עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלברטה הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים, חברים של גארט קאמינג מחקר יו ר הקרן, קרן כיסא של מחקרים המדע של HM Toupin נוירולוגיות, ניוון שרירים קנדה, קנדה קרן עבור חדשנות (CFI), אלברטה מתקדם החינוך והטכנולוגיה (הארכה), קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR), המסע של ג'סי - הקרן ג'ין, טיפול בתאי, הנשים, הילדים הבריאות מכון המחקר (WCHRI), ומחדש אלברטה פתרונות בריאות (AIHS ).
ברצוננו להודות ד ר סטיבן לאוול לספק לנו פלסמיד dysferlin באורך מלא. אנחנו רוצים גם תודה ד ר קצויה מיאקי עצות טכניות.

תאי פיברובלסט האנושי השתמשו במחקר זה נעשה שימוש באישור ועדת האתיקה האנושית של הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים באוניברסיטת אלברטה.
1. תרביות תאים תאים עם פלסמיד DYSF באורך מלא
<ol>
	<li>התרבות תאי פיברובלסט בבקבוקון T225 המכיל 40 מ של צמיחה מדיה - בינוני נשר שונה (DMEM) של 36 מ"ל Dulbecco, 4 מיליליטר סרום שור עוברית (FBS) ו 20 µL של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) - ב חממה2 CO ב 37 º C. הערה: התאים צריכים להיות בתרבית עד כ 70-80% confluency, אסור להפוך confluent לחלוטין.</li>
	<li>כדי להתכונן זריעת תאי, לשטוף את התאים 40 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) פעמיים ולאחר מכן הוסף 5 מ של 0.05% טריפסין כדי לנתק את התאים. להחזיר התאים 37 ° C CO2 מגשים, דגירה התאים במשך 5 דקות.<ol>
		<li>כאשר התאים מנותק לחלוטין, להוסיף 40 מ"ל של צמיחה מדיה כדי לעצור את התגובה טריפסין.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer או תא אחר ספירת ההתקנים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>זרע 2 מ"ל של תאים-עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל 35 מ מ מצופה קולגן זכוכית-התחתון מנות. דגירה בין לילה בתאים חממה2 CO ב 37 º C. הערה: תאים צריך להיות כ- 50-60% confluent למחרת.</li>
	<li>מסיר את המדיה צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של הפרעות-סרום התקשורת (מדיה צמיחה בלי FBS).</li>
	<li>Transfect התאים עם פלסמיד באורך מלא dysferlin באמצעות lipotransfection.<ol>
		<li>להכין µL 150 של הפרעות-סרום מדיה צינור 1.5 mL (שפופרת אחת עבור כל מנה להיות transfected).</li>
		<li>להוסיף 3 µL של תרביות תאים ריאגנט כל שפופרת 1.5 mL המכיל הפרעות-סרום מדיה. דגירה זה לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בשפופרת mL 1.5 נפרדת, מוסיפים µL 175 של מדיה הפרעות-סרום µg 3.5 של פלסמיד ה-DNA. הערה: להכפיל את הכמויות הנ עבור כל מנה נוספת להיות transfected.</li>
		<li>לשלב 150 µL של המדיה המכילה פלסמיד DNA לתוך צינור עם 150 µL הפרעות-סרום ומדיה ריאגנט תרביות תאים. תקופת דגירה זה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>פזר באופן שווה 300 µL של התקשורת עם ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים על-פני המנה. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב חממה2 CO ב 37 º C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>החלף את המדיה צמיחה טריים המדיה המכילה סרום, תקופת דגירה זה של h 24 נוספים ב חממה2 CO ב 37 º C.</li>
</ol>
2. הכנה של תאים assay ופצעו שני הפוטונים
<ol>
	<li>להסיר כלי התקשורת על-ידי pipetting, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode טריים המכילים µL 1 של 2.5 מ מ FM צבע 4-64. הערה: הריכוז הסופי של FM 4-64 צבען הוא 2.5 מיקרומטר.</li>
	<li>אם הערכה של תיקון קרום בסביבה מדולדל סידן רצוי, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל 1 מ מ EGTA. הערה: כפי PBS יגרמו התאים לנתק לאורך זמן, וזמינותו wounding צריך להשלים מהר ככל האפשר.</li>
</ol>
3. שני הפוטונים לייזר assay ופצעו
<ol>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה והתוכנה התוכנית המשויכת אליו, ליצור מטרה מיקרומטר 0.2 µm x 2 והנח אותו בקצה של קרום התא כך קו המטרה חופף הוא בניצב לכיוון קרום התא (איור 2).</li>
	<li>משתמשים בלייזר הנה 543-nm לרגש FM לצבוע אות ולקבוע טווח זיהוי עבור 600-760 ננומטר. השתמש לייזר ארגון 488 ננומטר לרגש GFP אות (איור 4) ולקבוע טווח זיהוי עבור 500-550 ננומטר.<ol>
		<li>צור סידרה זמן 5 דקות של סריקות תמונה רציפה, הדמיה תאים כל 5 s.</li>
		<li>ליצירת פצע ממברנה, אקונומיקה התאים באמצעות לייזר שני הפוטונים מוגדר כ- 820-nm, באמצעות 15% לייזר כוח עם 10 חזרות, אקונומיקה תאים 25 s לאחר תחילת סדרת הזמן.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כדי לכמת FM 4-64 לצבוע פלורסצנטיות, להשתמש בתוכנה לצייר אזור מיקרומטר מיקרומטר x 6 6 עניין (ROI) ואת למקם אותו סמוך אל המיקום wounding, בתוך התא (איור 3). הערה: להימנע דגימה תחומי פיקסל oversaturation באמצעות הפונקציה "טווח מחוון" בתוכנה - ביישום זה, הפיקסלים האדומים מייצגים פיקסלים רווי. לייצא ערכים פלורסצנטיות גולמיים לתוך גיליון אלקטרוני אלקטרונית של לשם ניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>לחשב פלורסצנטיות יחסי ערכים עבור כל נקודת זמן על-ידי חיסור הערך רקע (זריחה אומר ערך של timepoints לפני ממברנה ופצעו) ואת חלוקת העלייה נטו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הערך ב- t = 0 (איור 5, 6) .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo.">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Repair:+Mechanisms+and+Pathophysiology.">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li><li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+free+Ca2++and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells.">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li><li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair.">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage.">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li><li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury.">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li><li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi/beige+cells.">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li><li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses.">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos:+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo.">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair.">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li><li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy.">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li><li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li><li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שני הפוטונים לייזר פציעתו של קרום התא הוא טכניקה מדויק ופסיביות להערכת את הדינמיקה של קרום חתימה מחדש בתוך חוץ גופית. במאמר זה, אנו המתואר פרוטוקול לקביעת קרום התא חתימת יכולת בתאי החולה dysferlinopathy באמצעות הלייזר שני הפוטונים ופצעו וזמינותו. התוצאות שלנו להראות כי dysferlinopathy החולה תאים פ?...

קרום התא של התאים האיקריוטים מורכב שכבה כפולה של פוספוליפידים משובץ-חלבון אשר מגדיר את סביבת חוץ-על/תאי "אינטרה" של התא היא חיונית לשמירה על הישרדות הומאוסטזיס ותא הסלולר. קרום התא פציעות הנובעות עלבונות כימי או מכני הם דבר שבשגרה בסוגים בתרבית של תאים שונים, לרבות שלד, שריר הלב, הקיבה והריאות תאים1,2,3,4. בנוסף פציעות הסוגר יומי תפקיד פיזיולוגי, קרום התא יכול גם להיות נפגע על ידי עלבונות סביבתיים רעלים חיידקי, פגיעה reperfusion איסכמי5. כישלון כדי לחתום מחדש יתבקע קרום התא מוביל תזרים ללא פיקוח של חוץ-תאית Ca2 +- יחד עם רכיבים אחרים חוץ-תאית רעיל - לתוך התא, מפעילה cascades האות במורד הזרם, אשר עלולה לגרום במהירות בתא מוות1,4,5,6.
עד כה, היו מספר דגמים המוצע לתיקון ממברנה בתאים. אולי ניתן להפעיל מנגנוני תיקון שונים תלוי בגודל אופי העלתה קרום. כך למשל, הוא הציע כי קרום התא עשויים לנצל זרימת לרוחב או חלבון סתימת לתקן שיבושים קטנים (&#60; 1 ננומטר). המודל פיוז'ן לרוחב מציעה כי קרום יתבקע במהירות לתיקון דרך גיוס לרוחב של המכילות dysferlin ממברנה7, ואילו החלבון סתימת דגם מרמז כי נקבים קטנים הם לתיקון דרך הצטברויות של חלבון (בעיקר annexins) 8. לעומת זאת, לעורר נגעים ממברנה גדולות Ca2 +-שלפוחית התלויים, בתיווך dysferlin פיוז'ן ועל היווצרות טלאי תיקון. במודל טלאי תיקון, Ca2 + הזרימה המהירה לתוך התא מפעילה הגיוס של חלבונים מרובים (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ו EDH חלבונים) אשר ליצור מתחם או "תיקון", יחד עם שילוב של שלפוחית תאיים או lysosomes באתר של הממברנה גורם נזק4,9,10,11,12. חשוב לשים לב כי מודלים אלה אינם בהכרח סותרים, אולי לעבוד ביחד כדי להקל על תיקון קרום. כשל לחתום כראוי נזק קרום התא משויך מספר מצבי מחלה, כולל ניוון שרירים (dysferlinopathy - כולל מיושי מיופתיה, חגורת הגפיים-ניוון שרירים מסוג IIB, מיופתיה דיסטלי עם תחילת הטיביאלי הקדמי) 13, קרדיומיופתיה14ו- Chediak-היגאשי תסמונת (CHS)15.
נתון זה שלמות קרום התא המתאים וחתימה מחזות תפקיד כה חשוב על בריאות ומחלה, הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המולקולריים הבסיסית של תיקון קרום התא יהיה מועיל בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות. לכן,, יש להחזיק טכניקות ניסיוני המתאים כדי לפקח על קינטיקה, להעריך את היכולת של תיקון קרום התא. מספר במבחנה שיטות לסימולציה תיקון קרום עוצבו. אסטרטגיה אחת כרוכה פגיעה מכנית, אשר ניתן להקל באמצעות תא גירוד עם תער/להב פיפטה/כירורגי או על ידי גלגול חרוזי זכוכית על תאי ה-16. עם זאת, סוג זה של פציעה מכני יוצר נגעים גדולים ויוצרת רמה גבוהה של וריאציה תא לפציעה, הן בתוך והן בין תרבויות.
שיטה נוספת של יצירת פצעים ממברנה היא אבלציה לייזר על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. בניגוד לייזר מסורתיות מיקרוסקופיה קונפוקלית מעסיקה עירור פוטון יחיד, הלייזר שני הפוטונים משתמשת בו זמנית שני פוטונים ארוך באורך הגל, אנרגיה נמוכה כדי להקל את עירור של אלקטרון בעל אנרגיה גבוהה17. תהליך ליניארי זה יוצר עירור אך ורק בתוך המטוס מוקד וגם לא לאורך כל הנתיב אור17 (איור 1). זה מופחת עירור העוצמה מסייעת למזער את נזקי כאשר הדמיה תאים חיים18,19. חוקרים ולכן מסוגלים לייצר נגעים מדויקת קרום התא וחתימה צג ממברנה בזמן אמת באמצעות צבעי פלורסנט ו התבוננות שינויים בעוצמת פלורסצנטיות כמו קרום התא יתבקע ולאחר מכן החתימות מחדש.
בגישה זו נעשה שימוש שוב ושוב ללמוד ממברנה ופצעו בתוך חוץ גופית ו ויוו וסוגי בתא מספר20,21. לדוגמה, ממברנה לתקן פגמים fibroblasts, myotubes נגזר dysferlinopathy חולים היו העריך באמצעות טכניקה זו,22,23. כמו כן, סיבי שריר בודד מבודד עכברים שימשו כדי לפקח על תיקון תיקון היווצרות13,24,25. התנועה של חלבונים מתויגות fluorescently יכול גם להיות שנצפו במהלך תיקון קרום סיבי השריר יחידה9. יתר על כן, התהליך של תיקון sarcolemmal בעקבות שני הפוטונים לייזר ופצעו בדג זברה העוברים נראים גם בזמן אמת אין ויוו26.
במאמר זה, אנו מכינים מתודולוגיה להערכת הדינמיקה תיקון קרום התא של fibroblasts באמצעות לייזר שני הפוטונים ופצעו, למרות מתודולוגיה זו שניתן להחיל על סוגי תאים שונים לצורך לכימות קרום פלזמה חתימת יכולת במבחנה. בשיטה זו, תאים מודגרת עם FM4-64, צבע lipophilic, התא אטום אשר במהירות שזוהר כמו זה נקשר באופן שלילי טעונה פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה עם כניסתו לתא דרך ממברנה הנגע (איור 2&#38; 3)-כימות של זריחה צבע סמוכים הנגע ממברנה מאפשר ניטור הזמן שלוקח את קרום התא לחתום מחדש את עצמו. לצורך המחשה השירות של שיטה זו, אנו משתמשים dysferlinopathy החולה fibroblasts transfected עם פלסמידים מצומדת-GFP באורך מלא dysferlin (DYSF) כדי להעריך את החילוץ של תיקון קרום התא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11320033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P53GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Serum-deprived media</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">FM 4-64 Dye</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Tyrode&#8217;s Salts Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chameleon Two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Coherent</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

עלבונות pathophysiological רבים יכולים לגרום נזק קרום התא, כאשר משולב עם פגמים מולדים תיקון קרום התא או תקינות, עלול לגרום למחלות. להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס סביב תיקון קרום התא, לפיכך, הוא מטרה חשובה להתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן המחלות הקשורות dynamics קרום התא לא מתפקדת. מחקרים רבים בתוך חוץ גופית ו ויוו להבנת קרום התא חתימת בהקשרים שונים של המחלה לנצל אבלציה לייזר שני הפוטונים כסטנדרט לקביעת תוצאות תפקודי בעקבות ניסיוני טיפולים. ב הזה assay, קרום התא הם נתון ופצעו עם לייזר שני הפוטונים, הגורמת קרום התא ועד לשתל הפלורסנט לחדור לתא. ניתן לנטר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך התא ואז לכמת את היכולת של התא לאטום מחדש את עצמו. ישנן מספר שיטות חלופיות להערכת קרום התא בתגובה לפציעה, כמו גם וריאציה נהדרת הלייזר שני הפוטונים ופצעו את הגישה עצמה, לכן, מודל אחד, מאוחד של התא ופצעו ישרת לטובה כדי להקטין וריאציה בין אלה מתודולוגיות. במאמר זה, אנו מכינים לייזר שני הפוטונים פשוטה ופצעו את פרוטוקול להערכת קרום התא תיקון במבחנה בשני בריא וב פיברובלסט החולה dysferlinopathy תאים transfected עם או בלי פלסמיד dysferlin באורך מלא.

Fibroblasts אנושי בריא fibroblasts החולה dysferlinopathy שאינם מטופלים, החולה fibroblasts transfected עם פלסמיד המכיל רצף באורך מלא dysferlin היו נתונים שני הפוטונים לייזר ופצעו להעריך ממברנה חתימת יכולת בזמן אמת. פיברובלסטים אנושי בריא מוצגים רמות נמוכות של הפעלת פלורסצנטיות FM 4-64 בעקבות לייזר ופצעו. שא...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope at JoVE.com

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry. קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Video: Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease severity in patients with autoimmune pulmonary alveolar proteinosis (PAP)1-3. As abrogation of GM-CSF bioactivity in the lung is the likely cause for autoimmune PAP4,5, it is promising to measure the neutralizing capacity of GM-CSF autoantibodies for evaluating the disease severity in each patient with PAP.
Until now, neutralizing capacity of GM-CSF autoantibodies has been assessed by evaluating the growth inhibition of human bone marrow cells or TF-1 cells stimulated with GM-CSF6-8. In the bioassay system, however, it is often problematic to obtain reliable data as well as to compare the data from different laboratories, due to the technical difficulties in maintaining the cells in a constant condition.
OBJECTIVE: To mimic GM-CSF binding to GM-CSF receptor on the cell surface using cell-free receptor-binding-assay.
METHODS: Transgenic silkworm technology was applied for obtaining a large amount for recombinant soluble GM-CSF receptor alpha (sGMR&alpha;) with high purity9-13. The recombinant sGMR&alpha; was contained in the hydrophilic sericin layers of silk threads without being fused to the silk proteins, and thus, we can easily extract from the cocoons in good purity with neutral aqueous solutions14,15. Fortunately, the oligosaccharide structures, which are critical for binding with GM-CSF, are more similar to the structures of human sGMR&alpha; than those produced by other insects or yeasts.
RESULTS: The cell-free assay system using sGMR&alpha; yielded the data with high plasticity and reliability. GM-CSF binding to sGMR&alpha; was dose-dependently inhibited by polyclonal GM-CSF autoantibody in a similar manner to the bioassay using TF-1 cells, indicating that our new cell-free assay system using sGMR&alpha; is more useful for the measurement of neutralizing activity of GM-CSF autoantibodies than the bioassay system using TF-1 cell or human bone marrow cells.
CONCLUSIONS: We established a cell-free assay quantifying the neutralizing capacity of GM-CSF autoantibody.

We designed a cell-free receptor binding assay in order to estimate the binding of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) to the receptors. It enables us to evaluate competitive inhibition of biotinylated GM-CSF binding to soluble GM-CSF receptor alpha by GM-CSF autoantibody with excellent reproducibility.

Assay חינם Cell מערכת הערכת קיבולת נטרול של נוגדן GM-CSF באמצעות קולטן מסיס רקומביננטי GM-CSF

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

אינדוקציה של מחלת שתל נגד מארח ו<em&gt; In Vivo</em&gt; ניטור תא T תוך שימוש במודל Murine MHC התאמה

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact cellular functions, including energetics and signal transductions. While both fluorescent and electrophysiological methods, including electrode usage and patch-clamping, have been well developed for measuring these events in eukaryotic cells, methodology for measuring similar events in microorganisms have proven more challenging to develop given their small size in combination with the more complex outer surface of bacteria shielding the membrane. During our studies of death-initiation in Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), we wanted to elucidate the role of membrane events, including changes in polarity, integrity, and intracellular ion concentrations. Searching the literature, we found that very few studies exist. Other investigators had monitored radioisotope uptake or equilibrium to measure ion fluxes and membrane potential and a limited number of studies, mostly in Gram-negative organisms, had seen some success using carbocyanine or oxonol fluorescent dyes to measure membrane potential, or loading bacteria with cell-permeant acetoxymethyl (AM) ester versions of ion-sensitive fluorescent indicator dyes. We therefore established and optimized protocols for measuring membrane potential, rupture, and ion-transport in the Gram-positive organism S. pneumoniae. We developed protocols using the bis-oxonol dye DiBAC4(3) and the cell-impermeant dye propidium iodide to measure membrane depolarization and rupture, respectively, as well as methods to optimally load the pneumococci with the AM esters of the ratiometric dyes Fura-2, PBFI, and BCECF to detect changes in intracellular concentrations of Ca2+, K+, and H+, respectively, using a fluorescence-detection plate reader. These protocols are the first of their kind for the pneumococcus and the majority of these dyes have not been used in any other bacterial species. Though our protocols have been optimized for S. pneumoniae, we believe these approaches should form an excellent starting-point for similar studies in other bacterial species.

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Unlike that seen for eukaryotes, there is a paucity of studies that detail membrane depolarization and ion concentration changes in bacteria, primarily as their small size makes conventional methods of measurement difficult. Here, we detail protocols for monitoring such events in the significant Gram-positive pathogen Streptococcus pneumoniae utilizing fluorescence techniques.

ניטור שינויים בממברנה קוטביות, ממברנה יושרה, וריכוזי יון תאיים ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; שימוש צבעי ניאון

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

הערכת קונפורמציה של HIV-1 trimeric מעטפת גליקופרוטאינים שימוש ELISA Assay מבוסס Cell

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

אין ויוו Assay גילוי של הפונקציה Cytolytic תא T אנטיגן ספציפי באמצעות מודל החיסון

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...