이 작업을 지원 했다 사우스 캐롤라이나 INBRE 교부 금에서 국립 연구소의 종합 의료 과학-NIH에 의해 (립에 P20GM103499) 국립 암 연구소에서 P.H.H. CA555536 및 CA154664를 부여 이 프로그램 지원 부분에서 전 대학 & 학부 과학 교육 프로그램을 통해 하 워드 휴즈 의학 연구소에서 차 알 스턴의 대학에 교부 금에 의해 그리고 국립 센터에서 교부 금에 의해 연구 자원 (P20 RR016461 5) 그리고 국립 연구소의 일반 의료 과학 (8 P20 GM103499) 건강의 국가 학회에서.

1. 문화 및 대사 라벨
<ol><li>적절 한 환기를 허용 하도록 18 게이지 바늘 한 번 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브의 뚜껑의 중심 찌른. 보충된 살 균 7 H 9의 500 µ L를 접종 선발에서 M. smegmatis 의 5 µ L로 국물 문화 성장된 하룻밤12. 참고: 7 H 9의 1 리터에 대 한 제조 법 국물은: 4.7 g 상업 7 H 9 분말, 2 mL 글리세롤, 1 mL 트윈 80, 0.85 g NaCl, 5 g 알 부 민, 2 g 포도 당, H2O (1 l 총 볼륨 려).<ol>
<li>
(주의) 표준 radioprotection 관행에 따라 스파이크 [32P] 나2HPO420 µCi/mL와 함께 문화 미디어. 9 m m 두꺼운 아크릴 방패 뒤에 흔드는 인큐베이터에서 37 ° C와 1200 rpm 동요에서 박테리아 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Midlog 단계 (O.D.600 nm ~ 0.5)에서 전체 문화 2 mL 스크류 캡 튜브에 전송과 centrifuging 여 실 온에서 방사성 박테리아 작은 공의 10000 x g. 2 분 수집 표면에 뜨는 포함 비법 인된 방사성 orthophosphate에 대 한 적절 한 폐기물 컨테이너입니다.</li>
</ol>2입니다. 총 RNAs의 준비
참고: 총 RNAs (guanidinium 안산, 페 놀, 클로 프롬 포함) 상업적인 RNA 추출 시 약을 사용 하 여 세균성 알갱이에서 추출 제조 업체의 프로토콜을 따르고.
<ol><li>상업적인 RNA 추출 시 약의 1 mL 및 펠 릿에 유리 구슬의 약 200 µ L를 추가 합니다. 튜브를 안전 하 게 뚜껑과 최대 교 반, 아래 2 분 동안 균질 화기에 박테리아를 방해 (번호 5 선택한 악기에 설정 ( 재료의 표참조)).</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 샘플 새로운 2 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬을 적절 하 게 삭제. 클로 프롬의 0.2 mL를 추가 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g에서 15 s. 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어</li>
	<li>낚시 튜브 45 °에 의해 새로운 관으로 샘플의 수성 단계를 수집 합니다. Interphase 또는 유기 레이어 그리기 하지 마십시오. 2 컬러 비례적의 µ L, 100% 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g에 5 미 원심 분리기에 대 한 손으로 적극적으로 튜브를 흔들어</li>
	<li>상쾌한 튜브에서 제거 하 고 적절 하 게 폐기 액체 분수 방사능의 흔적을 포함 수 있습니다. 공기 건조 펠 렛 5 분 후 염 분 나트륨 시트르산 (SSC) 0.1% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 마지막 X 2의 200 µ L에서 resuspend. 참고: 구성 주식 20 X SSC는 3.0 M NaCl, 0.3 M 나트륨 구 연산 염, pH 7.0.</li>
</ol>3입니다. 96 잘 프린터 접시의 준비
참고: tRNA microarrays 40 2 70-메 르 DNA oligonucleotides 8 핀 arrayer를 사용 하 여 각 M. smegmatis tRNA (터미널 CCA 제외)의 3' 끝에 보완 수동으로 인쇄 됩니다. DNA oligonucleotide 조사 잘 판에 배열 프로브 레이아웃의 시퀀스 제공 됩니다 (추가 파일 1-시트 1 ~ 3 각각).
<ol><li>디자인 DNA 프로브 검색 첫 번째 tRNA 시퀀스 또는 tRNA 인코딩 유전자 게놈 tRNA 등 tRNA 데이터베이스에서 데이터베이스13제공 합니다. 트림 보존 3' 끝 CCA 인코딩된 경우입니다. 보완 결과 시퀀스를 역방향. 주문 조사 처음 70 뉴클레오티드에 따라입니다.</li>
	<li>Resuspend는 DNA 프로브 물에 건조. 100 µ m 프로브 농도 조정 합니다. 96 잘 접시에서 3 X SSC, 0.01% (w/v) SDS 최종 (희석 60 µ L에 개별 잘 재고 프로브와 6 X SSC, 0.01% (w/v) SDS의 60 µ L에서에서 50 µ M oligos의 120 µ L를 준비.</li>
	<li>증발 또는 오염 방지 즉시 동결 하 고, 필요할 때까지-20 ° C에서 유지 하도록 깡통 호 일 접시 커버.</li>
</ol>4. 배열 인쇄
<ol><li>상 온 (약 20 분 소요)에서 96 잘 접시 녹여</li>
	<li>다이아몬드 펜 아민 코팅 유리 슬라이드 레이블. 슬라이드 인덱싱 장치에 놓습니다. 그리드 배치를 수행 하 고 다음과 같이 할.<ol>
<li>신중 하 게 우물에 복제기 핀 수영.</li>
		<li>부드럽게 인쇄 (작은 저항을 느낄 것 이다) 최소한의 압력을 사용 하 여 유리 슬라이드에 배열. Arrayer 블록 a 완료 될 때까지 청소 하지 않고 인쇄를 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 블록을 이동할 준비를 하는 경우 아래 설명 된 세척 절차를 따릅니다.<ol>
<li>5% 표 백제에 복제기와 부드럽게 악수.</li>
		<li>흡수 성 종이에 복제기를 누릅니다.</li>
		<li>복제기는 증류수에 찍어 부드럽게 흔들, 하 고 종이에 누릅니다. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>소 프로 파 놀에 복제기, 부드럽게 흔들어와 종이에 눌러.</li>
		<li>건조 한 약 20 팬에 복제기 96 잘 접시의 다음 블록을 이동 하기 전에 s. 인쇄의 원하는 번호를 계속 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>건조 후 crosslink 254 nm UV crosslinker를 사용 하 여 슬라이드에 oligos 슬라이드 수 있습니다.<ol>
<li>999,990 µ / c m2에 에너지 레벨을 설정 합니다.</li>
		<li>crosslinker에 깨끗 한 표면에 슬라이드 얼굴을 올려. "시작"을 누릅니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차단 차단 솔루션 자력, 실내 온도에 그리고 느린 동요의 밑에 450 mL에서 하룻밤 배열. 수집 및 재사용 차단 솔루션 최대 4 배. 참고: 차단 솔루션에 대 한 제조 법은: 125 m m 인산 버퍼 (NaH2포4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %SDS (w/v), 0.5 m m EDTA, 0.5 X SSC, 1 %BSA (w/v).</li>
	<li>500 mL의 증류수에 실 온에서 2 시간 5 분 대 한 슬라이드를 씻어. 슬라이드 10 centrifuging 여 건조 실내 온도 microarray 원심 분리기 s. 최대 6 개월까지 건조 하 고 어두운 장소에서 저장소 배열입니다.</li>
</ol>5. 배열 교 잡
<ol><li>교 잡 하기 전에 끓는 물에 슬라이드를 헹 구 고 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.</li>
	<li>교 잡 카세트 안에 배열을 놓고 방사선된 RNA 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>최대 재현성에 대 한 자동화 된 세척 교 잡 역을 실행 합니다.<ol>
<li>다음으로 프로그램 단계입니다. 75 ° c.에서 2 분에 대 한 조건 가스 켓 60 ° c.에 프로브를 소개 프로브 및 샘플 90 ° c.에서 5 분 변성 60 ° c.에 3 h에 대 한 샘플을 교배<ol>
