Bu yöntem geliştirme başlangıç aşamasında destek ve Michael Rosbash onun rehberlik için teşekkür ederiz. Bu eser JST PRESTO program tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_149893 ve 31003A_169548), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-311194), Novartis Vakfı tıp Biyomedikal Araştırma (13A39) ve Cenevre Üniversitesi finanse edildi .

1. hazırlanması kültür başlık altında hisse senedi çözümleri
<ol><li>Ex vivo kültür larva beyin (başvuru24,25değiştirilmiş) için optimize edilmiş 1 x Schneider aktif orta (SAM) 400 mL hazırlamak (Tablo 1). Aliquot 5 mL ve flash için sıvı azot (LN2) Dondurma, 80 ° C'de - mağaza</li>
	<li>Sulandrarak 10 hisse senedi çözüm (başvuru26değiştirilmiş) x 1 x Dissecting tuzlu çözüm (DSS) hazırlayın (Tablo 2).</li>
	<li>10 mg ve mağaza bir kişilik 4 ° C'de aliquot fibrinojen. Dikkat: fibrinojen laminar akış, zararlı olduğu gibi eldivenler altında tartın.</li>
	<li>Trombin SAM hisse senedi çözümde hazırlamak (1500 NIH birim/mg) ve 10 µL için aliquot, flash LN2 ' dondurma ve-80 ° C'de tutmak Dikkat: zararlı olduğu gibi Trombin işlerken eldiven.</li>
	<li>100 aliquot hisse senedi çözüm penisilin-streptomisin x. -20 ° C'de tutmak</li>
	<li>Daireler politetrafloroetilin (PTFE) membran kesmek (malzeme tabloya bakın) cam alt çanak içine uygun boyutu. % 70'yıka alkol ve sonra autoclaved dH2O. Sterilize ve kuru UV laminar akış altında. Steril kabında tutun. Tek Kişilik Kullanım. Not: PTFE gaz değişimi sağlar ve uzun süreli kayıt sırasında buharlaşan orta engeller gözenekli bir esnek zar olduğunu.</li>
</ol>2. hızlandırılmış mikroskobu Kur
Not: Aşağıdaki Kurulum tandem ters tarayıcı confocal mikroskop için (malzeme tabloya bakın) bir rezonans tarayıcı (8000 Hz) ile donatılmıştır. Sistemde önleyen rezonans tarayıcı ile birlikte fototoksisite ve photobleaching son derece hassas fotoğraf-çarpanı dedektörü vardır. Sıcaklık ve nem kontrol edilir bir mikroskop çevre oda içinde ( Malzeme tabloyabakın) bu mikroskop çoğunu kapsar.
<ol><li>Bir sahne-üst nem odası yerleştirin.</li>
	<li>25 ° C ve % 80 nem mikroskop odasına equilibrate için sıcaklık ve nem denetleyicileri açın.</li>
	<li>Deneyler sürekli karanlık (DD) gerçekleştirmek için (mikroskop odası opak bir malzemeden yapılmış sürece) mikroskop çevre odası opak bir bezle Kapak.</li>
	<li>Eğer bir su-daldırma amacı istimal, su daldırma mikro dağıtıcısı amacı üstüne getirin ve bir iletişim kuralı ile hızlandırılmış görüntüleme sırasında sabit bir oranda su dağıtmak için Autoimmersion amaç denetleyicisi yazılım programı. Not: başka türde bir daldırma orta kuru olarak su-daldırma hedefleri ile birlikte su dağıtıcısı veya kuru objektif lens uzun vadeli canlı görüntüleme için tavsiye edilir.</li>
	<li>Bir Petri kabına tutucu içinde nem odası sahne yerleştirin.</li>
	<li>Denize indirmek mikroskop bilgisayar yazılımı ve rezonans tarayıcı kipi ilk diyalog kutusundan seçin. İstendiğinde sahne başlatmak için Tamam'ı seçin. Yapılandırma sekmesini ve donanım yapılandırma ilgili lazer satırlarında geçiş yapmak için gidin.</li>
	<li>Al sekmesini ve çift yönlü modu seçin ve görüntü alma parametrelerini ayarlamak için XY paneline gidin. Not: Burada sunulan açıklanan görüntüleme Kur (Şekil 2, şekil 3 ve film 1) belirli floresan gazetecilere sirkadiyen ifade gözlemlemek için optimize edilmiştir. Aşağıdaki parametreleri bizim özellikleri en iyi sığacak şekilde seçilmiştir: 40 X su daldırma amaç, 8 X satır ortalama 512 × 512 görüntü çözünürlüğü ile. Çok renkli görüntüleme için sıralı resim alma ne zaman gereklidir emisyon dalga boyu bir fluorophore ve başka bir örtüşme (burada, dalga boylarında, sarı floresan Protein (YFP) emisyon ve domates uyarma örtüşme) uyarma dalga boyu. En hızlısı ve saat nöronların hareketi Z fiş satın alma sırasında ihmal edilebilir "yığın arasında" sıralı modu seçin. Mikroskopi ayarları her denemenin amacı uygun şekilde adapte olmalıdır.</li>
</ol>3. Kurulum larva beyin Explant kültür
Not: tüm prosedürü diseksiyon üzerinden beyin explants gömmenin ~ 30 dakika sürer.
