אנו מודים אנדריאס Schönle, מקס פלאנק, המכון לכימיה Biophysical, גרמניה דוד י סאנדסטרום, המכון הלאומי לבריאות הנפש, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ארה&quot;ב ייעוץ טכני. אנו מודים פרנק Kötting, אירופה Neuroscience Institute, גטינגן לבניית תא הדמיה המכשיר הרדמה. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של Forschung אלצהיימר היוזמה TMRYZ נתמך על ידי מענק של מלגות סין המועצה, SBH על ידי מענק של המדרשה עבור תאית ומולקולרית Neuroscience, מאוניברסיטת טובינגן.

א &#39;) בעצרת של תא הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר הזחל של השלב שנבחר (למשל מוקדם 3 rd הזחלים עוזבים instar מרווח התבוננות של כ 24 שעות במהירות של 25 ° C עד נדודים הבמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הזחל עם מים לנקות את זה במדיום תרבות מורחת אותו יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סמל מרכז אלמנט התחתון של החדר, האזור להתמודד עם הזחל, עם שכבה דקה של שמן halocarbon. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו את הזחל עם הצד הגחוני מול המטרה מיקרוסקופ בחדר (מאפשר neuromuscular צומת (NMJ) 26 ו 27 כדי להיות צילמו) (איור 1 AE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את spacer פלסטי על שכבת שמן, עם חריצי אוויר של הפנים כלפי מעלה לרשת (איור 1). ודא בשלב זה: גובה spacer הוא בערך מחצית הקוטר הזחל, רוחב החריץ צריך להיות בערך פעמיים את הקוטר של הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא הדמיה על המיקרוסקופ </li></ol> ב) הרדמה של הזחל <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור שני פתחי הכניסה של החדר עם הרדמה מתאימה למכשיר / מאדה. אנא ודא-up מול: ריכוז יעיל של desflurane באוויר חדר לא יעלה על זה שצוין על ידי תקנות הבטיחות! רק בהיקף כולל קטן מאוד של desflurane יש צורך להרדים הזחלים. יישום של 15% (V / V) של 1 desflurane הוכיחה להיות נקודת התחלה טובה לקביעת ריכוז אידיאלי לשמש בניסוי. מטעמי בטיחות אנו מציעים מאדה לעולם לא יכילו יותר מ desflurane הדרושים 2-4 שעות בתחום ההדמיה vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקצה השני של הצינור המחובר לשקע קאמרית כוס מים ולאחר מכן פתח את השסתומים שליטה על הזרימה של חומר הרדמה אל תוך החדר במשך כחמש שניות. ודא בשלב זה: האם לעלות בועות אוויר בתוך המים? אם לא חדר הוא דולף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את השסתומים במשך כשלוש שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג תנועות הזחל שיורית המיקרוסקופ. בדוק גם את פעימות הלב ואת תנועות שרירים. אם שסתומים לפתוח ולסגור הכרחי כמתואר בשלב 8 ו -9 עד הרדמה של הזחל תושלם, ואז לסגור את כל שסתומי ולהתחיל הדמיה. ודא בשלב זה: תנועת שריר הלב או שיורית מציין כי הזחל אינו מורדם כראוי. הרדמה מלאה חיונית תמונות ברזולוציה גבוהה. הזחל בדרך כלל לא צריך להיות מורדם יותר מ 15-20 דקות בכל זמן נתון. </li></ol> ג) הדמיה <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את העמדה הנכונה התמונה את המבנה של עניין (איור 2-4). </li></ol> ד) השחזור הרדמה <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הדמיה לתת אוויר לתוך החדר. ודא בשלב זה: בדוק דופק התכווצויות שרירים של זחל על ידי אור הלוגן המשודר. כאשר השרירים מתחילים קבלנות זה בטוח כדי להסיר את הזחל מן החדר הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק הקאמרית מהמכשיר הרדמה ולהסיר ממנו המיקרוסקופ. לפרק את התא בזהירות המקום הזחל במדיום לטוס מחית טיפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המנה באינקובטור בטמפרטורה המתאימה. </li></ol> ה) זמן סדרה <ol start="15" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים עד 2-14 נקודות מספיק זמן הושגו. פרוטוקול אלטרנטיבי: אם הזחל הוא להיות צילמו יותר מפעם אחת בתוך מרווח של 30 דקות זה יכול להיות מעשי להשאיר אותו בתא הדמיה עד נקודת הרדמה בפעם הבאה. חזור על השלבים עד 7-14 נקודות מספיק זמן הושגו. ודא בשלב זה: הזחל לא להיות כל הזמן בחדר הדמיה במשך יותר משעתיים בכל פעם, וגם לא להיות מורדמים יותר מ 15-20 דקות בכל פעם. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 העצרת של החדר הדמיה. (א) הנח את הזחל ואת spacer פלסטי על שכבת שמן. (ב) מקום 22 x 22 מ&quot;מ לכסות להחליק על spacer ולהכניס את הטבעת מדריך פרספקס לתוך החדר, ליד (ג) לתקן את המיקום של הזחל עם טבעת מתכת (ד &#39;) לסגור את החדר. (ה) עכשיו החדר הוא מוכן להיות מותקן על המיקרוסקופ. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="איור 2" /> תרשים 2 קיר גוף שרירי הזחלים תסיסנית. שרירים NMJs היו דמיינו ידי ביטוי חלבון CD8-GFP-SH היתוך 8. השרירים מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחל. ב (AC) השריר השטחי ביותר, 27, מוצגת, ב (KL) שרירי פנים ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות היא 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3 זהות הגוף קיר השרירים הזחלים תסיסנית. זהותו של השרירים הזחלים תסיסנית L3, A3 מגזר, מוצג. שרירים NMJs היו דמיינו ידי ביטוי חלבון CD8-GFP-SH היתוך 8. השרירים מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחלים. ב AC השריר השטחי ביותר, 27, מוצגת, ב KL את השרירים הפנימיים ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות היא 2 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4 זהות של צמתים neuromuscular של הזחלים תסיסנית. (AD) NMJs היו דמיינו ידי ביטוי של חלבון היתוך DGluRIIA-mRFP 1. NMJs מוצגים כפי שנצפה כאשר התמקדות בצד הגחוני באמצעות לציפורן לתוך הזחל. ב (AB) NMJ שטחית ביותר, 27, מוצגת, ב CD NMJs הפנימי ביותר, 6 ו -7, מוצגים. בר קנה מידה: 100 מיקרומטר, ΔZ בין פרוסות הוא 5 מיקרומטר. (ה) ו - (F) את זהותו של השטחי (E) פנים יותר (F) NMJs ניתנת התייחסות.

