我々 は彼の指導のマイケル Rosbash に感謝し、このメソッドの開発の初期段階をサポートします。科学技術振興機構さきがけプログラムによって、スイスの全米科学財団 (31003A_149893 と 31003A_169548)、欧州研究評議会 (ERC-ポンド-311194)、ノバルティス財団法人医療医学研究 (13A39)、ジュネーブの大学資金が供給されたこの作品.

1. 文化フードの下にストック溶液の調製
<ol><li>400 ml (参照24,25から変更) 幼虫の脳の前のヴィヴォ文化のために最適化されたシュナイダー活動的な媒体 (SAM) x 1 の (表 1)。5 mL フラッシュして因数 (LN2) 液体窒素で凍結、- 80 ° C で保存</li>
	<li>希釈 10 倍の原液 (参照26から変更) 解剖生理食塩 (DSS) × 1 を準備 (表 2)。</li>
	<li>10 mg と単一の使用のための 4 ° C で保存場所に割り切れるフィブリノゲンは。 注意: 層流、手袋、有害です下のフィブリノゲンの重量を量る。</li>
	<li>サムのトロンビン原液を準備 (1500 NIH ユニット/mg)、10 μ L を分注、フラッシュ LN2でフリーズ、-80 ° C で維持 注意: は、有害であるトロンビンを処理するとき、手袋を着用します。</li>
	<li>分注・原液 100 のペニシリン-ストレプトマイシン x。-20 ° C で維持します。</li>
	<li>ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 膜の円を削減 (材料表参照) ガラス底皿の内側に収まるサイズにします。70% にそれらを洗い流してエタノールそしてオートクレーブの dH2O. 定置滅菌と UV を伴う層流の下でドライ。滅菌シャーレにしてください。シングルユース。 注: PTFE ガス交換ができ、媒体の長期記録中に蒸発を防止する多孔質柔軟な膜であります。</li>
</ol>2. タイムラプス顕微鏡のセットアップ
メモ: 次のセットアップ タンデム逆スキャナー共焦点顕微鏡 (材料表参照) が装備されて共振型スキャナー (8,000 Hz)。システムには、共振型スキャナーと一緒に光毒性や退色を防止する高感度写真乗算器が含まれています。温度と湿度を制御顕微鏡環境チャンバ内顕微鏡のほとんどをカバーする (表を参照)。
<ol><li>ステージ上の湿度チャンバーを配置します。</li>
	<li>顕微鏡室 25 ° C と 80% の湿度に平衡に温度・湿度コント ローラーをオンにします。</li>
	<li>暗黒 (DD) で実験を実行するには、(ただし、顕微鏡室は不透明な材料の作られて) 不透明な布で顕微鏡環境商工会議所をカバーします。</li>
	<li>水浸漬の目的を使用して、目的の上に水浸マイクロ ディスペンサーを置き、タイムラプス イメージング中に一定の割合で水を分配するための Autoimmersion 目的のコント ローラー ソフトウェアとプロトコルをプログラムします。 注: 浸漬媒体の他のタイプが乾くと、長期のライブ イメージング、水浸漬水ディスペンサーまたは乾燥対物レンズと共に目標お勧めします。</li>
	<li>湿度チャンバー内のステージにシャーレ ホルダーを配置します。</li>
	<li>顕微鏡のソフトウェアを起動し、最初のダイアログ ボックスから共振型スキャナー モードを選択します。初期化の段階が表示されたら [ok] を選択します。関連するレーザー ラインに切り替えるにハードウェア構成を [設定] タブに移動します。</li>
	<li>双方向モードを選択し、設定の画像集録パラメーター XY パネルに取得] タブに移動します。 注: 記載されているイメージング セットアップ紹介 (図 2図 3および映画 1) は概日性特定の蛍光レポーターの発現を観察に最適です。次のパラメーターは、当社の仕様に合わせて選ばれた: 40 X 水浸対物レンズ、512 × 512 イメージ解像度の 8 X 線平均。マルチカラー イメージングを連続画像の取得が必要な場合 1 つの蛍光体と別の重複 (ここでは、黄色い蛍光蛋白質 (YFP) 放射とトマト励起重なる波長) の励起波長の発光波長。最速だし、Z スタックの取得中に時計ニューロンの移動はごくわずか、"スタック"の間にシーケンシャル モードを選択します。顕微鏡設定は各実験の目的に合わせて適応する必要があります。</li>
</ol>3. 幼虫脳培養のセットアップ
注: 脳外植体の埋め込みに郭清から全体の手順は、30 分程度かかります。
<ol><li>
文化フードの下で試薬の準備。
	<ol>
<li>トロンビンの因数を解凍し、(ステップ 3.3) 埋め込み手順まで室温で維持します。シングルユース。</li>
		<li>37 ° C でサムの因数をすばやく解凍し、単一の使用のための氷をします。</li>
		<li>10 mg/mL にフィブリノゲンの 10 mg の因数にサムを追加, 軽くフリックし、37 ° C 少なくとも 30 分と埋め込み手順 (ステップ 3.3) 中で孵化させなさい。シングルユース。 注: フィブリノゲン ソリューションよりも 2 h が孵化しないでそれは重合を開始。</li>
		<li>100 x の在庫ペニシリン-ストレプトマイシンの因数分解しなさい。2.5 ml 1 を含むサムのペニシリン-ストレプトマイシン (サム/抗生物質) x。室温で維持します。 注: ストア残り 100 x 在庫ペニシリン-ストレプトマイシン 4 ° C で 1 ヶ月。</li>
		<li>残りのサムから 500 μ L の因数を準備します。氷の上を保ちます。</li>
		<li>長期的なイメージングのためガラス底皿 (図 1 a) の下のプラスチックの部分にオートクレーブ真空グリースを塗布し、UV を伴う層流の下で滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
中枢神経系と腹側神経索の郭清。
	<ol>
<li>鉗子、2 倍の 70 %3 よくガラス解剖料理きれい江藤。4 井戸に DSS の 400 μ L と 1 つの井戸のサムの 400 μ L を注ぐ。氷の上を保ちます。</li>
		<li>幼虫を含むフライの中をえぐり、鉗子で非徘徊 3 齢幼虫 (L3) を選択します。引き続いて 2 DSS いっぱい井戸にそれらを洗い流してください。第三の DSS いっぱいよく幼虫に麻酔がかかる氷の上にしてください。 注: L3 続く 25 ° C で約 2 日間生理学的に関連する期間で脳を観察するには、非徘徊 L3 幼虫を使用にしました。時計ニューロン、l LNvs、DN3s などの他のサブグループが L3 ステージを徘徊で形成する開始、彼らは必ずしもサイクリングまだ (データは示されていない) ではないです。したがって、イメージすることが可能です (データは示されていない)、この段階で時計ニューロンをサイクリングがデータ分析用のものを開発してからすでに機能的幼虫時計ニューロンを慎重に区別することが重要。非徘徊 L3 は 25 ° C で産卵後約 4 から 4.5 日を表示概日リズムを勉強するため、このプロトコルを使用する同期 (同調) 開発の幼虫で 12/12 h LD サイクルの L3 幼虫を収集する前に 3 日間の 25 ° c。</li>
		<li>インサイド アウト手法27を利用した幼虫を洗浄に使用されていない 4 の DSS いっぱいのよく、微細鉗子で幼虫の脳を解剖します。<ol>
<li>簡単に、2 つの幼虫をカット、優しく鉗子のペアで口フックをピンチし、ロールアップ インサイド アウト脳を公開するので、鉗子の他のペアを使用して体の壁。すべての気管と体の残りの部分に接続する神経を切断して脳を解放します。</li>
			<li>(DSS では洗浄済み) 20 μ L ピペットと DSS の約 3 μ L で脳を吸引し、サムいっぱいよく分配します。最大 7 脳の手順を繰り返します。 注: 郭清は冷たい表面麻酔幼虫と冷やして脳を維持するは実行必要があります。たとえば、氷冷水を循環させるポンプに接続されている冷却ブロックに解剖皿を配置します。脳あたり解剖手順が 〜 30 秒。脳とそのまま腹側神経索に添付の目/触角成虫ディスクを保つことが重要です。これらの部分をちぎり、脳を損傷し、文化の質を減らします。また、空気に脳を露出を避けます。最初の脳を吸引する前に上下に切り裂かれた幼虫の部分を含む DSS ピペット先端の壁に付着してから脳を防ぐため。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 D マトリックスの脳外植体を埋め込むと取り付け (~ 20 分)。
	<ol>
<li>フィブリノゲン使用液 (フィブリノゲン最終濃度 ~3.3 mg/mL、脳あたり 10.5 μ L) で切り裂かれた脳をとおり水没します。</li>
		<li>(セクション 3.2.3 で使用される同じチップ) とサム/抗生物質の 3.5 μ L を吸い出しなさい。先端中 SAM/抗生物質を塗布せず同じピペット チップにも郭清から切り裂かれた脳を吸引します。</li>
		<li>脳と滅菌シャーレの蓋の中を調剤します。脳を含むドロップにサム/抗生物質の別の 3.5 μ L と暖かいフィブリノゲン/サム 10 mg/mL の溶液の 3.5 μ L を追加します。20 μ L ピペット チップでピペッティングで優しく脳周りのソリューションをミックスします。 注: この手順ではピペットではなく、鉗子を使用して脳を強調を回避できます。</li>
		<li>ドロップからフィブリノゲン作業ソリューションの 2 μ L、小さな円としてガラス底皿の上適用されます。トロンビンの 0.8 μ L を加え、ピペット チップを非常に迅速に混ぜます。フィブリノゲンはフィブリンに変換され、重合を開始します。</li>
		<li>フィブリノゲン作業ソリューション (ステップ 3.3.1) 鉗子のペアの間に座っている脳を取るし、フィブリンの白いマトリックス表示されるマトリックス上に配置します。ダウン (時計ニューロンをイメージング) の脳の前方側に合わせます。それをプッシュできるだけ近くにカバーのガラスに。フィブリン血栓は、フィブリンの層で構成されます。1 つのレイヤーを選択、マトリックスを外さず小さなと穏やかな動きで脳の上にそれを折る。<ol>
<li>脳を安定させるために血栓のさまざまな部分から 2 〜 3 倍を繰り返します。 注: 鉗子で脳を処理するときそれを乾燥もしくはそれに物理的なストレスを課すしないように注意します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>トロンビンのアクションを停止する埋め込み脳の上にサム/抗生物質の 20 μ L を追加します。</li>
		<li>残りの脳をマウントする手順を繰り返します。ガラス底皿の上 6 の脳に 5 までを埋め込むことが可能です。</li>
		<li>長期のライブ イメージング (ガラス部分) の内部の井戸にサム/抗生物質の 600 μ L を追加します。培地の上にカット済み PTFE 膜を置き、(3.1.5) (図 1 a) の下のプラスチックの部分に適用される真空グリースに固執します。</li>
		<li>薬理学的試金のためのサム/抗生物質 (図 1 b) 2 mL で皿を満たし。 培地の浸透圧は細胞の生存に重要なメモ: それは、培地の蒸発を避けるために非常に重要。したがって、長期的なイメージング実験のため PTFE 膜を培養皿を封印する必要は。短期的な実験のため膜のシールはありません限り、皿の中の 2 ml し、加湿チャンバで監視が必要。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 コマ画像の取得
<ol><li>ステージ上の湿度チャンバー内シャーレ ホルダーにガラスの下皿を配置します。</li>
	<li>Z スタック パネル [取得] タブに移動し、顕微鏡ソフトウェア (2 μ m × ~ 40図 2 図 3、およびムービー 1に示す実験) から z セクション手順を設定します。Coverslip と脳外植の体、coverslip の近くに、表面の終わりから最も遠い面 z スタックの先頭を設定します。脳の動きがごくわずか、先頭と z スタックの末尾に余分な z セクションを追加します。</li>
	<li>マーク ・ パネルとセットアップのマルチ ポジション イメージ取得を見つけるに移動します。40 × 対物をビューのフィールド内で 1 の脳半球に取り込むことができます。</li>
	<li>取得モード] パネルと [xyzt (z スタック時間経過) に移動します。時間獲得パネルに移動し、希望の時間間隔と周波数パラメーターを設定します。 注: は、所望の周波数でコマ撮り画像を取得します。注意してください結果を少ないサイクリング ニューロン長期ライブ イメージング (24 72 h) 経過時間 2 h より短い傾向があることおそらく神経細胞の生存率を少なくため。データ ボリュームは、もっと挑戦的なデータ分析とストレージは、画像取得増加率として展開します。</li>
</ol>5 短期ライブ イメージングと脳外植体薬理学的治療
注: 次の手順は、本質的と同じ長期的なイメージングが PTFE 膜を必要としません。青色光文化に化学物質を追加するときに脳を公開しないようにするには、顕微鏡を赤い光で暗い部屋で配置する必要があります。
<ol><li>時間獲得パネルに移動し、適切な時間間隔と新薬承認申請前にベースライン データを取得するためにスキャンの数を設定します。スキャンを開始します。</li>
	<li>スキャンの完了後、ベースライン、顕微鏡システムのスキャン ヘッドを持ち上げます。ステージ上の湿度コント ローラーの蓋を取り外し、非常に慎重にそれを移動することがなくガラス底皿のふたを外します。</li>
	<li>必要に応じて、適切な培地量を削除します。培地で実験的なソリューションを追加し、脳外植体に触れることがなく滅菌パスツール ピペットで非常にゆっくりと慎重にミックスします。 注: バス PDF のアプリケーション (10 %dmso) で 2 μ M PDF 原液を使用します。</li>
	<li>ガラス底皿および湿気のある室内には、スキャン ヘッドの蓋を取り付けます。使用している場合、顕微鏡室の周り黒い不透明な布を再配置します。</li>
	<li>かどうか、脳は、ライブ スキャン ・ モードの元の位置を確認します。必要に応じて調整します。</li>
	<li>時間獲得パネルに移動し、適切な時間間隔とスキャンの数を設定します。スキャンを開始します。 注: ここでコマ撮り画像で 10 h までのすべての時間をテストしました。</li>
</ol>

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで長期培養の幼虫の脳の蛍光タイムラプス顕微鏡法について述べる。このタイプの実験の成功によって異なります文化、健康などの複数の要因脳植、蛍光強度、記者、時間と空間分解能の信号対雑音比の固定方法と外植体へのアクセシビリティ。これらの要因は相互に排他的にすることができます。たとえば、文化の健康に影響するタイムラプス周波数の増加、脳外植体の固定化は、ガ?...

体内時計は、地球の 24 時間の自転によって生成された定期的な環境変化に適応する生物を助けます。インタロックされた転写翻訳フィード バック ループ一般種1にわたって概日時計の分子機械を根底します。概日時計回路構成の時計を含むニューロンの統合環境手がかり、明/暗 (LD) や毎日の茄多のリズムを調整するための温度サイクルなどによって伝えられる時刻の情報生理と行動プロセス2,3。分子リズム神経の入力と出力の調整は概日リズム回路ですが部分的にしか理解されて残るの操作にきわめて重要です。
ショウジョウバエの分子時計のコアでクロック (CLK/サイク) ヘテロダイマーをアクティブに期間(あたり) の転写と時代を超越した(ティム)。あたりとティムは、複合体を形成し、彼らは CLK/サイクとその結果自分の転写の転写活性を阻害する核を入力します。CLK/サイクを介した転写とあたりで抑圧の間の遅延が発生する転写と翻訳後の規制/ティムは、24 h の分子振動1,3,4年頃の世代を確保します。.これらの分子時計のフォームを含む約 150 のニューロン大人の行動の日周性制御回路は飛ぶ5です。くらい簡単で完全に機能的な概日リズム回路時計ニューロン - 5 腹側外側ニューロン (LNvs; 4 PDF 陽性 LNvs および以下を参照してください 1 つの PDF 負 LNv)、2 背側ニューロン 1 s (DN1s) と 2 の背側ニューロン 2 s (DN2s) - の 3 つのグループから成るが、幼虫の存在脳6,7。
シンプルな幼虫体内回路間神経回路と分子時計の相互作用を研究するための優れたモデルを提供しています。我々 は分子時計仕掛け幼虫体内回路で異なるクロック ニューロン群のダイナミクスを特徴付けるしようと新しく開発された蛍光レポーターあたり TDT、蛋白質および細胞内ロケーションごとのレベルを模倣を使用して8ですさらに、我々 神経レベル9,,1011で概日リズムの調節に 4 LNvs によって生成されるペプチド顔料分散係数 (PDF) の重要な役割を知ることには、直接を調べたい。分子時計の PDF の効果。このため、幼虫の脳のリズムは、複数日にわたるタイムラプス共焦点顕微鏡による外植体概日遺伝子の発現を監視する方法を開発しました。プロトコルは、TDT のあたりのレベルに及ぼす PDF または他の化合物をテストする薬理学的アッセイにも適応されました。したがって、適応は、脳培養を薬物のアプリケーションにアクセスできるように、時間的解像度は高く、短い期間のためのイメージングで構成されます。
発達段階別のショウジョウバエ脳の前のヴィヴォ文化はずっと以前に確立された12,13,14,15,16,17 ,18。これらのプロトコルは、さまざまな生物学的現象のイメージングのために使用されているに対し、それらのいくつかは単一セルの解像度で画像と互換性がないまたは数時間以上の文化をサポートしていません。ショウジョウバエの概日リズム神経細胞の長期のライブ イメージングを実行する代替方法など分子リズム19,20,21の生物発光イメージングの蛍光イメージング光シート顕微鏡22,23カルシウム インジケーター。生物発光イメージングは、高い時間分解能を達成できる、光シート顕微鏡は生体内イメージングのため適応することができますが、彼らは空間分解能に限られている、特殊な顕微鏡システムが必要があります。
ここで説明する方法は、複数日にわたる単一セルの解像度で全脳文化の蛍光信号を視覚化するために合わせて調整されます。この安易な汎用性の高い方法は、ショウジョウバエの神経生物学のさまざまな問題を研究する薬理学的実験、培養画像アダルト飛ぶ脳に合わせることができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &#34;suitable for insect cell culture&#34; whenever available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td>
			<td>BioConcept Ltd. Amimed</td>
			<td>2-01F30-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-654011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem (Merck)</td>
			<td>341573-1GM</td>
			<td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549</td>
			<td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td>
			<td>Chi Scientific</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
			<td>fisherscientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>200A Teflon FEP Film</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-well glass dissection dish</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps, size 5, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control chamber</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>The CUBE &#38; BOX temperature control system, custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top humidity controller</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x iterative deconvolution</td>
			<td>AutoQuant and Imaris software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

概日時計の回路は、昼/夜サイクルなどの環境手がかりと連動したリズミカルな行動および生理学的な出力を調整します。各細胞内で分子時計は、回路の動作に必要なリズミカルな神経機能の根底にある遺伝子発現の概日リズムを生成します。ペース メーカー細胞のさまざまなサブクラスにおける個々 の分子振動子と神経信号との相互作用の性質の調査概日時計回路の理解が得られます。培養ショウジョウバエ幼虫脳の時計ニューロンの分子時計仕掛けを監視する開発タイムラプス蛍光顕微鏡のアプローチを紹介します。このメソッドは、単一セルの解像度で、遺伝子にエンコードされた蛍光概記者のリズムの複数日記録をできます。このセットアップは、さまざまな化合物を分子時計のリアルタイム応答の詳細に解析する薬理学的操作と組み合わせることができます。概日リズムを超えて強力なショウジョウバエの遺伝学的手法との組み合わせでこの多目的メソッドは生きている脳組織の多様な神経細胞や分子プロセスを勉強する可能性を提供しています。

ここでは、幼虫の脳文化前のヴィヴォの記者式の PDF バス アプリケーションのライブ イメージング結果概蛍光レポーターの長期記録の代表的な結果を示す.
分子時計記者あたり TDT と UA mCD8::YFP Clk 856 gal4 (図 1) されたレーザ脳の同調時計ニューロン ドライバーによって駆動を表現する非?...

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Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス イメージングの概日リズムの分子リズムを監視するために最適化を確立することです。このメソッドの薬理学的アッセイへの応用を論じた。

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K ビュー.  University of Geneva. このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス イメージングの概日リズムの分子リズムを監視するために最適化を確立することです。このメソッドの薬理学的アッセイへの応用を論じた。

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Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

ライブの磁気共鳴分光法キイロショウジョウバエマジックアングルスピニングを使用して

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

神経科学

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3の幼虫分節神経の可視化 RD齢ショウジョウバエ幼虫準備

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...