<li>20 두 번 0.1 X SSC, 0.1 %SDS, 흐름 10 s와 42 ° C에 세척 슬라이드 s. 누르고 0.1로 두 번 42 ° C에서 20 미 세척 슬라이드 슬라이드 2 X SSC, 0.1% (w/v) SDS 흐름 10 s로 두 번 50 ° C에 세척 누르고 X SSC 흐름 10 s와 홀드 20 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>슬라이드 (4.6)에서 원심 분리 하 여 건조.</li>
</ol>6. 배열 정량화
<ol><li>얇은 플라스틱 필름을 사용 하 여 슬라이드를 감싸 줍니다. 그것의 가장 중요 한 설정에가 거 카운터를 사용 하 여 방사성 신호에 대 한 슬라이드를 확인 합니다. 신호 강도 따라 10 ~ 90 h에 대 한 실내 온도에 노출 카세트에 저장 인광 체 스크린에 슬라이드를 표시 합니다. 참고:가 거 카운터의 감도 다른 하나의 장비에서 다, 노출 시간 낙관 되어야 한다 실험적으로.</li>
	<li>50 µ m 해상도 phosphorimager를 사용 하 여 슬라이드를 검사 합니다. 계량 하 고 배경 빼기 microarray 프로파일러와 함께 업그레이드 무료 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 각 조사 현장에서 방사능 농도.</li>
	<li>구성 하 고 전자 스프레드 시트를 사용 하 여 데이터를 처리 합니다. 조건부 서식 도구를 사용 하 여 열 맵을 생성 합니다. 대표 예 각 프로브 신호 (‰로 표현) 부분으로 총 프로브 신호.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Emilsson, V., Kurland, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+rate+dependence+of+transfer+RNA+abundance+in+Escherichia+coli.">Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli.</a> EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).</li><li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression.">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).</li><li>Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tRNA+over-expression+in+breast+cancer+and+functional+consequences.">tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences.</a> Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).</li><li>Gieg&#233;, R., J&#252;hling, F., P&#252;tz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+transfer+RNAs:+similarity+and+variability.">Structure of transfer RNAs: similarity and variability.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).</li><li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs.">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li><li>Torres, A. G., Pi&#241;eyro, D., Rodr&#237;guez-Escrib&#224;, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-L&#233;ger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+modifications+in+human+tRNAs+are+incorporated+at+the+precursor+tRNA+level.">Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level.</a> Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).</li><li>Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Mar&#233;chal-Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+evolution+and+expression+of+Chlamydomonas+reinhardtii+nucleus-encoded+transfer+RNA+genes.">On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes.</a> Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).</li><li>Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+quantitative+high-throughput+tRNA+sequencing.">Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing.</a> Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOt:+A+novel+and+streamlined+microarray+platform+for+observing+cellular+tRNA+levels.">SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels.</a> PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).</li><li>Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIST,+a+Novel+Approach+to+Reveal+Hidden+Substrate+Specificity+in+Aminoacyl-tRNA+Synthetases.">MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases.</a> PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).</li><li>Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+Roles+of+Non-Coding+RNAs+in+TGF-&#946;-Mediated+Epithelial-Mesenchymal+Transition+and+Their+Functions+in+Tumor+Progression.">Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-&#946;-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression.</a> Cancers. 9 (7), (2017).</li><li>Belanger, A. E., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exponential-phase+glycogen+recycling+is+essential+for+growth+of+Mycobacterium+smegmatis.">Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.</a> J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).</li><li>Chan, P. P., Lowe, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GtRNAdb:+A+database+of+transfer+RNA+genes+detected+in+genomic+sequence.">GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence.</a> Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).</li><li>Schmidt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Radioactive+Phosphorus+upon+a+Suspension+of+Escherichia+coli.">The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

그러나 베타 입자 배출 시험된 범위에 방사선 셀 체력에 큰 영향을 주지 않습니다 bacteriostatic 및 살 균 에이전트14,으로 알려져 있습니다. 섬광 계산 보여주었다 방사능의 총 세포 추출 물 25% 및 그 후, 정제 총 RNAs의 1%에 통합 됩니다.
프로브 동일한 크기, 비교 용융 온도 및 GC 콘텐츠, macroarray 안보에 대 한 균일 한 프로토콜 함께 교 잡 및 정량화 자리 신호에서 직접 tRNA 레벨의 편견된 측정에 대 한 수 있습니다.
재현할 수 및 특정입니다. 그것의 넓은 동적 범위와 쉽게 조정 가능한 임계값 낮은 풍부한 종, tRNAs 배열 노출 시간9연장 하면 polysomes, 연관 프로 파일링 수 있습니다. 필요한 장비에 대 한 초기 투자 후 샘플, 소모품를 포함 하 여 당 비용 실행 샘플 당 $15를 평균 한다.
자리는 누구의 게놈은 프로브 디자인에 사용할 수 있는 모든 유기 체에 적용 됩니다. 생체 외에서 재배 되는 모델 생물 대사 라벨에 대 한 이상적인 후보자 이다. 포유류 게놈 종종 많은 isodecoders (동일한 anticodons를 공유 하지만 그들의 몸 시퀀스에서 작은 차이 표시 tRNAs) 인코딩으로 프로브 가까운 tRNA의 동종 하이브리드를 보존 하기 위해 부분적으로 퇴 화 될 필요가 있다. 마지막으로, 부착 포유류 세포에 M. smegmatis, 같은 문화 실질적으로 확장 될 필요가 성장 하는 유기 체에 비해 총 RNA의 일반적으로 낮은 금액을 산출 한다.

세포질 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스1,2,3등 조건에 따라 변동. 자리, tRNA, 관찰을 위한 효율적인 플랫폼 이며 원본, 신뢰할 수 있는, 실험실 성장 유기 체에서 전송 RNA 레벨의 신속 하 고 정확한 정량화를 허용 하는 간단 기술.
tRNAs 있다 현저 하 게 안정 된 2 차 및 3 차 구조4. 그들은 또한 수많은 post-transcriptional 수정5를 표시합니다. 이러한 기능은 중요 한 구조 및 시퀀스 검문소 바이어 싱 또는 때로는 직접적이 고 재현 tRNA 표준 벤치 마크 RNA 정량화 기법6을 사용 하 여 프로 파일링 방지를 나타냅니다. 전 세계 연구 단체 세포질 tRNA 수준을 평가 하 창조적인 하지만 종종 복잡 한 기술을 개발 하도록 강요 했다. 이러한 방법 중 일부를 포함: (1) 2 차원 전기 이동 별거 metabolically 레이블이 tRNAs의 조직적 자리 배정 북부 오 점1;에 의해 결합 (북부 여 2) 개별 정량화 되 신중 하 게 표준화 된 방사성 DNA 프로브7;를 사용 하 여 리 (microarray 분석3, 그리고 (4) 생체 외에서 의 tRNA 수정 반전 녹음 방송 결합 및 후속 재조합 demodification 효소를 사용 하 여 스트립 다음 cyanine 형광와 라벨 3) 게시물 추출 높 처리량 연속8.
자리는 2 개의 표준 및 간단 접근의 간단 하 고 원래의 조합: (1) RNA 몸, 성장 하는 유기 체, 방사성 총 RNAs tRNA (2) macroarrays, 체계적이 고 소형 게놈 도구의 합성에서으로 구성 된 tRNA 분리에 대 한 최적화.
샘플은 정량화 플랫폼에 살아있는 유기 체에서 간소화 됩니다. 그들은 직접 추출 후 분석 하 고 어떤 더 크게 증폭 후 추출 또는 효소 치료 기법에 비해 편견 제한 처리 되지 않습니다. 자리는 다양 하 고 식별 하 고 물리적으로 연결 된 리보솜 번역 tRNA 모집단 계량 polysome 분별에 쉽게 결합 될 수 있다.
여기에 제시 된 프로토콜은 진 균 smegmatis, 최적화 되어 있으며 그것은 또한 성공적으로 대장균9, Saccharomyces cerevisiae10, 마우스, 그리고 인간의 세포 배양11 프로필 tRNAs에 사용 되었다 .

<table><tbody><tr><td>Glass slide indexing system</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 470</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide arrayer replicator</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 478</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplate indexing system</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 472</td><td></td></tr><tr><td>Wash and blot station</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 475</td><td></td></tr><tr><td>Replicator pin dryer</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 474</td><td></td></tr><tr><td>Amine coated slides</td><td>Molecular Devices</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>Hybridizer / Automated hybridization and washing station</td><td>Digilab</td><td>Hyb10022</td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>Eppendorf Themomixer</td><td>05-400-200</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap 2 ml tubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>21-403-201</td><td></td></tr><tr><td>[32P] Na2HPO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX011001MC</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm glass beads</td><td>Research Products International Corp.</td><td>9831</td><td></td></tr><tr><td>Mini bead mill</td><td>VWR</td><td>25-020</td><td></td></tr><tr><td>Storage phosphore screen</td><td>Fujifilm</td><td>BAS-IP SR 0813</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorimager</td><td>GE Healthcare</td><td>Typhoon FLA7000</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonucleotides</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>Spectroline</td><td>Select series 254 nm</td><td></td></tr><tr><td>Microarray centrifuge</td><td>Arrayit Corporation</td><td>MHC110V</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Mycobacterium smegmatis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>700084</td><td></td></tr><tr><td>Single-use needles</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>2 ml centrifuge tube</td><td>Fisherbrand</td><td>14-666-317</td><td></td></tr><tr><td>Precipitant (GlucoBlue)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>7H9 broth</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Chemicals</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>20 X SSC</td><td>Lonza</td><td>51205</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>hybridisation cassette</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Amresco</td><td>M126-100ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>A3611</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Phosphate buffer pH 7.2</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ63974AP</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic labeling and profiling of transfer rnas using macroarrays

전송 RNAs (tRNA)는 풍부한 짧은 비 코딩 RNA 종 일반적으로 76 ~ 90 뉴클레오티드 길이에서. tRNAs는 codons mRNA에 아미노산으로 변환 하 여 직접 단백질 합성에 대 한 책임이 있습니다. tRNAs 했다 긴 집 유지 분자 규제 기능 부족으로 간주 됩니다. 그러나, 증거의 성장 몸은 셀룰러 tRNA 레벨 셀 유형, 환경, 스트레스 등 다양 한 조건에 대응에 변동 나타냅니다. TRNA 식의 변동 진 번역을, 선호 또는 특정 단백질의 식을 억압에 직접 영향을 줍니다. 궁극적으로 단백질 합성의 동적 이해 높은-품질 tRNA 프로필을 제공할 수 있는 방법의 개발을 필요 합니다. 우리가 여기에 제시 하는 방법 자리 관찰 tRNA를 위한 간소화 된 플랫폼에 대 한 의미 하는 이름입니다. 자리 방사성 orthophosphate, guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-추출 방사성 총 RNAs의 뒤와 세포 배양의 대사 라벨로 시작 하는 3 단계 구성 하 고 마지막으로 사내에 교 잡 인쇄 macroarrays입니다. tRNA 레벨은 각 조사 현장에서 방사능 농도 측정 하 여 견적 된다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리는 진 균 smegmatis mc2155, 결핵 연구에 모델 생물으로 자주 사용 nonpathogenic 박테리아에에서 tRNAs 프로필입니다.