<ol>
	<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo.">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]. , (1988).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+of+mitochondria.">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li><li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila.">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li><li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li><li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &. a. m. p. ;. a. m. p., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+a+synapse+grow:+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila.">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה פותחה בתחילה הציג ללמוד סינפסות glutamatergic על הקיר שרירי הגוף של הזחלים melanogaster תסיסנית. Neuromuscular תסיסנית צומת (NMJ) מתאפיינת בארכיטקטורה Cyto-סטריאוטיפית של השרירים נוירונים ועל כן אידיאלי עבור הדמיה vivo. עם זאת, פרוטוקול הרדמה המתואר אינו מוגבל הדמיה NMJ; את השקיפות של הזחלים תסיסנית מאפשר עיבוד של פרוטוקול המתואר ללמוד על התפתחות איברים, הגירה של תאים, הובלת מטען axonal ותת הסלולר מחדש בתוך התאים.

ריאגנטים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desflurane (Suprane, בקסטר, Unterschleissheim, גרמניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Halocarbon שמן (למשל Voltalef H10S שמן / Atofina, Puteaux, צרפת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוס בינוני תרבות </li></ul> ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ confocal הפוך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשקפת מיקרוסקופ (למשל STEMI 2000, Carl Zeiss, Jena, גרמניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכחול קטן כמו משמש מעין זבובים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגרה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מותאמים אישית, שנבנו הדמיה (עבור ציורים מכני לראות שופט. 3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאדה / הרדמה המכשיר (לפרטים ראה Ref. 3) </li></ul>

in vivo imaging of intact drosophila larvae at sub-cellular resolution

שיפורים אחרונים הדמיה אופטית, fluorophores מקודדים גנטית וכלים הגנטי המאפשר הקמת יעיל של קווי הרצוי חיים מהונדס אפשרו תהליכים ביולוגיים להיחקר בהקשר של פרנסה, ובמקרים מסוימים אפילו מתנהג, האורגניזם. בפרוטוקול זה נתאר כיצד להרדים שלם הזחלים תסיסנית, באמצעות הרדמה נדיפים desflurane, לעקוב אחרי התפתחות של אוכלוסיות פלסטיות סינפטית על המשנה הסלולר ברזולוציה 1-3. בעוד שיטות שימושיים נוספים להרדים הזחלים תסיסנית melanogaster תוארו בעבר 4,5,6,7,8, פרוטוקול המוצגת כאן ממחישה שיפורים משמעותיים בשל התכונות הבאות מפתח משולב: (1) רמה גבוהה מאוד של הרדמה, אפילו פעימות הלב הוא נעצר המאפשר ברזולוציה ננומטר לרוחב של עד 150 1, (2) שיעור הישרדות גבוה של 90%&gt; בכל מחזור הרדמה, המתירה הקלטה של יותר מחמש נקודות זמן על פני תקופה של שעות עד ימים 2 ו ( 3) רגישות גבוהה המאפשרת לנו 2 מקרים ללמוד את הדינמיקה של חלבונים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות. בפירוט, היינו יכולים לחזות את קולטן הגלוטמט postsynaptic למקטע GluR-IIA לידי ביטוי באמצעות האמרגן אנדוגני 1 בקווים מהונדס יציבה קו מלכודת אקסון FasII-GFP 1. (4) בניגוד לשיטות אחרות 4,7 הזחלים ניתן הדמיה לא רק חי, אלא גם שלמות (כלומר לא גזור) המאפשר תצפית להתרחש על פני מספר ימים 1. הפרטים וידאו המלווה את הפונקציה של חלקים בודדים של in vivo הדמיה תא 2,3, הנכון הרכבה של הזחלים, הליך הרדמה, איך מחדש לזהות עמדות ספציפיות בתוך הזחל לבין הסרת בטוחה של הזחלים מן הדמיה קאמרית.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution at JoVE.com

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של שלם<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; הזחלים. יש לנו ניצלו את הרדמה נדיפים desflurane כדי לאפשר הדמיה חוזרות ברזולוציה המשנה הסלולר מחדש זיהוי מבנים של עד כמה ימים<sup&gt; 1</sup&gt;.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

14.5K Views.  University of Tübingen. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של שלם תסיסנית melanogaster הזחלים. יש לנו ניצלו את הרדמה נדיפים desflurane כדי לאפשר הדמיה חוזרות ברזולוציה המשנה הסלולר מחדש זיהוי מבנים של עד כמה ימים 1.

Video: In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage של זחלי דג זברה

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...