<ol><li>
Reaktifler bir kültür başlık altında hazırlanması.
	<ol>
<li>Trombin bir aliquot çözülme ve gömme adım kadar (3.3 adım) oda sıcaklığında tutmak. Tek Kişilik Kullanım.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde SAM bir aliquot 37 ° C'de erimek ve buz bir oda tutun.</li>
		<li>10 mg aliquot fibrinojen 10 mg/ml, SAM eklemek, yavaşça fiske ve 37 ° c en az 30 dakika ve gömme adım (Adım 3.3) sırasında kuluçkaya. Tek Kişilik Kullanım. Not: polimerize Başlarken fibrinojen çözüm daha çok 2 h kuluçkaya değil.</li>
		<li>Bir aliquot 100 x stokunun penisilin-streptomisin çözülme. 2,5 mL içeren 1 Sam hazırlamak penisilin-streptomisin (SAM/antibiyotik) x. Oda sıcaklığında tutmak. Not: Mağaza kalan 100 x stok penisilin-streptomisin 4 ° c ilâ 1 ay.</li>
		<li>500 µL bir aliquot kalan SAM'den hazırlayın. Buz üstünde tutun.</li>
		<li>Uzun vadeli görüntüleme için autoclaved vakum yağ cam alt çanak (şekil 1A) alt plastik bölümü için geçerli ve laminar akış UV altında sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Merkezi sinir sistemi ve ventral sinir kordonu diseksiyon.
	<ol>
<li>Temiz forseps ve 2 x 3-şey cam diseksiyon yemekleri ile % 70 alkol. DSS 400 µL 4 kuyu içine ve Sam bir iyi 400 µL dökün. Buz üstünde tutun.</li>
		<li>Larva içeren sinek orta kepçe ve Forseps ile sigara dolaşıp 3 INSTAR larva (L3) seçin. Art arda 2 wells DSS dolu yıka. Onları 3 DSS dolu iyi larvalar anesthetizes buz üzerinde tutun. Not: L3 25 ° C'de yaklaşık 2 gün sürer. Beyin fizyolojik ilgili süre içinde gözlemlemek için sigara dolaşıp L3 larva kullanmayı seçtiniz. L3 sahne dolaşıp oluşturulmasına izin saat nöronların, l-LNvs ve DN3s, gibi diğer alt gruplar başlamak ama mutlaka Bisiklete binme henüz (veri gösterilmez) değildir. Görüntüye mümkün olsa da bu nedenle, saat nöronlar bu aşamada (veri) gösterilmez, Bisiklete binme bu dikkatle zaten fonksiyonel larva saat nöronlar olanlar veri analizi için gelişmekte olan ayırt etmek önemlidir. Sigara dolaşıp L3 görünür yaklaşık 4-4.5 gün sonra yumurta 25 ° C'de döşeme Sirkadiyen ritim eğitimi için bu iletişim kuralını kullanmak için eşitleme (trene binmek) gelişmekte olan larvalar içinde 12 h/12 h LD L3 larva toplama önce 3 gün boyunca 25 ° C'de döngüleri.</li>
		<li>Hangi27Inside-out yöntemi kullanarak larva, durulama için kullanılmamış 4 DSS dolu iyi, iyi Forseps ile larva beynini incelemek.<ol>
<li>Kısaca, larva ikiye, yavaşça ağız kanca forseps bir çift ile pinch ve vücut böylece beyin açığa forseps, diğer çifti kullanarak duvar iç-out kadar rulo. Trakea ve vücudun geri kalanına ekleyin sinirler keserek beyin bedava.</li>
			<li>DSS yaklaşık 3 µL beyinde (DSS ile önceden durulanır) 20 µL pipet ile Aspire edin ve SAM dolu kuyuda dağıtmak. 7 beyin için yordamı yineleyin. Not: Diseksiyon anestezi larva ve soğutulmuş beyin tutmak için soğuk bir yüzeye yapılmalıdır. Örneğin, bir pompa buz soğuk su dolaşmaya bağlı bir soğutma bloğu üzerindeki diseksiyon çanak yerleştirin. Diseksiyon yordamı alır ~ 30 s beyin başına. Beyin ve bozulmamış ventral sinir kablosu bağlı göz/antennal Imaginal diskleri tutmak önemlidir. Bu parçalar kapalı yırtılma beyin hasar ve kültür kalitesini azaltır. Ayrıca, beynini havaya maruz kaçının. Daha önce aspirating ilk beyin, pipet disseke larvalar bölümlerini içeren DSS yukarı ve aşağı olarak beyin ucunu duvara yapışmasını önler.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beyin explants bir 3D matris ve montaj (~ 20 dk) gömme.
	<ol>