3 개의 독립적인 생물 복제 쇼, 테스트 성장 조건, 모든 M. smegmatis tRNAs 배경 수준 (그림 1) 위에 표시 됩니다. 이 특정 실험에서 관찰 된 표준 편차 각 프로브에 대 한 2% (Arg (TCT)) 및 5% (그림 1)에서 평균 22% (Cys (GCA)) 사이 구성 됩니다. 복제 사이의 허위 변경 배열 준비 및 교 잡 같은 요인에 의해 크게 좌우 된다. 높은 재현성은 샘플 교 잡 자동화 뿐만 아니라 신중 하 고 일관성 있는 배열 인쇄를 통해 이루어집니다. TRNA 사이의 5 차이 Ile (GAT) 및 tRNA (발 (전술), 높고 낮은 풍부한 종 각각. 자리는 tRNA isoacceptors의 표현 유니폼을 보여줍니다. Isoacceptors는 동일한 아미노산을 개최 하지만 다른 anticodon 시퀀스를 표시 하 고 따라서 mRNAs에 다른 codons를 디코딩 종입니다. 반면 모든 알라닌 isoacceptors 비슷한 수준에서 표시 됩니다 예를 들어 수락 tRNAs 3-fold 다른 최고 및 최저 아르기닌.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56898/56898fig1.jpg"> 그림 1: 대표적인 tRNA macroarray 결과. (A) Scanned 박테리아, 마우스 및 인간의 macroarrays M. smegmatis 배열 마우스 및 인간의 48 대신만 43 프로브를 사용합니다. 결과적으로, 세균성 배열 40 빈 관광 명소 (프로브는 각 배열에 8 번 복제 됩니다) 그 배경과 조화를 표시 합니다. 그들의 대부분 왼쪽된 상단 클러스터링 됩니다. 최적의 성장 조건 하에서 M. smegmatis 에 tRNA 프로필의 (B) 히스토그램 및 heatmap 표현. 프로브 신호 (를 포함 하 여 세균 성장, 신진 대사 라벨, 추출 및 배열 교 잡) 3 개의 독립적인 실험의 평균 이며, 총 tRNAs의 천 값에 의하여 표현 됩니다. 3 복제에 대 한 표준 편차는 각각 오차 막대와 막대 그래프와 heatmap에 오렌지의 음영으로 표시 됩니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56898/56898fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

metabolic-labeling-and-profiling-of-transfer-rnas-using-macroarrays

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K 조회수.  College of Charleston. 우리는 원래 전송 RNA 분석 플랫폼 자리 (유선형 플랫폼 관찰 하는 tRNA) 라는 설명 합니다. 자리 동시에 세포 수준의 생물 학적 샘플, 3 단계, 그리고 24 시간 이내에 모든 tRNAs 측정합니다.

비디오: Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the research and pharmaceutical communities. To study miRNAs, it is essential that the quantification of microRNA levels is accurate and robust. By comparing wild-type to small RNA deficient mouse embryonic stem cells (mESC), we revealed a lack of accuracy and robustness in previous published multiplex qRT-PCR techniques. Here, we describe an optimized method, including purifying away excessive primers from previous multiplex steps before singleplex real time detection, which dramatically increases the accuracy and robustness of the technique. Furthermore, we explain how performing the technique on a microfluidic chip at nanoliter volumes significantly reduces reagent costs and permits time effective high throughput miRNA expression profiling.

Here we describe an optimized multiplex reverse transcriptase quantitative PCR (qRT-PCR) protocol in combination with a microfluidic platform as a cost and time effective high-throughput screening tool for microRNA (miRNA) expression levels, especially when working with limited amounts of sample.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

연구

생체공학

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

유전학

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of the RNA produced during a brief period of labelling. This is done by attaching a biotin moiety to the incorporated thio group and affinity purifying, using streptavidin coated beads. Achieving a good yield of pure, newly synthesized RNA that is free of pre-existing RNA makes shorter labelling times possible and permits increased temporal resolution in kinetic studies. This is a protocol for very specific, high yield purification of newly synthesized RNA. The protocol presented here describes how RNA is extracted from the yeast Saccharomyces cerevisiae. However, the protocol for purification of thiolated RNA from total RNA should be effective using RNA from any organism once it has been extracted from the cells. The purified RNA is suitable for analysis by many widely used techniques, such as reverse transcriptase-qPCR, RNA-seq and SLAM-seq. The specificity, sensitivity and flexibility of this technique allow unparalleled insights into RNA metabolism.

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

The use of thiolated uracil to sensitively and specifically purify newly transcribed RNA from the yeast Saccharomyces cerevisiae.

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

생화학

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

의학

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

생물학

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Polysom​​e 프로파일 링 포유 동물 세포에 선택적 mRNA의 번역 평가

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
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<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
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<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
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<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
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<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
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<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
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Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

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