שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ארכיטקטורת הכרומטין כגון כיצד המבנה 3D של כרומטין יכול להשפיע על ביטוי גנים ופיתוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תצוגה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת כרומטין ועוברים זבוב מבוים במדויק. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך ארגון כרומטין ופיתוח, אפשר גם להשתמש בקווים קיימים מספריות זבוב מהודק כדי לבדוק את השפעתם בארגון כרומטין.
כדי להתחיל את הפרוטוקול, התאם את הנפח הכולל של עוברים שנאספו בעבר לשני מיליליטר עם PBST. הוסיפו שישה מיליליטר של הפטאן ו-100 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד במים. לאחר הוספת פורמלדהיד, לנער במרץ את הצינור למעלה ולמטה במשך דקה אחת.
השלב הממימי וה האורגני ישתלב כדי ליצור עקביות דמוית שמפו. להתסיס את התערובת על מערבל סיבובי במשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאסוף עוברים בתחתית הצינור.
שאפו את כל הנוזל דמוי השמפו והשליכו אותו, ודאגו לא לשאף עוברים. 15 דקות לאחר הוספת פורמלדהיד, להשתמש מחדש את העוברים בחמישה מיליליטר של PBST עם 125 מילימולר גליצין. לנער את העוברים למעלה ולמטה במרץ במשך דקה אחת.
לאחר צנטריפוגה, שאף את העל-טבעי. באמצעות פיקט 1,000 מיקרוליטר, להעביר קבוצה של 100 עוברים לכלי זכוכית קטן מתאים למיון, רצוי על רקע כהה למקם אותו על קרח. מיין עוברים לפי צפיפות גרעינית ומעמד מחזור התא באמצעות מחט או קצה מזרק.
הסר את כל העוברים המיטוטיים הניתנים לזיהוי על ידי ההפצה המפוזרת שלהם, הלא גרעינית של EGFP PCNA ועוברים שמבינים חלקית אות GFP לא גרעיני. כדי לסייע במיון, יש לסדר את עוברי הייחוס במחזורים הגרעיניים 12, 13 ו-14 בכל אצווה כדי להתאים עוברים לאחד העוברים המוזכרים. פיפטה את העוברים הרצויים באמצעות פיפסת 1,000 מיקרוליטר.
מעבירים אותם לצינור טרי ומ מניחים אותם על קרח. המשך עד שיימוינו מספיק עוברים לניסוי המתוכנן. צינורות ספין לזמן קצר ב 100 פעמים g בטמפרטורת החדר.
מוציאים את העל-טבעי ומבטיחים שהעוברים יבשים ככל האפשר להקפאה. פלאש להקפיא עוברים על ידי שקוע הצינורות בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות עם עוברים קפואים על קרח.
תן לעוברים 500 מיקרוליטרים של חיץ תזה קרה כקרח. המתן דקה אחת כדי לאפשר לעובר להתיישב בתחתית הצינור. לאחר מכן, טוחנים את העוברים עם עלה מיקרו מתכת מקורר מראש על קרח שנועד להתאים בחוזקה צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
כדי למנוע תסיסה העוברים, להכניס את העלי לאט עד שהוא נוגע בחלק התחתון של הצינור. לדחוף למטה ולאחר מכן לטחון על ידי סיבוב העלי פעמיים בשני הכיוונים. הרם את העלי מעט מאוד.
לדחוף לתחתית הצינור שוב ולחזור על הליך שחיקה 10 פעמים או עד העוברים הם lysed לחלוטין. הפתרון צריך להיות הומוגני ולא שאריות חתיכות גדולות של עוברים צריך להישאר. להדגירה את ההשעיה הומוגנית על קרח במשך 15 דקות.
סובב ב 1,000 פעמים 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי ושטפו את גלולת הכדור על-ידי שימוש חוזר במאגר תזה קר כקרח של 500 מיקרוליטר וצנרת למעלה ולמטה. לאחר ספין נוסף, השלך את העל-טבעי.
תחוו מחדש את גלולת השטוף ב-100 מיקרוליטרים של 0.5% נתרן דודצ'ל סולפט או SDS. ואז לחלחל הגרעינים על ידי דגירה המדגם במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 10% טריטון X100 ו-120 מיקרוליטר מים.
מצליפים בצינור כדי לערבב את התוכן ולהדיר את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בבלוק חום. הוסף 25 מיקרוליטרים של מאגר אנזימים הגבלה 10X ו 20 יחידות של חמש יחידות לכל MBO1 microliter. החלק את הצינור כדי לערבב את התוכן ולהדגיר את הצינור בבלוק חום כדי לעכל את ה- DNA.
הוסף עוד 20 יחידות של MBO1. ממשיכים את הדגירה במשך 90 דקות. לאחר הדגירה השנייה של 90 דקות, הדגירה את המדגם ב 62 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לא פעיל MBO1.
לאחר מכן, להוסיף 18 microliters של 0.4 מילימולרית ביוטין 14-dATP, 2.25 microliters של 3.3 מילימולרית dCTP-dGTP-dTTP לערבב, ושמונה microliters של חמש יחידות לכל שבר פולימראז DNA microliter אני Klenow. מצליפים בצינור כדי לערבב את התוכן ולהדגר את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר מכן, להוסיף 657 microliters של מים, 120 microliters של 10X T4 מאגר ליגות DNA, 100 microliters של 10% טריטון X100, שישה microliters של 20 מיליגרם לכל אלבומין סרום מיליליטר, ולבסוף חמישה microliters של חמש יחידות לכל רצועות DNA Microliter T4.
לאחר מכן, סובבו את הצינור בעדינות במהירות של 20 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. הוסף עוד חמישה מיקרוליטרים של חמש יחידות לכל רצועות דנ"א T4 מיקרוליטר. המשך להסתובב במשך שעתיים נוספות, ולאחר מכן לסובב את הגרעינים ב 2, 500 פעמים גרם במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, השלך את העל-טבעי. תוסיפו את גלולת ה-500 מיקרוליטר של חיץ החילוץ ותוסיפו 20 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K.Flick הצינור ותדקר את הצינור כדי לעכל את החלבון. מוסיפים 130 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן ודגירה בן לילה כדי לבטל crosslink.
למחרת, פיפטה המדגם לתוך צינור חדש שני מיליליטר עם מאפייני קשירה DNA נמוך. הוסף נפח 0.1X של שלושה אצטט נתרן טוחן ושני microliters של 15 מיליגרם למיליליטר GlycoBlue. מוסיפים 1.6 כרכים של אתנול מוחלט טהור והפוך את התוכן, ואז להדגיר את המדגם במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה התוכן. אתר את גלולת ה- DNA אשר ניתן לאתר רק על ידי GlycoBlue. הסר את העל-טבעי בזהירות, והזז את קצה הפיפט לתוך הצינור לאורך הקיר הנגדי מגליעת הדנ"א.
לשטוף את גלולה עם 800 microliters של 70% אתנול. מערבבים את המדגם על ידי היפוך וצנטריפוגה אותו ב 20, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. הסר טיפות שנותרו במהלך שלב זה ואת הכביסה הבאה על ידי דחיפת אותם מתוך הצינורות עם קצה P10, ולאחר מכן לפתוח את המכסה לאוויר יבש עד חמש דקות.
ברגע שאין נוזל נשאר, להוסיף 50 microliters של 10 מילימולר טריס כלוריד. שוב ושוב pipette הפתרון על האזור שבו גלולה היה ממוקם כדי לבודד את ה-DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר RNase A.Mix על ידי הפלת הצינור.
הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לעכל RNA. לבסוף, לאחסן את המדגם במקפיא או במקרר עד הכנת הספרייה. תמונות של אות PCNA EGFP של כל אצווה עובר ממוין לחשוף שלב מדויק סטטוס מחזור התא של כל עובר בודד לניסויים במורד הזרם.
עקבות Bioanalyzer מראות כי התפלגות הגודל של שברי DNA לאחר בחירת גודל היא בין 300 ל 700 זוגות בסיס עם מקסימום בסביבות 450 זוגות בסיס. מפות אינטראקציה Hi-C מראות כי במחזור הגרעיני 12, כמה תחומים או TADs הקשורים טופולוגית מזוהים אשר משתנה באופן דרמטי במחזורים גרעיניים 13 ו 14 כאשר TADs בולטים יותר ויותר ואנשי קשר ארוכי טווח לא ספציפיים מתרוקנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשטוף את חרוזים ביסודיות ולא להאריך את זמני הדגירה שלא לצורך במיוחד בטמפרטורות גבוהות מאז זה יכול להוביל ספריות באיכות נמוכה Hi-C.
טכניקה זו המשלבת בימוי מדויק ומיפוי אישור כרומטין ברזולוציה גבוהה סללו את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את תפקידו של ארגון כרומטין תלת מימדי בסביבה התפתחותית in vivo.