<li>Fibrinojen çalışma çözüm (fibrinojen son konsantrasyon ~3.3 mg/mL, beyin başına 10.5 µL) disseke beyinde aşağıdaki gibi batırılma:</li>
		<li>SAM/antibiyotik 3,5 µL (3.2.3 bölümünde kullanılan aynı tıp ile) Aspire edin. Diseksiyon de aynı pipet ucu içine bir disseke beyin ucu SAM/antibiyotik ortamda dağıtımı olmadan Aspire edin.</li>
		<li>Beyin ve steril Petri kabına kapağındaki orta dağıtmak. Başka bir 3,5 µL SAM/antibiyotik ve sıcak fibrinojen/SAM 10 mg/mL solüsyon 3,5 µL beyin içeren damla ekleyin. Beyin etrafında çözüm karışımı yavaşça 20 µL pipet ucu ile pipetting. Not: Bu adımda bir pipet forseps yerine kullanarak beyin vurgulayarak önler.</li>
		<li>Fibrinojen çalışma eriyik--dan belgili tanımlık damla 2 µL alacak ve cam alt tabak küçük bir daire olarak coverslip üzerinde uygulayabilirsiniz. Trombin 0.8 µL ve çok hızlı bir şekilde bir pipet ucu ile karıştırın. Fibrinojen fibrin için dönüştürülür ve polimerize başlar.</li>
		<li>Çözüm (Adım 3.3.1) forseps bir çift arasında çalışma fibrinojen oturuyor beyin almak ve fibrin beyaz bir matris görünür olduğunda matrisin üzerinde konumlandırın. Beyin ön tarafı aşağı (saat nöronlar için Imaging) gelecek şekilde yönlendirin. Mümkün olduğunca yakın kapak cama bastır. Fibrin pıhtısı fibrin katmanların oluşur. Bir katman seçin ve matrix ayırma olmadan küçük ve yumuşak hareketler ile beyin üzerine katlayın.<ol>
<li>2-3 kat beyin dengelemeye pıhtı farklı bölgelerinden gelen yineleyin. Not: beyin Forseps ile işlerken, Kuru ya da fiziksel bir stres empoze değil dikkatli olun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SAM/antibiyotik 20 µL Trombin eylemi durdurmak için katıştırılmış beyin üzerine ekleyin.</li>
		<li>Kalan beyin takmak için yordamı yineleyin. 5 cam alt çanak üzerinde 6 beyin için katıştırmak mümkündür.</li>
		<li>Uzun vadeli canlı görüntüleme için SAM/antibiyotik 600 µL iç kuyuda (cam bölümü) ekleyin. Önceden kesilmiş PTFE membran orta üzerine konumlandırın ve alt (3.1.5) (şekil 1A) plastik parçası üzerinde uygulanan vakum yağ için sopa.</li>
		<li>Farmakolojik deneyleri için çanak SAM/antibiyotik (şekil 1B) 2 mL ile doldurulması. Not: Orta osmolalite nöronlar canlılık için kritik olduğu gibi orta buharlaşma önlemek çok önemli. Bu nedenle, uzun vadeli görüntüleme deneyler için PTFE membran ile Kültür çanak mühür gereklidir. Oysa yemek orta 2 mL ile dolu ve oksijen odasında izlenen sürece kısa süreli deneyler için membran mühürleme gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hızlandırılmış resim alma
<ol><li>Sahne-üst nem odası içindeki Petri kabına kutusunda cam alt çanak yerleştirin.</li>
	<li>Z-yığın paneli edinme sekmesinde gidin ve z-bölüm adımları--dan mikroskop bilgisayar yazılımı (2 µm × ~ 40 Şekil 2 ve şekil 3ve film 1gösterilen deneylerde) ayarla. Bir z-yığın başlangıcı en uzak coverslip ve beyin explant coverslip yakın yüzey vasıl belgili tanımlık son uçak ayarlamak. Yine de beyin hareketleri yok denecek kadar azdır, başlangıç ve z-yığın sonunda ekstra z-bölümleri ekleyin.</li>
	<li>Mark & paneli ve set-up çok pozisyonlu resim alma bulmak için gidin. 40 X amacı ile 1 beyin yarıküre görüş alanı içinde yakalanabilir</li>
	<li>Toplama modu paneli ve seçin xyzt (z-yığın hızlandırılmış) gidin. Zaman edinme Masası'na gidin ve uygun zaman aralığı ve sıklık parametrelerini ayarlamak. Not: İstenen frekansı ile hızlandırılmış görüntüleri elde etmek. Nöronlar canlılığı azalttığı muhtemelen Not uzun vadeli canlı görüntüleme (24-72 saat) zaman atlamalı aralığı 2 h kısa ile daha az Bisiklete binme nöronlar, sonuçlarında eğilimindedir. Veri birimi görüntü edinme artar, daha zorlu veri analizi ve depolama kılan oranı genişletir.</li>
</ol>5. farmakolojik tedavisi beyin Explants vadeli canlı görüntüleme ile
Not: Aşağıdaki yordam aslında uzun vadeli görüntüleme için aynıdır ancak PTFE membran gerektirmez. Kimyasal kültür için eklendiğinde ışık mavi beyin kullanılmasını önlemek için mikroskop kırmızı ışık ile karanlık odada yer almalıdır.
<ol><li>Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve uyuşturucu uygulamadan önce temel verileri elde etmek için tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır.</li>
	<li>Sonra temel tarama tamamlandıktan, mikroskop sistem inceden inceye gözden geçirmek başkanı kaldır. Sahne-üst nem denetleyicisi kapağını kaldırmak ve çok dikkatli hareket ettirmeden cam alt çanak kapağı kaldırın.</li>
	<li>Kültür orta uygun miktarda kaldırın. Deneysel çözüm orta ve, dikkatli ve yavaşça, beyin explants dokunmadan bir steril Pasteur pipet ile karıştırın. Not: PDF banyo uygulanması için 2 µM PDF hisse senedi çözüm (% 10 DMSO içinde) kullanın.</li>
	<li>Cam alt çanak ve nemli odası ve tarama başın kapakları değiştirin. Kullanıyorsanız, siyah opak kumaş mikroskop odası yeniden konumlandırın.</li>
	<li>Beyni canlı tarama modu özgün konumlarında, olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse ayarlayın.</li>
	<li>Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır. Not: Burada en fazla 10 saat için her saat alınan hızlandırılmış görüntüleri test ettik.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit:+Pas+De+Deux+or+Tarantella?.">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li><li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clock+shop:+coupled+circadian+oscillators.">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li><li>Zhang, Y., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15+-+Molecular+and+neural+control+of+insects+circadian+rhythms.">Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms.</a> Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).</li><li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila.">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li><li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clocks+in+the+brain:+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila.">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li><li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila.">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li><li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock.">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560 (2017).</li><li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF.">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li><li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G+protein-coupled+receptor,+groom-of-PDF,+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior.">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li><li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors.">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culturing+of+whole,+developing+Drosophila+brains.">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling.">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699 (2014).