אנו מודים מייקל Rosbash על ההדרכה שלו ותמיכה במהלך השלב הראשוני של ההתפתחות של שיטה זו. עבודה זו מומן על-ידי JST פרסטו התוכנית, שוויצרי הקרן הלאומית למדע (31003A_149893 ו- 31003A_169548), המועצה האירופית למחקר (ERC-StG-311194), נוברטיס קרן מחקר ביו-רפואי (13A39), באוניברסיטת ג'נבה .

1. הכנת מלאי פתרונות ברדס תרבות
<ol><li>להכין 400 מ של 1 x בינוני הפעיל שניידר (SAM) אופטימיזציה עבור ex-vivo תרבות של המוח זחל (שונה ההתייחסות24,25) (טבלה 1). Aliquot ל מ ל ו- flash להקפיא במצב חנקן נוזלי (LN2), לאחסן ב- 80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין 1 x Dissecting, תמיסת (DSS) על-ידי המדללת 10 x מניות פתרון (שונה ההתייחסות26) (טבלה 2).</li>
	<li>פיברינוגן aliquot 10 מ ג, חנות ב 4 ° C לשימוש בודד. התראה: שוקלים פיברינוגן תחת זרימה שכבתית, לבש כפפות, כפי שהוא מזיק.</li>
	<li>להכין פתרון מניות תרומבין סאם (1500 NIH יחידה/mg) aliquot כדי 10 µL, פלאש להקפיא LN2 , לשמור ב-80 מעלות צלזיוס. התראה: ללבוש כפפות בעת טיפול תרומבין כמו זה מזיק.</li>
	<li>Aliquot מניות פתרון של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין. לשמור ב-20 ° C.</li>
	<li>חותכים עיגולים של ממברנות טפלון (PTFE) (ראה טבלת חומרים) בגודל שמתאים בתוך צלחת תחתית זכוכית. יש לשטוף אותן ב- 70% EtOH ולאחר מכן כניסה בלוק dH2O. Sterilize ויבש תחת זרימה שכבתית עם UV. להשאיר צלחת פטרי סטריליות. שימוש אחד. הערה: PTFE היא קרום נקבובי גמיש זה מאפשר חילוף הגזים ומונעת בינוני מתאדים במהלך ההקלטה לטווח ארוך.</li>
</ol>2. זמן לשגות מיקרוסקופ ההתקנה
הערה: ההגדרה הבאה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי סורק הפוכה טנדם (ראה טבלת חומרים) מצויד עם סורק תהודה (8,000 Hz). המערכת כוללת גלאי צילום-מכפיל מאוד רגיש, המונע יחד עם סורק תהודה של phototoxicity ו- photobleaching. טמפרטורה ולחות מבוקרות בתוך תא סביבתיים מיקרוסקופ זה (ראה טבלת חומרים) מכסה את רוב המיקרוסקופ.
<ol><li>במקום חדר לחות הבמה-העליון.</li>
	<li>הפעל את בקרי טמפרטורה ולחות כדי equilibrate את התא מיקרוסקופ כדי 25 ° C ו- 80% לחות.</li>
	<li>ביצוע ניסויים בחשכה קבוע (DD), מכסה תא סביבתיים מיקרוסקופ בד אטום (אלא אם כן התא מיקרוסקופ מורכב של חומר אטום).</li>
	<li>אם משתמש מטרה טבילה במים, מיקום מתקן מיקרו טבילה מים מעל המטרה, תוכנית פרוטוקול עם התוכנה Autoimmersion המטרה בקר כדי לוותר על מים בקצב קבוע במהלך דימות זמן לשגות. הערה: טבילה במי מטרות יחד עם מתקן מים או עדשה אובייקטיבית יבשה של מומלצים עבור הדמיה חיים לטווח ארוך, כמו סוג אחר של טבילה בינוני להתייבש.</li>
	<li>במקום בעל פטרי על הבמה, בתוך תא לחות.</li>
	<li>להפעיל את התוכנה מיקרוסקופ ובחר את מצב סורק תהודה מתוך תיבת דיאלוג הראשון. בחר ב'אישור ' כדי לאתחל את הבמה כאשר תתבקש לעשות זאת. לכי אל הכרטיסיה ' תצורה ' תצורת החומרה כדי לעבור על הקווים הרלוונטיים לייזר.</li>
	<li>לעבור ללשונית ידרשו לחלונית XY בחר מצב דו-כיווני ולהגדיר את התמונה רכישה פרמטרים. הערה: מתואר הדמיה ההגדרה המובאת כאן (איור 2, איור 3 וסרט 1) ממוטבת להתבונן ביטוי היממה של עיתונאים פלורסנט ספציפיים. הפרמטרים הבאים נבחרו מיטבית שלנו מפרט: 40 X מים טבילה אובייקטיבי, X 8 קו ממוצע עם רזולוציית התמונה × 512 512. עבור הדמיה ססגוניות, ייבוא תמונות רציפים נדרש כאשר אורך הגל פליטה של fluorophore אחד, אורך הגל עירור חפיפה אחר (כאן, אורכי הגל של החלבון הניאון צהוב (YFP) פליטה ו עגבניות עירור חפיפה). לבחור את מצב סדרתית "בין מחסנית" הוא הכי מהיר, התנועה של נוירונים השעון היא זניחה במהלך רכישת Z-במחסנית. מיקרוסקופ הגדרות צריכות להיות להתאים בהתאם מטרת ניסוי.</li>
</ol>3. התקנה של המוח זחל Explant תרבות
הערה: כל התהליך מן דיסקציה להטבעת של המוח explants לוקח ~ 30 דקות.
<ol><li>
