברה או טיפולים אנזימטיות. מקום רב תכליתי, ניתן לשלב בקלות כדי polysome fractionation כדי לזהות ולכמת subpopulations tRNA המשויכות פיזית לתרגם את הריבוזומים.
פרוטוקול המובאת כאן ממוטבת עבורו Mycobacterium smegmatis, גם בהצלחה שהשתמשו tRNAs פרופיל ב- Escherichia coli9 האפייה10, עכבר, תרביות תאים אנושיים11 .

<table><tbody><tr><td>Glass slide indexing system</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide arrayer replicator</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplate indexing system</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>Wash and blot station</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>Replicator pin dryer</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>Amine coated slides</td><td>Molecular Devices</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap 2 ml tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm glass beads</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>Mini bead mill</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>Storage phosphore screen</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimager</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>Select series 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Microarray centrifuge</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Mycobacterium smegmatis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>Single-use needles</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>2 ml centrifuge tube</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>Precipitant (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 broth</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemicals</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>hybridisation cassette</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

העברת RNAs (tRNA) נמצאים בשפע קצר ללא קידוד RNA מינים שהם בדרך כלל 76 ל-90 נוקלאוטידים אורך. tRNAs אחראים ישירות על סינתזת החלבון על ידי מתרגם codons ב mRNA לתוך רצפים של חומצות אמיניות. tRNAs נחשבו זמן כמו מולקולות משק בית חסר פונקציות רגולטוריות. עם זאת, גוף גדל והולך של ראיות מציין כי רמות tRNA הסלולר משתנים בהתכתבות לתנאים משתנים כגון סוג התא, הסביבה מתח. התנודות של tRNA ביטוי השפעות ישירות ג'ין תרגום, העדפה או מדחיק את הביטוי של חלבונים מסוימים. בסופו של דבר בדיוק את הדינמיקה של סינתזת חלבונים מחייב בפיתוח שיטות מסוגל לספק פרופילים tRNA באיכות גבוהה. השיטה שבה אנו מציגים כאן נקרא המקום, אשר מייצג עבור פלטפורמה יעילה Observing tRNA. ספוט בנויות משלושה שלבים החל תיוג מטבולית של תרביות תאים עם האורטו רדיואקטיבי, ואחריו guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם החילוץ של RNAs הכולל רדיואקטיבי והודפס סוף סוף הכלאה-ללא צורך במיקור חוץ macroarrays. רמות tRNA מוערך על ידי לכימות עוצמות קרינה רדיואקטיבית בנקודה כל בדיקה. בפרוטוקול המובאת כאן אנחנו פרופיל tRNAs Mycobacterium smegmatis mc2155, חיידק nonpathogenic משמש לעתים קרובות כאורגניזם מודל כדי ללמוד שחפת.

שלושה ביולוגית עצמאית משכפל מראים כי, בכפוף לתנאים צמיחה שנבדקו, כל מ smegmatis tRNAs באים לידי ביטוי מעל פני רקע (איור 1). בניסוי מסוים זה, נצפתה סטיית התקן עבור כל בדיקה מורכבת בין 2% (Arg (TCT)) 22% (Cys (GCA)) עם חציון ב-5% (איור 1). שינויים שווא בין משכפל מושפעים באופן משמעותי גורמים כמו הכלאה והכנה של מערך. הפארמצבטית גבוהה מושגת באמצעות מערך זהיר ועקבית הדפסה, כמו גם אוטומטי מדגם הכלאה. יש הבדל 5-fold בין סינתזת איל (גת) ו- tRNA (Val (עיגול), המין הגבוה ביותר ושופע הנמוך ביותר בהתאמה. המקום מראה כי הביטוי של tRNA isoacceptors אינה אחידה. Isoacceptors הם מינים להחזיק את חומצת אמינו אותו אבל להציג רצפים שונים anticodon ופענוח ולכן שונים codons על mRNAs. לדוגמה, כל isoacceptors אלנין באים לידי ביטוי ברמות דומות, ואילו ארגינין הגבוהים והנמוכים ביותר tRNAs מקבל נבדלים מקופלים ל- 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> איור 1: נציג tRNA macroarray תוצאות. (א) שנסרקו בקטריאלי, העכבר, macroarrays האנושית. מ smegmatis מערכים להשתמש רק 43 הגששים במקום 48 על העכבר ועל האדם. כתוצאה מכך, המערך חיידקי מציג כתמים ריקים 40 (הגששים משוכפלים שמונה פעמים על כל מערך) כי להתמזג עם הרקע. רובם מקובצים בפינה השמאלית העליונה. (B) ייצוגים היסטוגרמה, heatmap פרופילי tRNA smegmatis מ בתנאים מיטביים לצמיחה. אותות לווין הממוצע של 3 ניסויים עצמאית (כולל התפתחות חיידקים, תיוג מטבולית, הכלאה החילוץ ית), באים לידי ביטוי לפי אלף ערכים של tRNAs הכולל. סטיות תקן עבור שלושה משכפל מסומנים קווי שגיאה, גוונים של כתום על ההיסטוגרמה, heatmap בהתאמה. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays at JoVE.com

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

אנו מתארים פלטפורמה ניתוח העברה RNA המקורי בשם ספוט (פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA). המקום בו זמנית מודד רמות התאית של כל tRNAs בדגימות ביולוגיות, רק שלושה צעדים, פחות מ-24 שעות.

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K Views.  College of Charleston. אנו מתארים פלטפורמה ניתוח העברה RNA המקורי בשם ספוט (פלטפורמה יעילה להתבוננות tRNA). המקום בו זמנית מודד רמות התאית של כל tRNAs בדגימות ביולוגיות, רק שלושה צעדים, פחות מ-24 שעות.

Video: Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Bioengineering

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Biochemistry

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Medicine

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

סימון מטבולי של רנ&quot;א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ&quot;א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
</div>

Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

תיוג מטבולי

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

תיוג מטבולית, יצירת פרופילים של RNAs העברה באמצעות Macroarrays

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video