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony.">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li><li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+entrainment+of+Drosophila's+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain.">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca(2)(+)+rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs.">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li><li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses.">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro.">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz kültürlü larva beyin uzun vadeli Floresans hızlandırılmış mikroskopi yöntemi nitelendirdi. Beyin explant, floresan yoğunluğu ve sinyal-gürültü oranı gazeteci, zamansal ve mekansal çözünürlüğü, immobilizasyon için yöntem Multipl faktörler, kültür, sağlık gibi bu tür deneyler başarısı bağlıdır ve erişilebilirlik için explant. Bu faktörler dışlayan olabilir. Örneğin, hızlandırılmış sıklığı artan kültür sağlık etkiler ve beyin explant immobilizasyon gaz deği...

Sirkadiyen saatler organizmaların dünya 24 h döndürme tarafından oluşturulan Periyodik çevresel değişikliklere uyum yardımcı. Hatırlayan translasyonel transkripsiyon geribesleme döngüsü yaygın tür1arasında moleküler makineler sirkadiyen saatler altında yatan. Sirkadiyen kalp pili devre oluşur saat içeren nöronlar entegre açık/koyu (LD) ve günlük bir bolluk ritimlerin yönetmek için sıcaklık döngüsü gibi çevre yardımlar ifade zaman günün bilgi fizyolojik ve davranışsal işlemleri2,3. Moleküler ritimleri nöronal girişleri ve çıkışları ile koordinasyon kritik sirkadiyen devre ama sadece kısmen anladım kalır çalışması için önemlidir.
Drosophilaiçinde moleküler saat özünde saat/döngüsü (CLK/CYC) heterodimerdir dönemi (başı), transkripsiyonu etkinleştirir ve zamansız (tim). BAŞINA ve TIM bir kompleks oluştururlar ve çekirdeği, nerede onlar transkripsiyon etkinlik CLK/CYC ve sonuç olarak kendi transkripsiyonu inhibe girin. Çoğu ve translasyon düzenlemeler CLK/CYC-aracılı transkripsiyon ve baskı başına arasında gecikmelere neden / TIM yaklaşık 24-h moleküler titreşimler1,3,4 nesil sağlanması, . Yaklaşık 150 nöronlar bu moleküler saat formu içeren bir devre yetişkin denetimi sirkadiyen davranışı için5uçar. Saat nöronların - 5 ventral yanal nöronlar (LNvs; 4 PDF-pozitif LNvs ve aşağıya bakın bir PDF-negatif LNv), 2 Dorsal nöron 1s (DN1s) ve 2 Dorsal nöron 2s (DN2s) - 3 grupları oluşan bir çok basit henüz tam olarak işlevsel sirkadiyen devre larva mevcuttur beyin6,7.
Basit larva sirkadiyen devre arası nöronal iletişim ve moleküler saat arasındaki etkileşimler eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Hangi düzeyde protein ve hücre altı konumu başına taklit eder, yeni geliştirilen floresan muhabirimiz başına-TDT, kullanarak farklı saat nöron gruplarının larva sirkadiyen devre moleküler saat dinamikleri karakterize istedi 8. Ayrıca, peptit pigment Dispergatör faktörü (PDF) rolünün sirkadiyen ritim nöronal düzeyde9,10,11düzenlenmesinde 4 LNvs tarafından üretilen bilmek, biz doğrudan incelemek istedim Moleküler saatler PDF etkisi. Bu amaçla, biz sirkadiyen gen ekspresyonu ritimleri larva beyin olarak birden fazla gün içinde tarafından hızlandırılmış confocal mikroskopi explant izlemek için bir yöntem geliştirdi. Protokol ayrıca PDF ya da diğer bileşikler etkisi başına TDT düzeyinde test etmek farmakolojik deneyleri için uyarlanmıştır. Böylece, beyin explant kültür ilaç uygulama erişilebilir hale getirme, zamansal çözünürlük artırmak ve daha kısa bir süre için Imaging uyum oluşur.
Ex vivo kültür, Drosophila beyinlerinin farklı gelişim aşamalarında,-si olmak be daha önce kurulan12,13,14,15,16,17 ,18. Bu protokoller çeşitli biyolojik olayları görüntüleme için kullanılmış olan ise, bazıları tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ile uyumlu olmayan veya kültür daha--dan birkaç saat için desteklemiyor. Moleküler ritimleri19,20,21 bioluminescence görüntüleme ve floresan görüntüleme sirkadiyen nöronların uzun vadeli canlı görüntüleme Drosophila içinde gerçekleştirmek için alternatif yöntemler içerir Kalsiyum göstergesi ile hafif levha mikroskobu22,23. Bioluminescence görüntüleme yüksek zamansal çözünürlük elde edebilirsiniz ve hafif levha mikroskobu vivo içinde görüntüleme için uyarlanabilir olabilir rağmen Uzaysal çözünürlük sınırlı olduğunu ve özel mikroskop sistemleri gerektirir.
Burada açıklanan yöntemi birden fazla gün içinde tüm beyin kültür tek hücreli çözünürlükte floresan sinyallerini görselleştirmek için hazırlanmıştır. Bu facile ve çok yönlü yöntemi kültürlü görüntü yetişkin sinek beyin için ve pek çok farklı sorun Drosophila Nörobiyoloji yılında çalışmaya farmakolojik deneyler için adapte olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &#34;suitable for insect cell culture&#34; whenever available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td>
			<td>BioConcept Ltd. Amimed</td>
			<td>2-01F30-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-654011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem (Merck)</td>
			<td>341573-1GM</td>
			<td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549</td>
			<td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td>
			<td>Chi Scientific</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
			<td>fisherscientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>200A Teflon FEP Film</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-well glass dissection dish</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps, size 5, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control chamber</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>The CUBE &#38; BOX temperature control system, custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top humidity controller</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x iterative deconvolution</td>
			<td>AutoQuant and Imaris software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

Sirkadiyen kalp pili devre gündüz/gece döngüsü gibi çevre yardımlar ile koordine ritmik davranış ve fizyolojik çıkış orchestrates. Her kalp pili nöron içinde moleküler saat sirkadiyen ritim ritmik nöronal işlevleri devre çalışması için gerekli altında yatan gen ekspresyonu oluşturur. Kalp pili nöronların farklı alt sınıfları içinde bireysel moleküler osilatörler ve nöronal sinyal ile etkileşimlerini özelliklerinin incelenmesi sirkadiyen kalp pili devre daha iyi bir anlayış verir. Burada, saat nöronların beynin kültürlü Drosophila larva moleküler saat izlemek için geliştirilen bir hızlandırılmış floresan mikroskopi yaklaşım mevcut. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte genetik olarak kodlanmış floresan sirkadiyen gazetecilere ritimler çok günlük kaydı sağlar. Bu kurulum yakından moleküler saat gerçek zamanlı yanıt çeşitli bileşikler olarak analiz etmek için farmakolojik manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Sirkadiyen ritim, çok amaçlı bu yöntem güçlü Drosophila genetik teknikleri ile birlikte canlı beyin dokusunun farklı nöronal veya moleküler işlemde çalışma imkanı sunmaktadır.

İşte, ex vivo larva beyin kültür ve PDF banyo uygulaması muhabir ifade üzerinde canlı görüntüleme sonuçlarını sirkadiyen floresan muhabir uzun süreli kayıt temsilcisi sonuçlarını göstermektedir.
Sigara dolaşıp L3 larva moleküler saat muhabir başına TDT ve UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (şekil 1 c) ld beyinlerinde entrained bir saat nöron sürücü tarafında...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K Görüntüleme.  University of Geneva. Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Video: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Nörobilim

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...