Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלברטה הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים, חברים של גארט קאמינג מחקר יו ר הקרן, קרן כיסא של מחקרים המדע של HM Toupin נוירולוגיות, ניוון שרירים קנדה, קנדה קרן עבור חדשנות (CFI), אלברטה מתקדם החינוך והטכנולוגיה (הארכה), קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR), המסע של ג'סי - הקרן ג'ין, טיפול בתאי, הנשים, הילדים הבריאות מכון המחקר (WCHRI), ומחדש אלברטה פתרונות בריאות (AIHS ).
ברצוננו להודות ד ר סטיבן לאוול לספק לנו פלסמיד dysferlin באורך מלא. אנחנו רוצים גם תודה ד ר קצויה מיאקי עצות טכניות.

תאי פיברובלסט האנושי השתמשו במחקר זה נעשה שימוש באישור ועדת האתיקה האנושית של הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים באוניברסיטת אלברטה.
1. תרביות תאים תאים עם פלסמיד DYSF באורך מלא
<ol>
	<li>התרבות תאי פיברובלסט בבקבוקון T225 המכיל 40 מ של צמיחה מדיה - בינוני נשר שונה (DMEM) של 36 מ"ל Dulbecco, 4 מיליליטר סרום שור עוברית (FBS) ו 20 µL של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) - ב חממה2 CO ב 37 º C. הערה: התאים צריכים להיות בתרבית עד כ 70-80% confluency, אסור להפוך confluent לחלוטין.</li>
	<li>כדי להתכונן זריעת תאי, לשטוף את התאים 40 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) פעמיים ולאחר מכן הוסף 5 מ של 0.05% טריפסין כדי לנתק את התאים. להחזיר התאים 37 ° C CO2 מגשים, דגירה התאים במשך 5 דקות.<ol>
		<li>כאשר התאים מנותק לחלוטין, להוסיף 40 מ"ל של צמיחה מדיה כדי לעצור את התגובה טריפסין.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer או תא אחר ספירת ההתקנים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>זרע 2 מ"ל של תאים-עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל 35 מ מ מצופה קולגן זכוכית-התחתון מנות. דגירה בין לילה בתאים חממה2 CO ב 37 º C. הערה: תאים צריך להיות כ- 50-60% confluent למחרת.</li>
	<li>מסיר את המדיה צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של הפרעות-סרום התקשורת (מדיה צמיחה בלי FBS).</li>
	<li>Transfect התאים עם פלסמיד באורך מלא dysferlin באמצעות lipotransfection.<ol>
		<li>להכין µL 150 של הפרעות-סרום מדיה צינור 1.5 mL (שפופרת אחת עבור כל מנה להיות transfected).</li>
		<li>להוסיף 3 µL של תרביות תאים ריאגנט כל שפופרת 1.5 mL המכיל הפרעות-סרום מדיה. דגירה זה לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בשפופרת mL 1.5 נפרדת, מוסיפים µL 175 של מדיה הפרעות-סרום µg 3.5 של פלסמיד ה-DNA. הערה: להכפיל את הכמויות הנ עבור כל מנה נוספת להיות transfected.</li>
		<li>לשלב 150 µL של המדיה המכילה פלסמיד DNA לתוך צינור עם 150 µL הפרעות-סרום ומדיה ריאגנט תרביות תאים. תקופת דגירה זה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>פזר באופן שווה 300 µL של התקשורת עם ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים על-פני המנה. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב חממה2 CO ב 37 º C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>החלף את המדיה צמיחה טריים המדיה המכילה סרום, תקופת דגירה זה של h 24 נוספים ב חממה2 CO ב 37 º C.</li>
</ol>
2. הכנה של תאים assay ופצעו שני הפוטונים
<ol>
	<li>להסיר כלי התקשורת על-ידי pipetting, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode טריים המכילים µL 1 של 2.5 מ מ FM צבע 4-64. הערה: הריכוז הסופי של FM 4-64 צבען הוא 2.5 מיקרומטר.</li>
	<li>אם הערכה של תיקון קרום בסביבה מדולדל סידן רצוי, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל 1 מ מ EGTA. הערה: כפי PBS יגרמו התאים לנתק לאורך זמן, וזמינותו wounding צריך להשלים מהר ככל האפשר.</li>
</ol>
3. שני הפוטונים לייזר assay ופצעו
<ol>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה והתוכנה התוכנית המשויכת אליו, ליצור מטרה מיקרומטר 0.2 µm x 2 והנח אותו בקצה של קרום התא כך קו המטרה חופף הוא בניצב לכיוון קרום התא (איור 2).</li>
	<li>משתמשים בלייזר הנה 543-nm לרגש FM לצבוע אות ולקבוע טווח זיהוי עבור 600-760 ננומטר. השתמש לייזר ארגון 488 ננומטר לרגש GFP אות (איור 4) ולקבוע טווח זיהוי עבור 500-550 ננומטר.<ol>
		<li>צור סידרה זמן 5 דקות של סריקות תמונה רציפה, הדמיה תאים כל 5 s.</li>
		<li>ליצירת פצע ממברנה, אקונומיקה התאים באמצעות לייזר שני הפוטונים מוגדר כ- 820-nm, באמצעות 15% לייזר כוח עם 10 חזרות, אקונומיקה תאים 25 s לאחר תחילת סדרת הזמן.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כדי לכמת FM 4-64 לצבוע פלורסצנטיות, להשתמש בתוכנה לצייר אזור מיקרומטר מיקרומטר x 6 6 עניין (ROI) ואת למקם אותו סמוך אל המיקום wounding, בתוך התא (איור 3). הערה: להימנע דגימה תחומי פיקסל oversaturation באמצעות הפונקציה "טווח מחוון" בתוכנה - ביישום זה, הפיקסלים האדומים מייצגים פיקסלים רווי. לייצא ערכים פלורסצנטיות גולמיים לתוך גיליון אלקטרוני אלקטרונית של לשם ניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>לחשב פלורסצנטיות יחסי ערכים עבור כל נקודת זמן על-ידי חיסור הערך רקע (זריחה אומר ערך של timepoints לפני ממברנה ופצעו) ואת חלוקת העלייה נטו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הערך ב- t = 0 (איור 5, 6) .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo.">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Repair:+Mechanisms+and+Pathophysiology.">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li><li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+free+Ca2++and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells.">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li><li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair.">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage.">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li><li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury.">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li><li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi/beige+cells.">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li><li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses.">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos:+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo.">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair.">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li><li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy.">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li><li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li><li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שני הפוטונים לייזר פציעתו של קרום התא הוא טכניקה מדויק ופסיביות להערכת את הדינמיקה של קרום חתימה מחדש בתוך חוץ גופית. במאמר זה, אנו המתואר פרוטוקול לקביעת קרום התא חתימת יכולת בתאי החולה dysferlinopathy באמצעות הלייזר שני הפוטונים ופצעו וזמינותו. התוצאות שלנו להראות כי dysferlinopathy החולה תאים פ?...

קרום התא של התאים האיקריוטים מורכב שכבה כפולה של פוספוליפידים משובץ-חלבון אשר מגדיר את סביבת חוץ-על/תאי "אינטרה" של התא היא חיונית לשמירה על הישרדות הומאוסטזיס ותא הסלולר. קרום התא פציעות הנובעות עלבונות כימי או מכני הם דבר שבשגרה בסוגים בתרבית של תאים שונים, לרבות שלד, שריר הלב, הקיבה והריאות תאים1,2,3,4. בנוסף פציעות הסוגר יומי תפקיד פיזיולוגי, קרום התא יכול גם להיות נפגע על ידי עלבונות סביבתיים רעלים חיידקי, פגיעה reperfusion איסכמי5. כישלון כדי לחתום מחדש יתבקע קרום התא מוביל תזרים ללא פיקוח של חוץ-תאית Ca2 +- יחד עם רכיבים אחרים חוץ-תאית רעיל - לתוך התא, מפעילה cascades האות במורד הזרם, אשר עלולה לגרום במהירות בתא מוות1,4,5,6.
עד כה, היו מספר דגמים המוצע לתיקון ממברנה בתאים. אולי ניתן להפעיל מנגנוני תיקון שונים תלוי בגודל אופי העלתה קרום. כך למשל, הוא הציע כי קרום התא עשויים לנצל זרימת לרוחב או חלבון סתימת לתקן שיבושים קטנים (&#60; 1 ננומטר). המודל פיוז'ן לרוחב מציעה כי קרום יתבקע במהירות לתיקון דרך גיוס לרוחב של המכילות dysferlin ממברנה7, ואילו החלבון סתימת דגם מרמז כי נקבים קטנים הם לתיקון דרך הצטברויות של חלבון (בעיקר annexins) 8. לעומת זאת, לעורר נגעים ממברנה גדולות Ca2 +-שלפוחית התלויים, בתיווך dysferlin פיוז'ן ועל היווצרות טלאי תיקון. במודל טלאי תיקון, Ca2 + הזרימה המהירה לתוך התא מפעילה הגיוס של חלבונים מרובים (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ו EDH חלבונים) אשר ליצור מתחם או "תיקון", יחד עם שילוב של שלפוחית תאיים או lysosomes באתר של הממברנה גורם נזק4,9,10,11,12. חשוב לשים לב כי מודלים אלה אינם בהכרח סותרים, אולי לעבוד ביחד כדי להקל על תיקון קרום. כשל לחתום כראוי נזק קרום התא משויך מספר מצבי מחלה, כולל ניוון שרירים (dysferlinopathy - כולל מיושי מיופתיה, חגורת הגפיים-ניוון שרירים מסוג IIB, מיופתיה דיסטלי עם תחילת הטיביאלי הקדמי) 13, קרדיומיופתיה14ו- Chediak-היגאשי תסמונת (CHS)15.
נתון זה שלמות קרום התא המתאים וחתימה מחזות תפקיד כה חשוב על בריאות ומחלה, הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המולקולריים הבסיסית של תיקון קרום התא יהיה מועיל בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות. לכן,, יש להחזיק טכניקות ניסיוני המתאים כדי לפקח על קינטיקה, להעריך את היכולת של תיקון קרום התא. מספר במבחנה שיטות לסימולציה תיקון קרום עוצבו. אסטרטגיה אחת כרוכה פגיעה מכנית, אשר ניתן להקל באמצעות תא גירוד עם תער/להב פיפטה/כירורגי או על ידי גלגול חרוזי זכוכית על תאי ה-16. עם זאת, סוג זה של פציעה מכני יוצר נגעים גדולים ויוצרת רמה גבוהה של וריאציה תא לפציעה, הן בתוך והן בין תרבויות.
שיטה נוספת של יצירת פצעים ממברנה היא אבלציה לייזר על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. בניגוד לייזר מסורתיות מיקרוסקופיה קונפוקלית מעסיקה עירור פוטון יחיד, הלייזר שני הפוטונים משתמשת בו זמנית שני פוטונים ארוך באורך הגל, אנרגיה נמוכה כדי להקל את עירור של אלקטרון בעל אנרגיה גבוהה17. תהליך ליניארי זה יוצר עירור אך ורק בתוך המטוס מוקד וגם לא לאורך כל הנתיב אור17 (איור 1). זה מופחת עירור העוצמה מסייעת למזער את נזקי כאשר הדמיה תאים חיים18,19. חוקרים ולכן מסוגלים לייצר נגעים מדויקת קרום התא וחתימה צג ממברנה בזמן אמת באמצעות צבעי פלורסנט ו התבוננות שינויים בעוצמת פלורסצנטיות כמו קרום התא יתבקע ולאחר מכן החתימות מחדש.
בגישה זו נעשה שימוש שוב ושוב ללמוד ממברנה ופצעו בתוך חוץ גופית ו ויוו וסוגי בתא מספר20,21. לדוגמה, ממברנה לתקן פגמים fibroblasts, myotubes נגזר dysferlinopathy חולים היו העריך באמצעות טכניקה זו,22,23. כמו כן, סיבי שריר בודד מבודד עכברים שימשו כדי לפקח על תיקון תיקון היווצרות13,24,25. התנועה של חלבונים מתויגות fluorescently יכול גם להיות שנצפו במהלך תיקון קרום סיבי השריר יחידה9. יתר על כן, התהליך של תיקון sarcolemmal בעקבות שני הפוטונים לייזר ופצעו בדג זברה העוברים נראים גם בזמן אמת אין ויוו26.
במאמר זה, אנו מכינים מתודולוגיה להערכת הדינמיקה תיקון קרום התא של fibroblasts באמצעות לייזר שני הפוטונים ופצעו, למרות מתודולוגיה זו שניתן להחיל על סוגי תאים שונים לצורך לכימות קרום פלזמה חתימת יכולת במבחנה. בשיטה זו, תאים מודגרת עם FM4-64, צבע lipophilic, התא אטום אשר במהירות שזוהר כמו זה נקשר באופן שלילי טעונה פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה עם כניסתו לתא דרך ממברנה הנגע (איור 2&#38; 3)-כימות של זריחה צבע סמוכים הנגע ממברנה מאפשר ניטור הזמן שלוקח את קרום התא לחתום מחדש את עצמו. לצורך המחשה השירות של שיטה זו, אנו משתמשים dysferlinopathy החולה fibroblasts transfected עם פלסמידים מצומדת-GFP באורך מלא dysferlin (DYSF) כדי להעריך את החילוץ של תיקון קרום התא.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Serum-deprived media</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s Salts Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Two-photon laser</td><td>Coherent</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

עלבונות pathophysiological רבים יכולים לגרום נזק קרום התא, כאשר משולב עם פגמים מולדים תיקון קרום התא או תקינות, עלול לגרום למחלות. להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס סביב תיקון קרום התא, לפיכך, הוא מטרה חשובה להתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן המחלות הקשורות dynamics קרום התא לא מתפקדת. מחקרים רבים בתוך חוץ גופית ו ויוו להבנת קרום התא חתימת בהקשרים שונים של המחלה לנצל אבלציה לייזר שני הפוטונים כסטנדרט לקביעת תוצאות תפקודי בעקבות ניסיוני טיפולים. ב הזה assay, קרום התא הם נתון ופצעו עם לייזר שני הפוטונים, הגורמת קרום התא ועד לשתל הפלורסנט לחדור לתא. ניתן לנטר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך התא ואז לכמת את היכולת של התא לאטום מחדש את עצמו. ישנן מספר שיטות חלופיות להערכת קרום התא בתגובה לפציעה, כמו גם וריאציה נהדרת הלייזר שני הפוטונים ופצעו את הגישה עצמה, לכן, מודל אחד, מאוחד של התא ופצעו ישרת לטובה כדי להקטין וריאציה בין אלה מתודולוגיות. במאמר זה, אנו מכינים לייזר שני הפוטונים פשוטה ופצעו את פרוטוקול להערכת קרום התא תיקון במבחנה בשני בריא וב פיברובלסט החולה dysferlinopathy תאים transfected עם או בלי פלסמיד dysferlin באורך מלא.

Fibroblasts אנושי בריא fibroblasts החולה dysferlinopathy שאינם מטופלים, החולה fibroblasts transfected עם פלסמיד המכיל רצף באורך מלא dysferlin היו נתונים שני הפוטונים לייזר ופצעו להעריך ממברנה חתימת יכולת בזמן אמת. פיברובלסטים אנושי בריא מוצגים רמות נמוכות של הפעלת פלורסצנטיות FM 4-64 בעקבות לייזר ופצעו. שא...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope at JoVE.com

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K Views.  University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry. קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Video: Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

Cancer Research

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Genetics

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Biology

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ&quot;א

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

ניקוב תרמופלסמוני המושרה בלייזר לחקר תיקון קרום פלזמה

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. To prevent damage to the membrane, cells have developed efficient plasma membrane repair mechanisms. These&#160;repair mechanisms can be studied by combining confocal microscopy and nanoscale thermoplasmonics to identify and investigate the role of key proteins, such as annexins, involved in surface repair in living cells and membrane model systems.
The puncturing method employs a laser to induce highly localized heating upon nanoparticle irradiation. The use of near-infrared light minimizes phototoxicity in the biological sample, while the majority of the absorption takes place in the near-infrared resonant plasmonic nanoparticle. This thermoplasmonic method has been exploited for potential photothermal and biophysical research to enhance the understanding of intracellular mechanisms and cellular responses through vesicle and cell fusion studies. The approach has shown to be complementary to existing methods for membrane disruption, such as mechanically, chemically, or optically induced injuries, and provides a high level of control by inflicting extremely localized injuries. The extent of the injury is limited to the vicinity of the spherical nanoparticle, and no detrimental damage occurs along the beam path as opposed to pulsed lasers using different wavelengths. Despite certain limitations, such as the formation of nanobubbles, the thermoplasmonic method offers a unique tool for investigating cellular responses in plasma membrane repair in an almost native environment without compromising cell viability.
When integrated with confocal microscopy, the puncturing method can provide a mechanistic understanding of membrane dynamics in model membrane systems as well as quantitative information on protein responses to membrane damage, including protein recruitment and their biophysical function. Overall, the application of this method to reduced model systems can enhance our understanding of the intricate plasma membrane repair machinery in living cells.

מחבר זרקור: חקר מנגנוני תיקון קרום פלזמה עם ניקוב תרמופלסמוני חדשני 

The thermoplasmonic puncture method integrates confocal microscopy, optical tweezers, and gold nanoparticles to study protein responses during plasma membrane repair in cells and giant unilamellar vesicles. The technique enables rapid and localized membrane puncture, allowing the identification of key proteins and their functional roles in the intricate plasma membrane repair machinery.

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל