The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.

1. דור קו Fly <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור שני מבנים שונים. במבנה הראשון, RpL10A cDNA (מקטע חלבון ריבוזומלי L10a) הוא משובט במורד הזרם של ה- GFP לפלסמיד pUASP-PL-GFP-Nter (שונה מגרסה 32). השימוש בתאי מין אמרגן מאפשר שימוש רב ערכי יותר של הקו המהונדס. הערה: קבל המבנה השני על ידי שיבוט רצף הרגולציה נהיגה ביטוי רקמות הספציפיות של גן נמושה במעלה הזרם של GAL4 (TF) באמצעות פלסמיד pPTGAL4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק פלסמידים בנפרד לw 1,118 זבובים והכניסו בונה לתוך הגנום הזבוב על ידי החדרת P-יסוד (על פי נוהל סטנדרטי) 33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> transformants בחר כדי לשחזר קווים לטוס עם בונה על שני כרומוזומים שונים. קו המלכודת הסופי נוצר על ידי שילוב של שתי שורות אלה (צלבים גנטיים) על מנת לקבל קו יציב כפול מהונדס אחד. F0: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב&quot;מ EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx להתראות, ביל; ארגון הנוער הקתולי / scu; נמושה Gal4 / TM6B. F1: להתראות, ביל; ארגון נוער קתולי, כטב&quot;מ EGFP :: RpL10A; נמושה Gal4 / TM6B. מסיבי להגביר את הקו הזה ולאסוף את העוברים הרצויים-מבוימים. </li></ol> אוסף 2. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 8 כלובי אוכלוסייה גלילית גדולים המכילים כ -40 גרם של זבובים צעירים לכלוב (סביב 180,000 זבובים / כלוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך עם מה שנקרא מראש Lays-המאפשר זבובים כדי לנקות עוברים מתפתחים מoviducts. לשם כך, להניח את הזבובים לשעה 1 בשני מנות 11 סנטימטר פטרי בקוטר המכילות תערובת של מיץ הענבים ואגרו הקרושה ולכסות ⅓ של פני השטח עם שמרים להדביק טרי מתוצרת. לאחר 3 חילופי ענבי צלחות מיץ לאסוף את העוברים האמיתיים על צלחות טריות דומות. הערה: זמן דגירה משתנה בהתאם לזמן-חלון התפתחותית למד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות מכלובים ולהשאיר אותם באותה הטמפרטורה לזמן הדרוש כדי להשיג שלב ההתפתחותי נכון (לדוגמא, 3 שעות של הטלת ביצים + 10 שעות של addit<html> הדגירה ional נותנת עוברים משלב 10-13 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL)). Resuspend תוכן הצלחת (עוברים, שמרי רסק, זבובים מתים) עם 50 מיליליטר של מים בעזרת מברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור סדרה של מסננות (700 מיקרומטר, 355 מיקרומטר, 112 מיקרומטר) כדי להפריד בין עוברים מזבובים מתים וחלקי גוף שנותרו ולאסוף עובר שמר על המסננת קטנה יותר בקוטר, ולאחר מכן לשטוף במים ללא יונים בקצרה. אין להשתמש יותר מ 18 צלחות לאוסף כפי שהוא יכול לסתום את מסננים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עובר dechorionate באקונומיקת 4.5% במים ללא יונים למשך 2 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים במשך 30-60 שניות. דגירה עובר בPBS Tween 0.01% 20, 100 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide, למשך 5-10 דקות ב RT תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים יבשים על גיליונות סופגים תאית ולהעביר אותם לצינורות microcentrifuge. לשקול את הצינורות ופלאש להקפיא את העוברים על ידי טבילה בחנקן נוזלי. בשלב זה, ניתן לאחסן את העוברים המיובשים במשך כמה חודשים ב -80 ° C. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. הכנת חרוזים מגנטיים מצמידים את ה- GFP הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend החלבון G חרוזים מגנטיים בבקבוק המקורי על ידי תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 90 μl של חרוזים לצינור RNase ללא ולאסוף אותם על מגנט (30-60 שניות). 90 μl של חרוזים יש צורך לבצע immunoprecipitation (IP) עם 1 מיליליטר של lysate המכיל 60-80 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​חלבונים. מכבד את היחסים כדי למנוע הרוויה חרוז. השתמש בכמה צינורות פי כמות חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם 1 × PBS 0.01% Tween (μl 500) 20 ולאסוף חרוזים על המגנט ללהשליך supernatant. הוסף 30 מיקרוגרם של נוגדן ה- GFP ב350 μl של PBS Tween 0.01% 20 לחרוזים ודגירה עם הסוף איטי לעומת סוף הערבוב במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט (30-60 שניות), להשליך supernatant ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome (Hepes 10 150 מ&quot;מ, MgCl 2 5 מ&quot;מ, 0.5 מ&quot;מ DTT, טריטון 1%, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר מ&quot;מ, KCl , Protease מעכב 1 ×, מעכב RNase 100 U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט ולהוסיף 500 μl של חיץ חסימה (BSA 0.1 מיקרוגרם / μl, שמרי tRNA 0.1 מיקרוגרם / μl, גליקוגן 0.1 מיקרוגרם / μl במאגר חילוץ polysome). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 דקות ב RT וחזור על שלב זה פעם אחת עם חיץ חסימה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט ולשטוף ב500 μl של חיץ חילוץ polysome, אז להיזכר חרוזים ולהמשיך מייד לשלב immunopurification (סעיף 6). </li></ol> 4. הכנת lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחיל, להגדיר את התכנית במטחנת חרוזים מהירות מהירה רב כיוונית: 2 × 10 שניות ב 5000 סל&quot;ד, הפסקה 15 שניות. העברת עוברים מיובשים (1.5 גר &#39;) ל- 15 מיליליטר צינורות prechilled על קרח המכיל מאגר מיצוי polysome, וhomogenize מייד. Homogenize 1.5 גרם של עוברים ב 4 מיליליטר של חיץ חילוץ polysome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי התפשטות הומוגני בשתי prechilled 2 צינורות מ&quot;ל ולטחון את אמברימערכת הפעלה על-ידי הפעלת תכנית homogenizer. העבר את lysate לתוך צינורות microcentrifuge prechilled טריים על קרח ולהכין supernatant פוסט-גרעינית ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 2000 g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור microcentrifuge prechilled טרי על קרח, להוסיף 1/100 נפח דגימה של 10% Nonidet P-40 לsupernatant (הריכוז סופי = 0.1%), ולערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דופק צנטריפוגות המדגם בminifuge לאסוף את הנוזל בחלק התחתון של הצינור, להוסיף 1/9 נפח דגימה של (ריכוז סופי 300 מ&quot;מ 1,2-Diheptanoyl-SN-Glycero-3-Phosphocholine (DHPC) = 30 מ&quot;מ ), לערבב אותו בעדינות על ידי צינור היפוך, ודגירה את התערובת על קרח למשך 5 דקות (תערובת על ידי היפוך מספר פעמים במהלך דגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את supernatant לאחר המיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 20,000 ז. למדוד ריכוז חלבון בשיטה ברדפורד: הריכוז בlysate צריך להיות בין 60-80 מ&quot;ג / מיליליטר. Tמתקין supernatant לצינור microcentrifuge טרי חדש prechilled ולהמשיך מייד לשלב טרום הקליטה (סעיף 5). </li></ol> 5. טרום קליטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend חרוזים המגנטיים על ידי תסיסה עדינה ולהעביר 30 μl של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge ב RT (30 μl של חרוזים / 1 מיליליטר lysate העוברי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חרוזים על המגנט, פיפטה את supernatant, וresuspend חרוזים במאגר polysome חילוץ (500 μl). לאסוף חרוזים על המגנט, להוסיף lysate העוברי, ודגירה עבור שעה 1 ב 4 ° C על הכתף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חרוזים ולשמור supernatant על קרח לצעד immunopurification. לפני immunopurification, לשמור של supernatant 100 μl (קלט) כדי להשוות מדגם RNA העולמי עם מדגם RNA שנאסף לאחר immunopurification, על ידי RT-qPCR למשל. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר (המקביל ל 60-80 מ&quot;ג / מיליליטר חלבון) שלטרום נקלט lysate לצינור RNase ללא מכיל 90 μl של חרוזים חסומים מצמידים את נוגדן ה- GFP. דגירה הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם ערבוב הסוף-על-סוף עדין במסובב צינור. לחלופין, לבצע O הדגירה / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לאסוף חרוזים על המגנט. השתמש בminifuge לספין למטה חרוזים, אז resuspend אותם 500 μl של חיץ לשטוף (Hepes 10mm, 350mm KCl, MgCl 2 5 מ&quot;מ, Nonidet P-40 1%, DTT 0.5 מ&quot;מ, cycloheximide 100 מיקרוגרם / מיליליטר, RNase מעכב 100 U ) ולאסוף אותם על המגנט. חזור על פעולה זו עוד פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את חרוזים לצינור RNase ללא prechilled חדש ולשטוף פעמיים. לאסוף חרוזים על מגנט ולהמשיך למיצוי RNA על ידי הוספת 1 מיליליטר Trizol ישירות לחרוזים ולעקוב אחר הוראות היצרן. </li></ol> 7. RNA ניקוי והערכת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בערכת RNeasy מיקרו לפי הוראות היצרן. בסיום, elutRNA דואר עם (x) μl מים RNase חינם. חם למשך 2 דקות ב 60 ° C, וחנות snap-קפוא דגימות ב -80 ° C. לבדוק את איכות RNA באמצעות bioanalyzer (אחרי הוראות היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את הספציפיות של RNA TRAPed, לבצע שעתוק לאחור על 3 ננוגרם של RNA המטוהר (קלט ו- IP) על פי הוראות היצרן (עילי III). השתמש בcDNA שהתקבל עבור qPCR באמצעות ערכות פריימר גן ספציפי. </li></ol>

<ol>
	<li>Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).</li><li>Maier, T., Guell, M., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+mRNA+and+protein+in+complex+biological+samples.">Correlation of mRNA and protein in complex biological samples.</a> FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (1038).</li><li>Junion, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+view+of+cell+fate+specification:+ladybird+acts+at+multiple+levels+during+diversification+of+muscle+and+heart+precursors.">Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors.</a> Genes. 21, 3163-3180 (2007).</li><li>Jakobsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+ChIP-on-chip+reveals+Biniou+as+a+universal+regulator+of+the+visceral+muscle+transcriptional+network.">Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network.</a> Genes. 21, 2448-2460 (2007).</li><li>Cunha, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+binding+leads+to+diverse+regulatory+responses:+Lmd+is+a+tissue-specific+modulator+of+Mef2+activity.">Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity.</a> PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).</li><li>Sandmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+transcriptional+network+for+early+mesoderm+development+in+Drosophila+melanogaster.">A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster.</a> Genes, &amp; development. 21, 436-449 (2007).</li><li>Kvon, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+functional+characterization+of+Drosophila+developmental+enhancers+in+vivo.">Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo.</a> Nature. 512, 91-95 (2014).</li><li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila.">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).</li><li>Gallo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REDfly+v3.0:+toward+a+comprehensive+database+of+transcriptional+regulatory+elements+in+Drosophila.">REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila.</a> Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Doyle, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+translational+profiling+approach+for+the+comparative+analysis+of+CNS+cell+types.">Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types.</a> Cell. 135, 749-762 (2008).</li><li>Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+approaches+to+RNA+profiling+data+for+the+identification+of+genes+enriched+in+specific+cells.">Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells.</a> Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).</li><li>Fomchenko, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruited+cells+can+become+transformed+and+overtake+PDGF-induced+murine+gliomas+in+vivo+during+tumor+progression.">Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression.</a> PloS one. 6, e20605 (2011).</li><li>Helmy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+global+alteration+of+translational+regulation+glioma+in+vivo.">Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo.</a> PloS one. 7, e46965 (2012).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification.">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li><li>Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+mouse+line+for+collecting+ribosome-bound+mRNA+using+the+tetracycline+transactivator+system.">A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+translational+profiling+in+the+Xenopus+laevis+retina.">Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1/Stat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration.">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li><li>Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specific+analysis+of+translating+RNAs+in+developing+flowers+reveals+new+levels+of+control.">Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control.</a> Molecular systems biology. 6, 419 (2010).</li><li>Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+method+for+cell-specific+profiling+of+translated+mRNAs+in+Drosophila.">A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila.</a> PloS one. 7, e40276 (2012).</li><li>Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Larval+and+Adult+Drosophila+Astrocytes+Reveals+Stage-Specific+Gene+Expression+Profiles.">Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles.</a> G3. , (2015).</li><li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling.">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genome Res. 22, 766-777 (2012).</li><li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons.">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).</li><li>Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+analysis+of+muscle+founder+cells+implicates+the+chromatin+regulator+Sin3A+in+muscle+identity.">Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity.</a> Cell reports. 8, 858-870 (2014).</li><li>Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+sorting+from+Drosophila+embryos:+application+to+gene+expression+analysis.">Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis.</a> Fly. 5, 261-265 (2011).</li><li>Busser, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+underlying+the+regulatory+specificity+of+a+Drosophila+homeodomain+protein+that+specifies+myoblast+identity.">Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity.</a> Development. 139, 1164-1174 (2012).</li><li>Rorth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4+in+the+Drosophila+female+germline.">Gal4 in the Drosophila female germline.</a> Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).</li><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors.">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218, 348-353 (1982).</li><li>Ingolia, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+pervasive+translation+outside+of+annotated+protein-coding+genes.">Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes.</a> Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה של תרגום ריבוזום זיקה טיהור (המכונה &quot;מלכודת-RC &#39;) מוקדש למחקר של אוכלוסיות תאים נדירות בעוברי תסיסנית. מידע מסופק על השלבים העיקריים לבידוד מוצלח של RNA הספציפי עם תשואה המתאימה לmicroarray או ניתוח RNA-seq, כלומר כמות, 1) של חומר ביולוגי הנדרש והליך מותאם לתמוגה עובר וחילוץ polysome; 2) חרוזים / נוגדן לlysate יחסים לimmunoprecipitation האופטימלי; 3) על שלבים המאפשרים הפחתה של רקע כולל הרכב חיץ לשטוף כדי להריץ ניסויי מלכודת RC עם סגוליות גבוהות ורגישות. פרוטוקול זה מניב נתונים לשחזור שהופכים אותו בקלות מיושם על כל סוגי תאים אחרים. טכניקה זו מאפשרת לנתח ביטוי גני ההפרש ברמה של mRNA באופן פעיל-תרגום ובכך לסלול את הדרך להבנת ביטוי חלבון במפרט<html> סוג תא ific בחלון זמן מסוים. שים לב, עם זאת, שפע חלבון יהיה תלוי בקצב של תהליכי התרגום והשפלה. מגבלה עיקרית של שיטת המלכודת היא חוסר יכולתה למדוד את תכולת חלבון באופן כמותי מדויק או לזהות שינוי שלאחר translational. שיפור הכימות על ידי מדידת צפיפות הריבוזום לאורך גוף mRNA ו, בכך, באופן תאים מסוג ספציפי יכול לעשות TRAP בשילוב עם הריבוזום footprinting כלי רב עוצמה. במאמר האחרון 34, השילוב הזה בוצע בכליות 293 תאים עובריים אנושיים. המחברים רצו footprinting nuclease אחרי טיהור זיקה של טופס biotinylated מושרה של RpL10A באמצעות חרוזים streptavidin. זוהי הוכחה של עיקרון כי ניתן לבצע footprinting הריבוזום בהאורגניזם כולו תוך מיקוד סוג תא מסוים, ההגבלה להיות כמות החומר ביולוגי הנדרש לצורך. &quot;&gt; ביצוע ניסויי TRAP במקביל לניתוחי transcriptomic הגלובליים יאפשר לעקוב אחר פרופורציות בין חדש-עיבד וactively- תרגום RNA. זה יהיה מאוד אינפורמטיבי של המנגנונים שלאחר התעתיק הפוטנציאליים מתקיימים בהקשרים התפתחותיים ספציפיים או אוכלוסיות תאים ספציפיות מיקרו-רנ&quot;א -by למשל. לסיכום, TRAP הוא שיטה יעילה ביותר, ספציפית ורגישה לזיהוי RNAs חייב ריבוזומים פעילים-תרגום באופן ספציפי בתא. בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של יצורים וסוגי רקמות. פרוטוקול מלכודת RC החדש שתואר כאן היה מותאם לאוכלוסיות נדירות של תאים (פחות מ -1% ממספר כולל של תאים) ולכמות חומר סופי מספיקה לניתוחים שלאחר מכן ברמה כל-הגנום. מגבלה אפשרית של שיטה זו היא הדרישה של נהג חזק כדי לייצר ריבוזומים מתויגים בכמות מספקת לcompete עם לא מתויגים אלה אנדוגני בסוג התא הממוקד. במחקר שנערך לאחרונה 25, מחברים מוערך 10-30% היחס מתויג לעומת הריבוזומים לא מתויגים. כדי להתגבר על בעיה זו הגדלת מספר עותק-EGFP כטב&quot;מ-RpL10A צריך לשפר באופן משמעותי את האיזון הזה. לחלופין, הוספה לרקע הגנטי תאר transgene כטב&quot;מ-GAL4 תגביר את הייצור של חלבון GAL4 ובעקיפין להגדיל ביטוי של RpL10A-EGFP. זה צריך להעדיף התפוסה טובה יותר של ריבוזומים מתויגים על mRNA. שים לב שגישה יעילה כבר זה יכול להתבצע אפילו יותר חזק על ידי התאמת שיטות משלימות להביא היבט הכמותי יותר או לגלות ולפענח מנגנונים מולקולריים שהם חיוניים לשליטת ביטוי גנים.

ההבנה כיצד תאי רכישת נכסים ספציפיים במהלך הפיתוח היא חיונית על מנת להעריך את המורכבות של איברים והתפתחות הפוטנציאל שלהם כלפי מצבים פתולוגיים. יש דחיפת מחקר גדולה לפענח את רשתות הרגולציה הגן שנמצאות בבסיס מפרט תא והתמיינות של פרופילי ביטוי גנים הגלובליים גילו דבר, מעמד מחייב פול השני, תפוסת תמלול בגורם על רצפים רגולטוריים או לאחר translational שינויים של ההיסטונים. כדי להעריך ביטוי גנים בmicroarrays רמה הגלובלי וגישות RNA-seq משמשות. Microarrays יאפשר לזהות שפע mRNA, ואילו RNA-seq הוא טוב יותר מותאם להלשנה על הסוגים השונים של RNAs כוללים קידוד וnoncoding RNAs כמו מיקרו-רנ&quot;א, lncRNAs או snRNAs. עם זאת, טכניקות אלה לא יכולים להבדיל באופן פעיל-עיבד, מצב יציב mRNA, פעיל-תרגום mRNA, וmRNA כניסה לתהליך הפירוק. מדידה יציבה-st<html> אכלתי רמות ה- mRNA ידוע להיות הערכה לקויה של הרכב proteome 1-3. בניגוד, זיהוי באופן פעיל-תרגום mRNA נותן תמונה מדויקת יותר של ייצור חלבון. עם זאת, מחקרי transcriptomic היו בעיקר הובילו ברמה כל-אורגניזם על ידי השוואת רווח או הפסד של פונקציה של גורם ספציפי למצב בר-סוג 4-7 או על רקמה גזור, מה שהופך את פרופילי ביטוי גנים קשים לפרש. התקדמות בכלי תא מיקוד, טיהור זיקה ושיפורי רגישות מאפשרת כעת לבצע הגנום מנתח באוכלוסיות קטנות של תאים או תאים בודדים אפילו באורגניזם חי. בדרוזופילה, אוספים גדולים של קווים מהונדסים יאפשר מיקוד של זמן ומרחב ספציפי של רקמות שונות ותת-אוכלוסיות תאים באמצעות מערכת GAL4 / כטב&quot;מ 8-10 מניב כימות מדויק יותר של המנגנונים המולקולריים הנדרשים לתפקוד תא. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; בין גישות חדשות שפותח על ידי חלוקה polysome פרופיל תואר כדרך כדי ללכוד באופן פעיל-תרגום 11 RNA. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה שיפוע סוכרוז מאפשרת הבחירה של חלק polysome ונחישות של mRNA מתורגמת הגנום כאשר ניתחו עם microarrays או רצף עמוק. Polysome בידוד יכול להיות בשילוב עם מערכת עיכול nuclease לזהות עקבות ריבוזומלי המתאימות לברי RNA מוגנים על ידי הריבוזומים במהלך תהליך התרגום 12. footprinting ריבוזומלי מגדיל את הדיוק של כימות תרגום RNA ורזולוציה ברמת רצף RNA ומיצוב הריבוזום, מאפשר למדוד שיעור של תרגום. עם זאת, עד היום לא הוחלו על בידוד תא ספציפי של translatomes, בעיקר כתוצאה מהירידה החזקה בתשואת RNA המתקבלת בסופו של תהליך footprinting הריבוזום. בהתחשב בכך שבחירת הגודל של RNA עשויה ליצור שקר-p פוטנציאלositives מRNPs שונה שיכולים להיות גם הגנת RNA באופן דומה, יש צורך בהתפתחויות נוספות כדי לשפר את footprinting ריבוזומלי ולהתאים אותה לגישות תא ספציפי. אחת שיטות כגון, נקרא תרגם ריבוזום הזיקה הטיהור (TRAP) תוארה בשנת 2008 על ידי היימן ואח &#39;. ומיושם לבודד את translatome מקבוצת משנה של תאי עצב בעכברים. על ידי epitope תיוג חלבון ריבוזומלי באופן תאים מסוג ספציפי, polysomes יכול להיות מטוהר באופן סלקטיבי ללא צעד מייגע של ניתוק תא ומיון. במקרה זה, בשנתי ה -60 חלבון ריבוזומלי L10a על פני השטח של הריבוזום הייתה מתויגת עם 13 eGFP. מאז 2008, מספר מחקרים השתמשו בשיטה זו במינים שונים, מעכברי 14-19 לX. laevis 20,21, 22,23 דג הזברה וארבידופסיס thaliana 24. שיטת המלכודת גם הותאמה למודל תסיסנית ומשמשת לפוריםתאים מהסוג ספציפי פ.י. mRNAs מהתאים עצביים 25 והאסטרוציטים 26. מערכת GAL4 / כטב&quot;מ בינארי צדדי שימשה להביע RpL10A GFP מתויג באופן רקמות ספציפיות. ראשי הזבובים בוגרים נותחו לבצע בחירת polysome מהתאים עצביים (ממוקדים על ידי נהג Elav-Gal4 פאן-עצבי) וRNAs המבודד היו רצף. המספר הגדול של גנים מוסדרים עד תואם לאלה ידועים להתבטא במערכת העצבים, המצביע על כך שיש הגישה ספציפיות טוב וגרם לנו להתאים אותו לאוכלוסיות תאים נדירות (פחות מ -1% של תאים) נוכחי בפיתוח עובר תסיסנית . בתוך מודל דרוזופילה, השלב העוברי הוא מודל של בחירה לחקר תהליכים התפתחותיים, כשחקנים המולקולריים ותנועות המוךפו&quot;גנטי נשמרים אבולוציונית. גישות transcriptomic רקמות ספציפיות בלבד שנערכו עד כה במודל זה בוצעו באמצעות סלולארי או גרעיני כךrting והיה מסוגל ללמוד transcriptome מצב יציב 27-31 בלבד, יצירת צורך בשיטות מוקדשת לרקמה / פרופיל translatome תא ספציפי בעובר הזבוב. כאן אנו מדווחים פרוטוקול המלכודת הראשון מוקדש לעוברי תסיסנית. בשיטה זו, העוסק ב-התרגום mRNA באוכלוסיית תא מוגבל מאוד של כ -100 תאי שריר לכל עובר היה מבודד בהצלחה עם איכות וסגוליות גבוהים. GAL4 / כטב&quot;מ המערכת בינארי משמשת לנהוג הביטוי של RpL10A מתויג GFP בתת-אוכלוסייה של שרירים ללא כל רעילות, אין פנוטיפים לכאורה או עיכוב התפתחותי, כפי שמוצגים בעבר 25. עובר תסיסנית יש 30 שרירים לhemisegment שיהיה להצמיח השרירים של הזחל. על ידי שימוש באזור רגולטורים גילו בסביבה של גן זהות נמושה, 6 מתוך 30 השרירים רב-הגרעיניות ממוקדים. ב assay זה, הריבוזומים הם משותקים על mRNA באמצעות התארכות התרגוםמעכב cycloheximide. תמציות cytosolic משמשות לאחר מכן לטיהור זיקה עם חרוזים מגנטיים מצופים נוגדן ה- GFP. איכות של RNA מטוהר קבלה תוקף באמצעות bioanalyzer. שעתוק לאחור PCR (RT-qPCR) שימש כדי לקבוע את הספציפיות ורגישות של בידוד mRNA והוכיח כי הפרוטוקול מותאם שלנו הוא יעיל ביותר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>H4034-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850306P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>thermo scientific&#160;</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified BSA 100X&#160;</td>
			<td>Biolabs</td>
			<td>B9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super RNase In&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody GFP clone N86/38</td>
			<td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated</td>
			<td>75-132&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11754595001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 Lysis homogenisation&#160;</td>
			<td>Bertin Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water&#160;</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads ProteinG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10004D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM96406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystem&#160;</td>
			<td>AM95306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose waddin unbleached&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2597&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieves 112, 355, 710 um&#160;</td>
			<td>Retsch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRiZol&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagRack 6</td>
			<td>GE HealthCare&#160;</td>
			<td>28948964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding filter tips&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase free tube 1,5 mL&#160;</td>
			<td>ClearLine</td>
			<td>390689DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20&#160;</td>
			<td>Fischer Bioreagent&#160;</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C1985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trap-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of drosophila embryos

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.

המערכת הגופנית עוברי תסיסנית השריר מורכבת של 30 שרירים לhemisegment, ויש לו כל שריר קבוצה מסוימת של מאפיינים: קוד של גני הזהות, עמדה, מספר אירועי היתוך, אתרים מצורפים ועצבוב. זיהוי mRNA המתורגם בתת-קבוצת שרירים ספציפית ייתן מידע על החלבונים הדרושים ליצירת מאפייני שרירים הספציפיים אלה. שימוש בשיטה מבוססת המלכודת, RNA מתת-אוכלוסייה של שרירים המבטאים את גן נמושה זהות הייתה מטוהר (1A-B איור). דאגה עיקרית של גישה זו היא באיכות והספציפיות של RNA הבודד. הפרוטוקול מותאם דיווח כאן אפשר התאוששות שיטתית של RNA באיכות גבוהה העריך עם ניתוח bioanalyzer. מופעי הפרופיל הושגו שום השפלה של RNA (איור 1 ג). במחקרים אחרים התפתחו סביב שיטת המלכודת, הועלו שאלות על הספציפיות של נתונים. כאן אנוmprove השיטה לדכא רקע קשור לאינם ספציפי מחייב של RNA לחרוזים או הצינורות ועל ידי אופטימיזציה של החיץ לשטוף. על מנת להעריך את רמת הרקע ויעילות של בידוד תאים לבטא-נמושה, שהובלנו ניסויי RT-qPCR על 3 חזרות של אותו השלב עוברי. מקפלים-מוספים של 4 גנים שונים (mef2, נמושה, פרוספרו, soxNeuro) חושבו בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32 (1D איור). תוצאות אלו הראו העשרת 2.3-פי של mef2 גן פאן-שרירי והעשרת 5.6-פי של גן נמושה. לעומת זאת, שני גנים המתבטאים במערכת העצבית היו מדולדלים בהשוואה לקלט. ערכי שינוי קיפול מאוד דומים נצפו על 3 משכפל ביולוגי, הוכחה כי הפרוטוקול הוא איתן. עם נהג נמושה-Gal4 ומתחיל עם 1.5 גר &#39;, סביב 1.5x10 ^ 6 עוברים התקבלו המכילים 100 תאי GFP / עובר (כוללת של 150 × 10 ^ 6 חיובייםתאים). לאחר הפעלת ניסוי המלכודת, התשואה היא סביב 25-45 ננוגרם של RNA המסוים תלוי בשלב של עניין. חומר זה הוא מספיק כדי להפעיל ניתוח microarray או RNA-seq באמצעות פרוטוקול הגברה לבנות ספריית RNA-seq. יעילות תהיה תלויה במידה רבה בכוחו של הנהג נהג להביע RpL10A-EGFP. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> איור 1. איכות והערכה ספציפי של RNA-מבודד מלכודת מנמושה-GAL4&gt; עוברי UASRpL10A-EGFP. (AB) תמונות Confocal של עובר בשלב 16 מראה ביטוי RpL10A-EGFP במיוחד בששת תאי שריר נמושה לhemisegment (). שיתוף לוקליזציה של RpL10A-EGFP עם Beta3tubulin סמן שרירים הכללי הוא ציין בתמונת מיזוג (B). בקרת איכות של TRAPed RNA ע&quot;ר (C)n על bioanalyzer מראה יושרה מושלמת של 18S rRNA ו -28. ניתוח (ד) RT-qPCR מראה סגוליות גבוהה של ניסויי mRNA-מבודד TRAP על 3 משכפל ביולוגי של שלב-16 עובר. מקפלים שינוי מחושב בהשוואה לקלט ומנורמל נגד גן RpL32. תמלילי Mef2 נוכחים בכל שושלות השריר הם מועשרים-2.3-פי השוואה לקלט ואילו תמלילי נמושה מוגבלים יותר הם 5.6-מועשר פי. תאים עצביים להביע פרוספרו וגני soxN מתרוקנים 2.2 פי 5.5 ופי בהתאמה. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos at JoVE.com

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Google

Research

JoVE Journal

Biology

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

17.7K Views.  University of Clermont-Ferrand. Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos. 

Video: TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...