הכנת ריאגנטים ברדס תרבות.
	<ol>
<li>להפשיר את aliquot של תרומבין ולשמור בטמפרטורת החדר עד השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד.</li>
		<li>הפשרת במהירות של aliquot של סאם ב 37 מעלות צלזיוס ולשמור בקירור לשימוש בודד.</li>
		<li>הוסף סם aliquot 10 מ ג של פיברינוגן כדי 10 מ"ג/מ"ל, קפיצי בעדינות ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות, במהלך השלב ההטבעה (שלב 3.3). שימוש אחד. הערה: לא דגירה של פיברינוגן פתרון יותר 2 h שזה יתחיל פולימריזציה.</li>
		<li>להפשיר aliquot של x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין. להכין 2.5 מ של סם המכיל 1 x פניצילין-סטרפטומיצין (סאם/אנטיביוטיקה). לשמור בטמפרטורת החדר. הערה: חנות הנותרים x 100 מניות פניצילין-סטרפטומיצין ב 4 ° C עד חודש.</li>
		<li>להכין את aliquot של 500 µL מסם הנותרים. לשמור על הקרח.</li>
		<li>עבור הדמיה לטווח ארוך, למרוח משחה ואקום בלוק לחלק התחתון של המנה התחתון זכוכית (איור 1 א') פלסטיק ולחטא תחת זרימה שכבתית עם UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דיסקציה של חוט עצבי במערכת העצבים המרכזית ו הגחוני /.
	<ol>
<li>לנקות את המלקחיים ו- 2 x כלי חיתוך הזכוכית שלוש-. טוב עם 70% EtOH. יוצקים µL 400 של DSS לתוך בארות 4 ו- 400 µL של סאם היטב אחד. לשמור על הקרח.</li>
		<li>לקצוץ לטוס בינוני המכיל הזחלים ולבחור שאינם נודדים השלישית לחלל הזחלים (L3) עם מלקחיים. לשטוף אותם במרוכז בבארות 2 מלא DSS. שמור אותם הבאר השלישית DSS מלא בקרח זה anesthetizes את הזחלים. הערה: L3 נמשכת כ 2 ימים ב- 25 ° C. להתבונן המוח בתוך פרק זמן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בחרנו להשתמש שאינם נודדים הזחלים L3. קבוצות אחרות של השעון הנוירונים, כגון l-LNvs, DN3s, מתחילים להיווצר על נדודים L3 הבמה אבל הם לא בהכרח רכיבה על אופניים עדיין (נתונים לא מוצג). לכן, למרות שפעולה זו אפשרית על תמונת אופניים שעון נוירונים בשלב זה (נתונים לא מוצג), חשוב להבחין היטב הנוירונים פונקציונלי כבר שעון זחל מלפתח אלה לניתוח נתונים. Non-נודד L3 מופיעים כ- 4-4.5 ימים לאחר ביצה הנחת ב 25 º C. כדי להשתמש בפרוטוקול זה ללימוד השעון הביולוגי, לסנכרן (entrain) הרימות מתפתחות ב 12 h/12 h LD מחזורי 25 ° c 3 ימים לפני איסוף L3 הזחלים.</li>
		<li>לנתח את המוח זחל עם מלקחיים בסדר בתוך הבאר 4 מלא DSS, אשר לא נעשה שימוש עבור שטיפה הזחלים, באמצעות שיטה הפוכה27.<ol>
<li>בקצרה, לחתוך הזחל לשתיים, ברכות לצבוט את הווים הפה עם זוג מלקחיים, סכם מבפנים ומבחוץ הקיר הגוף באמצעות זוג מלקחיים, ובכך חושף בפני המוח אחרים. חינם המוח על ידי חיתוך כל קנה הנשימה ואת העצבים לצרף אותו לשאר חלקי הגוף.</li>
			<li>תשאף המוח ב- 3 µL של DSS עם פיפטה 20 µL (מראש שטפה עם DSS), לוותר על הבאר מלא סם. חזור על התהליך עבור המוח עד 7. הערה: ניתוח צריכה להתבצע על משטח קר לשמור את הזחלים ומורדמת והמוח מקורר. לדוגמה, במקום המנה לנתיחה על בלוק קירור מחוברת משאבה לזרום מים מקורר-קרח. דיסקציה ההליך לוקח ~ 30 הוא לכל המוח. חשוב לשמור את הדיסקים דמותי העין/antennal המצורפת את המוח ואת חוט עצבי הגחון ללא פגע. קורעת את החלקים הבאים נזק למוח, להפחית את האיכות של התרבות. כמו כן, למנוע חשיפת המוח לאוויר. לפני כ רפה בעברית המוח הראשון, פיפטה למעלה ולמטה DSS המכילים חלקים של הזחלים גזור, כפי שהוא מונע את השכל נצמדים לקיר של הקצה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הטבעה של המוח explants במטריצה תלת-ממד, הרכבה (~ 20 דקות).
	<ol>
<li>להטביע מוח ביתור הפתרון עובד פיברינוגן (פיברינוגן הריכוז הסופי ~3.3 מ"ג/מ"ל, µL 10.5 לכל המוח) כדלקמן:</li>
		<li>האחות µL 3.5 של סאם/אנטיביוטיקה (עם עושה שימוש בסעיף 3.2.3). האחות מוח גזור מן הקרע היטב לתוך קצה פיפטה אותו בלי dispensing המדיום סאם/אנטיביוטיקה בקצה.</li>
		<li>לוותר על המוח ועל המדיום על המכסה של צלחת פטרי סטריליות. מוסיפים עוד 3.5 µL של סאם/אנטיביוטיקה µL 3.5 של פיברינוגן חמים/סאם 10 מ"ג/מ"ל פתרון על המסירה המכיל את המוח. לערבב בעדינות את הפתרון סביב המוח על ידי pipetting עם טיפ פיפטה 20 µL. הערה: באמצעות פיפטה ולא מלקחיים בשלב זה מונע והדגיש את המוח.</li>
		<li>לקחת 2 µL של הפתרון עובד פיברינוגן מהמסירה ולהחיל אותו על coverslip של המנה התחתון זכוכית בצורת מעגל קטן. מוסיפים µL 0.8 של תרומבין ומערבבים מהר מאוד עם טיפ פיפטה. פיברינוגן מומר פיברין, יתחיל פולימריזציה.</li>
		<li>לקחת את המוח יושב של פיברינוגן עובד פתרון (שלב 3.3.1) בין זוג מלקחיים ומקם אותה על המטריקס פעם מטריצה לבן של פיברין הוא גלוי. אוריינט אל הצד הקדמי של המוח למטה (עבור הדמיה שעון נוירונים). לדחוף למטה קרוב ככל האפשר אל הזכוכית המכסה. Clot פיברין מורכב שכבות של פיברין. בחר שכבה אחת ומקפלים אותו מעל המוח בתנועות עדינות וקטנות ללא ניתוק של המטריקס.<ol>
<li>חזור על פי 2 עד פי 3 מחלקים שונים של קריש הדם כדי לייצב את המוח. הערה: בעת טיפול המוח עם מלקחיים, יש להיזהר לא לייבש אותו או לכפות אותו הלחץ הפיזי.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הוסף 20 µL של סאם/אנטיביוטיקה על המוח מוטבע כדי להפסיק את הפעולה של תרומבין.</li>
		<li>חזור על הפעולות כדי לטעון את השכל הנותרים. . זה ניתן להטביע עד 5 עד 6 המוח על צלחת תחתית זכוכית.</li>
		<li>הדמיה חיה לטווח ארוך, הוסיפו 600 µL של סאם/אנטיביוטיקה בבאר הפנימי (החלק זכוכית). מקם חתוכות מראש PTFE קרום על גבי המדיום ולתקוע אותו לגריז ואקום חלה על חלק הפלסטיק התחתון (3.1.5) (איור 1 א').</li>
		<li>עבור מבחני תרופתי, למלא קערה עם 2 מ"ל של סאם/אנטיביוטיקה (איור 1B). הערה: חשוב מאוד למנוע אידוי של המדיום, osmolality של המדיום הוא קריטי הכדאיות של נוירונים. לכן, לניסויים הדמיה לטווח ארוך, יש צורך לאטום את המנה תרבות עם PTFE קרום. ואילו לניסויים לטווח קצר, איטום ממברנה אינה נדרשת עוד המנה הוא מלא עם 2 מ"ל של מדיום, בפיקוח תא humidified.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ייבוא תמונות בצילום מואץ
<ol><li>הצב את הצלחת התחתונה זכוכית בקופסת פטרי תא לחות הבמה-העליון.</li>
	<li>עבור z-מחסנית לוח בכרטיסיה ידרשו ולהגדיר את השלבים z-סעיף מתוך התוכנה מיקרוסקופ (2 מיקרומטר × ~ 40 בניסויים שמוצג באיור 2 , איור 3ו 1 סרט). לקבוע את תחילת z-מחסנית המטוס המרוחק ביותר את coverslip ואת הקצה על פני השטח של explant המוח, קרוב coverslip. למרות המוח תנועות הם זניחים, להוסיף תוספת z-סעיפים ההתחלה ואת הסוף של הערימה-z.</li>
	<li>ללכת לסמן ומצא ייבוא תמונות במקומות מרובים בחלונית והתקנה. עם מטרה X 40, 1 האונה במוח יכולה להילכד בתוך תצוגה של שדה</li>
	<li>ללכת xyzt בחירה (z-מחסנית בצילום מואץ) ובחלונית מצב של רכישה. עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את הפרמטרים של מרווח זמן ותדירות הזמן המועדף. הערה: לרכוש תמונות בצילום מואץ בתדירות הרצויה. שימו לב כי הדמיה חיים לטווח ארוך (24-72 שעות) עם זמן לשגות מרווח זמן קצר יותר מאשר 2 h נוטה תוצאות בנוירונים אופניים פחות, כנראה משום שהיא מקטינה את הכדאיות של נוירונים. הנפח מרחיב כמו קצב רכישת התמונה עולה, מה שהופך ניתוח נתונים ואחסון מאתגרת יותר.</li>
</ol>5. טיפול תרופתי של המוח Explants עם Short-term לחיות הדמיה
הערה: ההליך הבא מיועד בעיקרו של דבר זהה לזה הדמיה לטווח ארוך אך אינה דורשת PTFE קרום. למנוע חשיפת המוח כדי אור כחול כאשר החומר הכימי מתווסף אל התרבות, המיקרוסקופ יוצב בחדר חשוך עם אור אדום.
<ol><li>עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר סריקה כדי להשיג את נתוני התוכנית הבסיסית לפני יישום סמים. הפעל סריקה.</li>
	<li>לאחר התוכנית הבסיסית השלמת הסריקה, וכשמרימים את הראש סריקה של המערכת מיקרוסקופ. הסר את המכסה של בקר לחות הבמה-העליון, בזהירות להסיר את המכסה של המנה התחתון זכוכית מבלי להזיזו.</li>
	<li>הסר את הכמות המתאימה של תרבות בינוני במידת הצורך. מוסיפים את הפתרון ניסיוני במדיום ומערבבים, בזהירות, בעדינות רבה, עם פיפטה פסטר סטרילי מבלי לגעת explants את המוח. הערה: עבור יישום אמבט של PDF, השתמש 2 מיקרומטר פתרון PDF מניות (ב 10% דימתיל סולפוקסיד).</li>
	<li>החלף את המכסים את הצלחת התחתונה זכוכית תא לח, ואת הראש הסריקה. אם משתמש, למקם מחדש את הבד אטום שחור סביב התא מיקרוסקופ.</li>
	<li>בדוק אם המוח נמצאים במיקום המקורי שלהן במצב סריקה בשידור חי. התאם במידת הצורך.</li>
	<li>עבור אל לוח זמן רכישה ולהגדיר את מרווח הזמן הרצויה ומספר הסריקה. הפעל סריקה. הערה: כאן בדקנו תמונות בצילום מואץ רכשה כל שעה עבור עד 10 שעות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit:+Pas+De+Deux+or+Tarantella?.">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li><li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clock+shop:+coupled+circadian+oscillators.">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li><li>Zhang, Y., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15+-+Molecular+and+neural+control+of+insects+circadian+rhythms.">Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms.</a> Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).</li><li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila.">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li><li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clocks+in+the+brain:+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila.">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li><li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila.">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li><li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock.">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560 (2017).</li><li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF.">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li><li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G+protein-coupled+receptor,+groom-of-PDF,+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior.">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li><li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors.">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culturing+of+whole,+developing+Drosophila+brains.">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling.">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699 (2014).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony.">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li><li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+entrainment+of+Drosophila's+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain.">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca(2)(+)+rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs.">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li><li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses.">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro.">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו תיאר את שיטת עבור קרינה פלואורסצנטית לטווח ארוך זמן לשגות מיקרוסקופ של המוח זחל בתרבית. ההצלחה של ניסויים מסוג זה תלויה גורמים רבים, כגון הבריאות של התרבות, שיטת הנייח של המוח explant, עוצמת קרינה פלואורסצנטית יחס אות לרעש של הכתב, הזמני, רזולוציה מרחבית, ו נגישות explant. גורמים אלה יכול...

שעונים היממה לעזור אורגניזמים להסתגל לשינויים סביבתיים תקופתיים שנוצר על ידי 24 שעות הסיבוב של כדור הארץ. לולאות משוב תעתיק translational בזו ביסוד נפוץ המנגנון המולקולרי של היממה שעונים על פני מינים1. המעגל היממה קוצב הלב מורכב המכיל שעון נוירונים משלב זמן-של-יום המידע הנמסר על ידי רמזים סביבתיים, כגון/כהה (LD) ומחזורי טמפרטורה, שיתכנן את מקצבי שפע של יומי פיזיולוגיים, תהליכים התנהגותיים2,3. התיאום של מקצבים מולקולרית עם עצביים התשומות והתפוקות חשובה קריטית עבור הפעולה של מעגל היממה אך שרידים הבין באופן חלקי בלבד.
דרוזופילה, בליבה של השעון המולקולרי, heterodimer מחזור/שעון (CLK/CYC) מפעיל שעתוק של התקופה (לאדם), נצחית (tim). לכל וטים יוצרים קומפלקס והזן את הגרעין, שבו הם לעכב פעילות גנים ברמת השעתוק של CLK/CYC וכתוצאה מכך שעתוק משלהם. Post-transcriptional ו- post-translational לגרום לעיכובים שעתוק CLK/CYC-מתווכת בין דיכוי על ידי לכל / טים, המבטיח את הדור של בערך 24 שעות ביממה תנודות מולקולרית1,3,4 . נוירונים כ-150 המכיל טופס אלה שעונים מולקולרית מעגל הבקרה להתנהגות היממה של מבוגר טסה5. כמה פשוטים אך פונקציונליים לחלוטין היממה מעגל חשמלי המורכב 3 קבוצות של נוירונים שעון - 5 נוירונים לרוחב הגחון (LNvs; 4 LNvs PDF-חיובי, LNv PDF-שלילי אחד, ראה להלן), 2 1s נוירון הגבי (DN1s) ו- 2 2s נוירון הגבי (DN2s) - נמצא הזחל המוח6,7.
המעגל פשוט היממה זחל מציע מודל מצויין ללמוד את האינטראקציות בין תקשורת בין-עצביים של שעון מולקולרי. באמצעות הכתבת פלורסנט פיתח לכל-TDT, אשר מחקה את הרמות לכל חלבון ומיקומו subcellular, חיפשנו לאפיין את הדינמיקה של המכני מולקולרית ב שעון שונות תת-קבוצות נוירון במעגל היממה זחל 8. יתר על כן, לדעת תפקיד מפתח של neuropeptide פיזור פיגמנט הגורם (PDF) המיוצר על ידי LNvs 4 בוויסות מקצבים השעון הביולוגי-ברמה העצבית9,10,11, רצינו לבדוק הישירות השפעת PDF על השעונים מולקולרית. לשם כך, פיתחנו שיטה כדי לפקח על ביטוי גנים היממה מקצבים במוח זחל explant על פני ימים מרובים על-ידי קונפוקלית זמן לשגות. הפרוטוקול הותאמה גם עבור מבחני תרופתי לבחון את ההשפעה של PDF או תרכובות אחרות ברמה של פי-TDT. לפיכך, ההסתגלות מורכב לנגישים התרבות explant המוח ליישום סמים, הגדלת רזולוציה טמפורלית, הדמיה עבור משך קצר יותר.
Ex-vivo תרבות של דרוזופילה מוחותיהם של שלבים התפתחותיים שונים היו שנקבעו קודם12,13,14,15,16,17 ,18. והואיל פרוטוקולים אלה שימשו הדמיה תופעות ביולוגיות שונות, חלקם אינם תואמים דימות ברזולוציה תא בודד או אינם תומכים התרבות יותר מאשר מספר שעות. שיטות אלטרנטיביות לביצוע הדמיה חיים לטווח ארוך של היממה נוירונים בדרוזופילה כוללים ביולומינסנציה הדמיה מולקולרית מקצבים19,20,21 קרינה פלואורסצנטית הדמיה של מחוון סידן עם22,של מיקרוסקופ אור גיליון23. למרות ביולומינסנציה הדמיה ניתן להשיג רזולוציה טמפורלית גבוהה יותר, מיקרוסקופ אור גיליון ניתן להתאמה עבור הדמיה ויוו , הם מוגבלים על הרזולוציה המרחבית, דורשים מערכות מיקרוסקופים מיוחדים.
השיטה המתוארת כאן המותאמים באופן חזותי אותות פלואורסצנט בתרבות כל המוח ברזולוציה תא בודד על פני ימים מרובים. שיטה זו נתיישב ופסיביות יכול להיות מותאם כדי התמונה תרבותי המוח לטוס למבוגרים ו לניסויים תרופתי ללמוד הרבה בעיות שונות מצאו דרוזופילה .

<table><tbody><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &quot;suitable for insect cell culture&quot; whenever available</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&amp;minus;)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Fumaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Ketoglutaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E&amp;amp;K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td></tr><tr><td>PDF, NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon FEP Film</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Three-well glass dissection dish</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, size 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature control chamber</td><td>Life Imaging Services</td><td>The CUBE &amp;amp; BOX temperature control system, custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top humidity controller</td><td>Life Imaging Services</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td><td>ImageJ software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x iterative deconvolution</td><td>AutoQuant and Imaris software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

המעגל קוצב לב היממה האחראית פלטי פיזיולוגיים ורגשיים קצבית מתואמת עם רמזים סביבתיים, כגון מחזורי יום/לילה. השעון המולקולרי בתוך כל נוירון קוצב לב יוצר השעון הביולוגי בביטוי גנים, אשר מושתתות הפונקציות עצביים קצבית חיוני לפעולה של המעגל. חקירת המאפיינים של הפרט מולקולרית של מחלקות שונות של קוצב לב נוירונים ודן האינטראקציה שלהם עם אותות עצביים התשואות הבנה טובה יותר של המעגל היממה קוצב לב. כאן, אנו מציגים בגישה מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות פותח על מנת לנטר את שעון מולקולרי בנוירונים שעון מהמוח זחל דרוזופילה בתרבית. שיטה זו מאפשרת הקלטת הנמשך של חמשת המקצבים של מקודדים גנטית עיתונאים היממה פלורסנט ברזולוציה תא בודד. תוכנית התקנה זו יכול להיות משולב עם מניפולציות תרופתי לנתח באופן הדוק תגובה בזמן אמת של השעון המולקולרי תרכובות שונות. מעבר מקצבים השעון הביולוגי, שיטה זו תכליתי בשילוב עם טכניקות עוצמתיות דרוזופילה גנטי מציעה את האפשרות ללמוד מגוון תהליכים עצביים או המולקולריות ברקמת המוח בשידור חי.

כאן, אנו מראים את התוצאות נציג של ההקלטה לטווח ארוך של עיתונאי פלורסנט היממה ב- ex-vivo המוח זחל תרבות, ואת תוצאות הדמיה בשידור חי של PDF יישום אמבטיה על הכתב ביטוי.
Non-נודדים הזחלים L3 לבטא את שעון מולקולרי כתב לכל-TDT ואת UAS-mCD8::YFP מונע על ידי נ?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K Views.  University of Geneva. המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

Video: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Developmental Biology

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetics

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Biology

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

הדמיה צמחי מוח חיים מזחלי Drosophila melanogaster זחלי Instar שלישי

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

מחבר Spotlight: Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila larval brain explants 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

הדמיה חיה של

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה