Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
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이 작품은 의학 및 치과,이 친구의 개렛 Cumming 연구의 자 기금, HM Toupin 신경 과학 연구의 자 기금, 근 위축 증 캐나다, 캐나다 재단의 앨버타의 대학 교수진에 의해 혁신 (CFI) 지원 되었다 앨버타 고급 교육 및 기술 (AET), 건강 연구 (CIHR), 제시의 여행-유전자 및 세포 치료, 여성 및 아동 건강 연구소 (WCHRI)에 대 한 재단의 캐나다 학회 및 앨버타 혁신적인 건강 솔루션 (AIHS ).
우리는 박사 스티븐 발 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 함께 우리를 공급 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 기술 조언을 박사 가쓰야 미 야 케를 감사 하 고 싶습니다.

이 연구에 사용 된 인간 섬유 아 세포 세포는의 학부와 앨버타의 대학에 치과의 인간의 윤리 위원회에서 승인 된 사용 되었다.
1. 전체 길이 DYSF 플라스 미드를 가진 세포의 transfection
<ol>
	<li>문화 fibroblast 세포 성장 미디어-36 mL Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS)의 4 mL와 20 µ L의 페니실린/스 (P/S)-37 ° c.에 CO2 배양 기에서의 40 mL를 포함 하는 T225 플라스 크에 참고: 셀 약 70-80 %confluency 경작 해야 하 고 완전히 confluent 될 수 없다는.</li>
	<li>시드 셀 준비, 40 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 셀을 두 번, 린스 다음 셀을 분리를 0.05 %trypsin 5 mL을 추가 합니다. 2 보육 37 ° c 공동 셀을 반환 하 고 5 분에 대 한 셀을 품 어.<ol>
		<li>셀은 완벽 하 게 분리, 성장 미디어 트립 신 반응을 중지를 40 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>hemocytometer를 사용 하 여 셀 또는 다른 세포 장치를 계산 계산 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>씨앗 1 x 105 셀/mL에서 세포의 2 mL 35mm 콜라겐 코팅 유리 하단 요리도. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 하룻밤 셀을 품 어 참고: 셀 이어야 한다 약 50-60% 합칠 다음날.</li>
	<li>성장 매체를 제거 하 고 혈 청을 박탈 미디어 (FBS 없이 성장 매체)의 2 mL와 함께 그것을 대체.</li>
	<li>Lipotransfection를 사용 하 여 전체 길이 dysferlin 플라스 미드와 셀 transfect.<ol>
		<li>1.5 mL 튜브 (페 수를 각 요리에 대 한 1 개의 관)에서 혈 청을 박탈 미디어의 150 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>혈 청을 박탈 미디어를 포함 하는 각 1.5 mL 튜브에 transfection 시 약의 3 µ L를 추가 합니다. 그것은 실내 온도에 적어도 5 분 품 어.</li>
		<li>별도 1.5 mL 튜브에 175 µ L의 혈 청을 박탈 미디어와 플라스 미드 DNA의 3.5 µ g을 추가 합니다. 참고: 각 추가 요리 페 수를 위의 금액을 곱하면 됩니다.</li>
		<li>플라스 미드 DNA의 혈 청을 박탈 미디어와 transfection 시 약 150 µ L 튜브에 들어 있는 미디어의 150 µ L를 결합 한다. 실 온에서 20 분 동안 그것을 품 어.</li>
		<li>균등 하 게 플라스 미드 및 transfection 시 미디어의 300 µ L 분산 접시. 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 24 시간을 위한 요리를 품 어</li>
	</ol>
	</li>
	<li>혈 청을 포함 하는 신선한 성장 매체와 미디어를 교체 하 고 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 추가 24 h에 대 한 그것을 품 어</li>
</ol>
2. 셀 2 광자 부상 분석 결과 대 한 준비
<ol>
	<li>미디어 pipetting 및 Tyrode의 솔루션의 1 mL와 함께 한 번 셀 린스 다음 신선한 Tyrode 솔루션 포함 된 2.5 m m FM 1 µ L의 1 mL을 추가 4-64 염료. 참고: FM 4-64 염료의 최종 농도 2.5.</li>
	<li>칼슘 고갈 환경에서 막 수리의 평가, 필요한 경우 1 mL의 PBS로 세포를 씻어 하 고 1mm EGTA를 포함 하는 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 참고: PBS 시간이 지남에 따라 분리 하는 세포를 일으킬 것입니다, 부상 분석 결과 가능한 한 빨리 완료 한다.</li>
</ol>
3. 2-광자 레이저 부상 분석 결과
<ol>
	<li>거꾸로 confocal 현미경 및 관련된 프로그램 소프트웨어를 사용 하, 0.2 µ m x 2 µ m 대상 생성 하 고 대상 줄 중복 하 고 세포 막 (그림 2)의 방향에 수직인 거짓말 세포 막의 가장자리에 놓습니다.</li>
	<li>543 nm HeNe 레이저를 사용 하 여 FM 염료 신호를 자극 하 고 600-760 nm에 대 한 검색 범위를 설정. 488 nm의 아르곤 레이저를 사용 하 여 GFP 신호 (그림 4)을 자극 하 고 500-550 nm에 대 한 검색 범위를 설정.<ol>
		<li>만들기 5 분 시간 일련의 연속 이미지 검사, 세포 이미징 모든 5 s.</li>
		<li>생성 하려면 막 병 변, 820-nm, 15%를 사용 하 여 설정 2 광자 레이저를 사용 하 여 표 백제 셀 레이저 10 반복 출력 하 고 시계열의 시작 후 셀 25 s 표 백제.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>척도 FM 4-64 염료 형광, 관심 (ROI) 6 µ m x 6 µ m 영역을 그리는 부상 위치 및 셀 (그림 3) 내 인접 배치 하는 소프트웨어를 사용 합니다. 참고:이 응용 프로그램에서 소프트웨어-"범위 표시기" 기능을 사용 하 여 샘플링 영역 픽셀 oversaturation의 방지, 빨강 픽셀 포화 픽셀을 나타냅니다. 통계 분석에 대 한 전자 스프레드 시트에 원시 형광 값을 내보냅니다.</li>
	<li>배경 값 (막 부상 이전 timepoints의 평균 형광 값)을 빼서 각 시간 지점에 대 한 상대적인 형광 값을 계산 하 고 t 값 형광으로 순 증가 나누는 = 0 (그림 5, 6) .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

저자는 공개 없다.

세포 막의 2 광자 레이저 부상 resealing 에 체 외막의 역학을 평가 하기 위한 정확 하 고 다양 한 기술입니다. 이 문서에서는, 우리 세포 막 resealing 분석 결과 부상 2 광자 레이저를 사용 하 여 dysferlinopathy 환자 세포 능력을 결정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 결과 보여 dysferlinopathy 환자 세포는 세포 막 resealing, 결함이 있는 다른 연구자에 의해 연구 결과와 일치 하는 있는 추가 근?...

더블-레이어 인지질 단백질에 박 혀의 셀의 내부/세포 외 환경 정의 하 고 세포질 항상성 및 세포 생존을 유지 하기 위한 필수적 이다 진 핵 세포의 세포 막에 의하여 이루어져 있다. 세포 막 상해 기계적 또는 화학 모욕에서 발생 하는 다양 한 포유류 세포 유형에서 평범, 등 골격과 심장 근육, 위, 및 폐 세포1,2,,34. 매일 생리 기능에 따른 부상, 뿐만 아니라 세포 막도 환경 모욕, 세균 독 소, 그리고 허 혈 성 reperfusion5에 의해 손상 될 수 있습니다. 세포 막에 있는 파열을 봉인에 실패 리드의 extracellular 캘리포니아2 +-다른 잠재적으로 유독한 세포 외 구성 요소-함께 관계가 없는 유입에 셀에 셀에 신속 하 게 발생할 수 있습니다 다운스트림 신호 폭포를 트리거링 죽음1,4,,56.
날짜 하려면, 셀에 막 복구에 대 한 몇 가지 제안 된 모델 되었습니다. 다른 복구 메커니즘은 막 파열의 자연과 크기에 따라 활성화 될 수 있습니다. 예, 그것은 측면 흐름 또는 작은 중단 복구 막는 단백질 세포 막 사용할 수 제안 (&#60; 1 nm). 측면 퓨전 모델 제안 막 파열 포함 하는 dysferlin의 측면 모집을 통해 급속 하 게 고치는 막7, 모델을 막는 단백질 단백질 집계를 통해 작은 구멍 고치는 제안 하는 동안 (주로 annexins) 8. 반대로, 큰 막 병 변을 일으킬 캘리포니아2 +-의존, dysferlin 중재 소포 융해 및 수리 패치의 형성. 수리 패치 모델에서 셀으로 빠른 Ca2 + 유입 트리거 복잡 한 또는 "패치", 융합 함께 세포내 vesicles의 형성 하는 여러 단백질 (dysferlin, annexins, mitsugumin-53, 및 EDH 단백질)의 채용 또는 막의 사이트에서 리소좀 손상4,,910,,1112. 그것은이 모델 반드시 상호 배타적이 고 막 수리를 촉진 하기 위하여 연주회에서 작동 수 있습니다 해야 합니다. 세포 막 손상 제대로 봉인에 실패는 근이 영양 증 (dysferlinopathy-미요시 myopathy, 등 다리 띠 근이 영양 증 유형 IIB, 전방 tibial 발병 원심 myopathy)를 포함 하 여 여러 질병 상태와 관련 13,14, 심근 그리고 Chediak-히가시 증후군 (CHS)15.
그 적절 한 세포 막의 무결성 및 놀이 resealing 건강과 질병에 중요 한 역할 세포 막 복구의 기본 분자 메커니즘에 대 한 깊은 이해 것에 도움이 될 새로운 치료 전략에 대 한 검색. 그것은, 그러므로, 활동을 모니터링 하 고 세포 막 수리 능력 평가를 적절 한 실험 기법을 보유 하는 데 필요한입니다. 막 복구를 모델링 하기 위한 여러 가지 생체 외에서 방법은 설계 되었습니다. 한 전략 셀 된다고 피 펫/외과 블레이드/면도기를 사용 하거나 셀16유리 구슬 롤링을 통해 촉진 될 수 있는 기계적 상해를 포함 한다. 그러나, 기계적 상해의이 유형은 더 큰 병 변, 생성 하 고 셀 부상, 내와 문화 사이에서 변이의 고차를 만듭니다.
막 상처를 생성 하는 또 다른 방법은 두 광자 현미경 검사 법에 의해 레이저 절제입니다. 전통적인 레이저 confocal 현미경 검사 법 단일 광자 여기를 고용 하 고, 달리 2 광자 레이저는 동시에 고 에너지 전자17의 흥분을 촉진 하기 위하여 두 긴 파장, 저 에너지 광자를 사용 합니다. 이 아닌-선형 프로세스 여기 초점 평면 내에서 독점적으로 그리고 전체 빛 경로17 (그림 1) 따라 하지 발생합니다. 이 때 라이브 셀18,19이미징 photodamage를 최소화 하기 위해 여기 볼륨 수 감소. 연구원은 따라서 정확한 병 변 세포 막 및 모니터 막 resealing 실시간으로 세포 막 파열 그리고 reseals로 형광 강도 변화를 관찰 하 고 형광 염료를 사용 하 여 생성할 수 있습니다.
이 이렇게는 반복적으로 막 부상 생체 외에서 그리고 vivo에서 공부 하는 데 사용 되었습니다 그리고 여러 셀에20,21종류. 예를 들어 막 섬유 아 세포 및 환자가 기술을22,23을 사용 하 여 평가 했다 dysferlinopathy에서 파생 된 myotubes 결함을 복구 합니다. 또한, 마우스에서 분리 한 근육 섬유 수리 패치 형성13,,2425를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 붙일 태그가 단백질의 움직임 또한 단일 근육 섬유9막 수리 하는 동안 관찰할 수 있습니다. 또한, sarcolemmal 수리 2 광자 레이저 zebrafish 태아에 부상 다음 과정 실시간 vivo에서26에 관찰할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리는이 방법론은 원형질 막 resealing 능력 측정을 위해 다양 한 셀 형식에 적용 될 수 있지만 두 광자 레이저 부상를 사용 하 여 섬유 아 세포의 세포 막 수리 역학을 평가 하기 위한 방법론 개요 생체 외에서. 이 방법에서는, 세포는 인 큐베이 팅 FM4-64, 신속 하 게 그것을 부정적으로 결속으로 fluoresces 닥터지, 셀 스며들 지 않는 염료 충전 막 병 변 통해 셀 입력 시 세포질 내에서 인지질 (그림 2&#38; 3). 염료 형광 막 병 변에 인접 한의 정량화 세포 막 자체를 봉인 하는 데 걸리는 시간을 모니터링 하기 위한 수 있습니다. 이 방법의 유틸리티를 예증 하 사용 dysferlinopathy 환자 fibroblasts GFP 활용 전체 길이 dysferlin (DYSF) 플라스 미드와 페 세포 막 복구의 구조를 평가 합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Serum-deprived media</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 Dye</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode&amp;rsquo;s Salts Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laser scanning microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Two-photon laser</td><td>Coherent</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

수많은 pathophysiological 모욕 세포 막에 손상을 줄 수 있다 그리고, 세포 막 복구 또는 무결성, 타고 난 결점과 결합 될 때 질병 귀 착될 수 있다. 세포 막 복구를 둘러싼 근본적인 분자 메커니즘 이해은, 그러므로, 세포 막 기능 장애 역학과 관련 된 질병에 대 한 새로운 치료 전략의 개발에 중요 한 목표. 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 이해 하는 다양 한 질병 상황에서 세포 막 resealing 겨냥 실험적 치료를 수행 하는 기능 결과 결정 하기 위한 표준으로 2 광자 레이저 절제를 사용 합니다. 이 분석 결과, 세포 막 세포 막 파열 및 형광 염료는 세포에 침투 하면 2 광자 레이저로 부상 대상이 됩니다. 셀 내에 형광의 강도 다음 자체를 봉인 하는 셀의 능력 척도를 모니터링할 수 있습니다. 세포 막 응답 부상, 뿐만 아니라 접근 자체를 부상 2 광자 레이저에 큰 변화를 평가 하기 위한 여러 다른 방법이 있다, 그러므로, 셀 부상의 통합 모델 것 군인이 감소 하는 이러한 방법론 사이 변화. 이 문서에서는, 우리는 간단한 2 광자 레이저 부상 세포 막 수리에서 생체 외에서 둘 다 건강에 고 dysferlinopathy 환자 fibroblast 세포 페 전체 길이 dysferlin 플라스 미드의 유무에 관계 없이 평가 하기 위한 프로토콜 개요.

건강 한 인간의 섬유 아 세포, 비 치료 dysferlinopathy 환자의 섬유 아 세포 및 환자 fibroblasts 전체 길이 dysferlin 시퀀스 2 광자 레이저 부상 능력 resealing 막 평가 대상이 됐다을 포함 하는 플라스 미드와 페 진짜 시간에서. 건강 한 인간의 fibroblast 세포 표시 레이저 부상 다음 FM 4-64 형광 활성화의 낮은 수준 및 비 치료 환자 fibroblasts 전시 상대 형광 강도 상해 다음의 높은 수준의 ...

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Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.3K 조회수.  University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry. 두 광자 레이저를 통해 세포 막 부상 막 resealing 능력을 평가 하기 위한 널리 사용 되는 방법 이며, 여러 개의 셀 형식에 적용할 수 있습니다. 여기, 우리가 시험관에서 라이브 이미징 막 resealing dysferlinopathy 환자 셀 다음 2 광자 레이저 절제에에서의 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular biology techniques have clarified structure, enzymatic functions, and kinetics of repair proteins, there is still a need to understand how repair is coordinated within the nucleus. Laser micro-irradiation offers a powerful tool for inducing DNA damage and monitoring the recruitment of repair proteins. Induction of DNA damage by laser micro-irradiation can occur with a range of wavelengths, and users can reliably induce single strand breaks, base lesions and double strand breaks with a range of doses. Here, laser micro-irradiation is used to examine repair of single and double strand breaks induced by two common confocal laser wavelengths, 355 nm and 405 nm. Further, proper characterization of the applied laser dose for inducing specific damage mixtures is described, so users can reproducibly perform laser micro-irradiation data acquisition and analysis.

Confocal fluorescence microscopy and laser micro-irradiation offer tools for inducing DNA damage and monitoring the response of DNA repair proteins in selected sub-nuclear areas. This technique has significantly advanced our knowledge of damage detection, signaling, and recruitment. This manuscript demonstrates these technologies to examine single and double strand break repair.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

Highly coordinated DNA repair pathways exist to detect, excise and replace damaged DNA bases, and coordinate repair of DNA strand breaks. While molecular ...

연구

암 연구학

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

유전학

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

생물학

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

면역학 및 감염병학

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup&gt; 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에&gt;와 Sphingomyelinase

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Plasma Membrane Repair 연구를 위한 레이저 유도 열플라즈몬 천자

A Thermoplasmonic Approach for Investigating Plasma Membrane Repair in Living Cells and Model Membranes

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. To prevent damage to the membrane, cells have developed efficient plasma membrane repair mechanisms. These&#160;repair mechanisms can be studied by combining confocal microscopy and nanoscale thermoplasmonics to identify and investigate the role of key proteins, such as annexins, involved in surface repair in living cells and membrane model systems.
The puncturing method employs a laser to induce highly localized heating upon nanoparticle irradiation. The use of near-infrared light minimizes phototoxicity in the biological sample, while the majority of the absorption takes place in the near-infrared resonant plasmonic nanoparticle. This thermoplasmonic method has been exploited for potential photothermal and biophysical research to enhance the understanding of intracellular mechanisms and cellular responses through vesicle and cell fusion studies. The approach has shown to be complementary to existing methods for membrane disruption, such as mechanically, chemically, or optically induced injuries, and provides a high level of control by inflicting extremely localized injuries. The extent of the injury is limited to the vicinity of the spherical nanoparticle, and no detrimental damage occurs along the beam path as opposed to pulsed lasers using different wavelengths. Despite certain limitations, such as the formation of nanobubbles, the thermoplasmonic method offers a unique tool for investigating cellular responses in plasma membrane repair in an almost native environment without compromising cell viability.
When integrated with confocal microscopy, the puncturing method can provide a mechanistic understanding of membrane dynamics in model membrane systems as well as quantitative information on protein responses to membrane damage, including protein recruitment and their biophysical function. Overall, the application of this method to reduced model systems can enhance our understanding of the intricate plasma membrane repair machinery in living cells.

저자 스포트라이트: 혁신적인 열플라즈모닉 천공을 통한 원형질막 복구 메커니즘 탐구 

The thermoplasmonic puncture method integrates confocal microscopy, optical tweezers, and gold nanoparticles to study protein responses during plasma membrane repair in cells and giant unilamellar vesicles. The technique enables rapid and localized membrane puncture, allowing the identification of key proteins and their functional roles in the intricate plasma membrane repair machinery.

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

The cell membrane is crucial for cell survival, and ensuring its integrity is essential as the cell experiences injuries throughout its entire life cycle. ...

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

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단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

사용 MG53 - 중재 세포막 수리의 시각화 생체내에과 체외에서 시스템

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브

이미징 세포 막 상해 및 수리에 관여하는 세포 내 프로세스

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법

살아있는 세포 및 모델 막의 원형질막 복구를 조사하기 위한 열플라즈몬 접근법