Name: single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Bu yöntem geliştirme başlangıç aşamasında destek ve Michael Rosbash onun rehberlik için teşekkür ederiz. Bu eser JST PRESTO program tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A_149893 ve 31003A_169548), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-311194), Novartis Vakfı tıp Biyomedikal Araştırma (13A39) ve Cenevre Üniversitesi finanse edildi .

1. hazırlanması kültür başlık altında hisse senedi çözümleri
<ol><li>Ex vivo kültür larva beyin (başvuru24,25değiştirilmiş) için optimize edilmiş 1 x Schneider aktif orta (SAM) 400 mL hazırlamak (Tablo 1). Aliquot 5 mL ve flash için sıvı azot (LN2) Dondurma, 80 ° C'de - mağaza</li>
	<li>Sulandrarak 10 hisse senedi çözüm (başvuru26değiştirilmiş) x 1 x Dissecting tuzlu çözüm (DSS) hazırlayın (Tablo 2).</li>
	<li>10 mg ve mağaza bir kişilik 4 ° C'de aliquot fibrinojen. Dikkat: fibrinojen laminar akış, zararlı olduğu gibi eldivenler altında tartın.</li>
	<li>Trombin SAM hisse senedi çözümde hazırlamak (1500 NIH birim/mg) ve 10 µL için aliquot, flash LN2 ' dondurma ve-80 ° C'de tutmak Dikkat: zararlı olduğu gibi Trombin işlerken eldiven.</li>
	<li>100 aliquot hisse senedi çözüm penisilin-streptomisin x. -20 ° C'de tutmak</li>
	<li>Daireler politetrafloroetilin (PTFE) membran kesmek (malzeme tabloya bakın) cam alt çanak içine uygun boyutu. % 70'yıka alkol ve sonra autoclaved dH2O. Sterilize ve kuru UV laminar akış altında. Steril kabında tutun. Tek Kişilik Kullanım. Not: PTFE gaz değişimi sağlar ve uzun süreli kayıt sırasında buharlaşan orta engeller gözenekli bir esnek zar olduğunu.</li>
</ol>2. hızlandırılmış mikroskobu Kur
Not: Aşağıdaki Kurulum tandem ters tarayıcı confocal mikroskop için (malzeme tabloya bakın) bir rezonans tarayıcı (8000 Hz) ile donatılmıştır. Sistemde önleyen rezonans tarayıcı ile birlikte fototoksisite ve photobleaching son derece hassas fotoğraf-çarpanı dedektörü vardır. Sıcaklık ve nem kontrol edilir bir mikroskop çevre oda içinde ( Malzeme tabloyabakın) bu mikroskop çoğunu kapsar.
<ol><li>Bir sahne-üst nem odası yerleştirin.</li>
	<li>25 ° C ve % 80 nem mikroskop odasına equilibrate için sıcaklık ve nem denetleyicileri açın.</li>
	<li>Deneyler sürekli karanlık (DD) gerçekleştirmek için (mikroskop odası opak bir malzemeden yapılmış sürece) mikroskop çevre odası opak bir bezle Kapak.</li>
	<li>Eğer bir su-daldırma amacı istimal, su daldırma mikro dağıtıcısı amacı üstüne getirin ve bir iletişim kuralı ile hızlandırılmış görüntüleme sırasında sabit bir oranda su dağıtmak için Autoimmersion amaç denetleyicisi yazılım programı. Not: başka türde bir daldırma orta kuru olarak su-daldırma hedefleri ile birlikte su dağıtıcısı veya kuru objektif lens uzun vadeli canlı görüntüleme için tavsiye edilir.</li>
	<li>Bir Petri kabına tutucu içinde nem odası sahne yerleştirin.</li>
	<li>Denize indirmek mikroskop bilgisayar yazılımı ve rezonans tarayıcı kipi ilk diyalog kutusundan seçin. İstendiğinde sahne başlatmak için Tamam'ı seçin. Yapılandırma sekmesini ve donanım yapılandırma ilgili lazer satırlarında geçiş yapmak için gidin.</li>
	<li>Al sekmesini ve çift yönlü modu seçin ve görüntü alma parametrelerini ayarlamak için XY paneline gidin. Not: Burada sunulan açıklanan görüntüleme Kur (Şekil 2, şekil 3 ve film 1) belirli floresan gazetecilere sirkadiyen ifade gözlemlemek için optimize edilmiştir. Aşağıdaki parametreleri bizim özellikleri en iyi sığacak şekilde seçilmiştir: 40 X su daldırma amaç, 8 X satır ortalama 512 × 512 görüntü çözünürlüğü ile. Çok renkli görüntüleme için sıralı resim alma ne zaman gereklidir emisyon dalga boyu bir fluorophore ve başka bir örtüşme (burada, dalga boylarında, sarı floresan Protein (YFP) emisyon ve domates uyarma örtüşme) uyarma dalga boyu. En hızlısı ve saat nöronların hareketi Z fiş satın alma sırasında ihmal edilebilir "yığın arasında" sıralı modu seçin. Mikroskopi ayarları her denemenin amacı uygun şekilde adapte olmalıdır.</li>
</ol>3. Kurulum larva beyin Explant kültür
Not: tüm prosedürü diseksiyon üzerinden beyin explants gömmenin ~ 30 dakika sürer.
<ol><li>
Reaktifler bir kültür başlık altında hazırlanması.
	<ol>
<li>Trombin bir aliquot çözülme ve gömme adım kadar (3.3 adım) oda sıcaklığında tutmak. Tek Kişilik Kullanım.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde SAM bir aliquot 37 ° C'de erimek ve buz bir oda tutun.</li>
		<li>10 mg aliquot fibrinojen 10 mg/ml, SAM eklemek, yavaşça fiske ve 37 ° c en az 30 dakika ve gömme adım (Adım 3.3) sırasında kuluçkaya. Tek Kişilik Kullanım. Not: polimerize Başlarken fibrinojen çözüm daha çok 2 h kuluçkaya değil.</li>
		<li>Bir aliquot 100 x stokunun penisilin-streptomisin çözülme. 2,5 mL içeren 1 Sam hazırlamak penisilin-streptomisin (SAM/antibiyotik) x. Oda sıcaklığında tutmak. Not: Mağaza kalan 100 x stok penisilin-streptomisin 4 ° c ilâ 1 ay.</li>
		<li>500 µL bir aliquot kalan SAM'den hazırlayın. Buz üstünde tutun.</li>
		<li>Uzun vadeli görüntüleme için autoclaved vakum yağ cam alt çanak (şekil 1A) alt plastik bölümü için geçerli ve laminar akış UV altında sterilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Merkezi sinir sistemi ve ventral sinir kordonu diseksiyon.
	<ol>
<li>Temiz forseps ve 2 x 3-şey cam diseksiyon yemekleri ile % 70 alkol. DSS 400 µL 4 kuyu içine ve Sam bir iyi 400 µL dökün. Buz üstünde tutun.</li>
		<li>Larva içeren sinek orta kepçe ve Forseps ile sigara dolaşıp 3 INSTAR larva (L3) seçin. Art arda 2 wells DSS dolu yıka. Onları 3 DSS dolu iyi larvalar anesthetizes buz üzerinde tutun. Not: L3 25 ° C'de yaklaşık 2 gün sürer. Beyin fizyolojik ilgili süre içinde gözlemlemek için sigara dolaşıp L3 larva kullanmayı seçtiniz. L3 sahne dolaşıp oluşturulmasına izin saat nöronların, l-LNvs ve DN3s, gibi diğer alt gruplar başlamak ama mutlaka Bisiklete binme henüz (veri gösterilmez) değildir. Görüntüye mümkün olsa da bu nedenle, saat nöronlar bu aşamada (veri) gösterilmez, Bisiklete binme bu dikkatle zaten fonksiyonel larva saat nöronlar olanlar veri analizi için gelişmekte olan ayırt etmek önemlidir. Sigara dolaşıp L3 görünür yaklaşık 4-4.5 gün sonra yumurta 25 ° C'de döşeme Sirkadiyen ritim eğitimi için bu iletişim kuralını kullanmak için eşitleme (trene binmek) gelişmekte olan larvalar içinde 12 h/12 h LD L3 larva toplama önce 3 gün boyunca 25 ° C'de döngüleri.</li>
		<li>Hangi27Inside-out yöntemi kullanarak larva, durulama için kullanılmamış 4 DSS dolu iyi, iyi Forseps ile larva beynini incelemek.<ol>
<li>Kısaca, larva ikiye, yavaşça ağız kanca forseps bir çift ile pinch ve vücut böylece beyin açığa forseps, diğer çifti kullanarak duvar iç-out kadar rulo. Trakea ve vücudun geri kalanına ekleyin sinirler keserek beyin bedava.</li>
			<li>DSS yaklaşık 3 µL beyinde (DSS ile önceden durulanır) 20 µL pipet ile Aspire edin ve SAM dolu kuyuda dağıtmak. 7 beyin için yordamı yineleyin. Not: Diseksiyon anestezi larva ve soğutulmuş beyin tutmak için soğuk bir yüzeye yapılmalıdır. Örneğin, bir pompa buz soğuk su dolaşmaya bağlı bir soğutma bloğu üzerindeki diseksiyon çanak yerleştirin. Diseksiyon yordamı alır ~ 30 s beyin başına. Beyin ve bozulmamış ventral sinir kablosu bağlı göz/antennal Imaginal diskleri tutmak önemlidir. Bu parçalar kapalı yırtılma beyin hasar ve kültür kalitesini azaltır. Ayrıca, beynini havaya maruz kaçının. Daha önce aspirating ilk beyin, pipet disseke larvalar bölümlerini içeren DSS yukarı ve aşağı olarak beyin ucunu duvara yapışmasını önler.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beyin explants bir 3D matris ve montaj (~ 20 dk) gömme.
	<ol>
<li>Fibrinojen çalışma çözüm (fibrinojen son konsantrasyon ~3.3 mg/mL, beyin başına 10.5 µL) disseke beyinde aşağıdaki gibi batırılma:</li>
		<li>SAM/antibiyotik 3,5 µL (3.2.3 bölümünde kullanılan aynı tıp ile) Aspire edin. Diseksiyon de aynı pipet ucu içine bir disseke beyin ucu SAM/antibiyotik ortamda dağıtımı olmadan Aspire edin.</li>
		<li>Beyin ve steril Petri kabına kapağındaki orta dağıtmak. Başka bir 3,5 µL SAM/antibiyotik ve sıcak fibrinojen/SAM 10 mg/mL solüsyon 3,5 µL beyin içeren damla ekleyin. Beyin etrafında çözüm karışımı yavaşça 20 µL pipet ucu ile pipetting. Not: Bu adımda bir pipet forseps yerine kullanarak beyin vurgulayarak önler.</li>
		<li>Fibrinojen çalışma eriyik--dan belgili tanımlık damla 2 µL alacak ve cam alt tabak küçük bir daire olarak coverslip üzerinde uygulayabilirsiniz. Trombin 0.8 µL ve çok hızlı bir şekilde bir pipet ucu ile karıştırın. Fibrinojen fibrin için dönüştürülür ve polimerize başlar.</li>
		<li>Çözüm (Adım 3.3.1) forseps bir çift arasında çalışma fibrinojen oturuyor beyin almak ve fibrin beyaz bir matris görünür olduğunda matrisin üzerinde konumlandırın. Beyin ön tarafı aşağı (saat nöronlar için Imaging) gelecek şekilde yönlendirin. Mümkün olduğunca yakın kapak cama bastır. Fibrin pıhtısı fibrin katmanların oluşur. Bir katman seçin ve matrix ayırma olmadan küçük ve yumuşak hareketler ile beyin üzerine katlayın.<ol>
<li>2-3 kat beyin dengelemeye pıhtı farklı bölgelerinden gelen yineleyin. Not: beyin Forseps ile işlerken, Kuru ya da fiziksel bir stres empoze değil dikkatli olun.</li>
		</ol>
</li>
		<li>SAM/antibiyotik 20 µL Trombin eylemi durdurmak için katıştırılmış beyin üzerine ekleyin.</li>
		<li>Kalan beyin takmak için yordamı yineleyin. 5 cam alt çanak üzerinde 6 beyin için katıştırmak mümkündür.</li>
		<li>Uzun vadeli canlı görüntüleme için SAM/antibiyotik 600 µL iç kuyuda (cam bölümü) ekleyin. Önceden kesilmiş PTFE membran orta üzerine konumlandırın ve alt (3.1.5) (şekil 1A) plastik parçası üzerinde uygulanan vakum yağ için sopa.</li>
		<li>Farmakolojik deneyleri için çanak SAM/antibiyotik (şekil 1B) 2 mL ile doldurulması. Not: Orta osmolalite nöronlar canlılık için kritik olduğu gibi orta buharlaşma önlemek çok önemli. Bu nedenle, uzun vadeli görüntüleme deneyler için PTFE membran ile Kültür çanak mühür gereklidir. Oysa yemek orta 2 mL ile dolu ve oksijen odasında izlenen sürece kısa süreli deneyler için membran mühürleme gerekli değildir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hızlandırılmış resim alma
<ol><li>Sahne-üst nem odası içindeki Petri kabına kutusunda cam alt çanak yerleştirin.</li>
	<li>Z-yığın paneli edinme sekmesinde gidin ve z-bölüm adımları--dan mikroskop bilgisayar yazılımı (2 µm × ~ 40 Şekil 2 ve şekil 3ve film 1gösterilen deneylerde) ayarla. Bir z-yığın başlangıcı en uzak coverslip ve beyin explant coverslip yakın yüzey vasıl belgili tanımlık son uçak ayarlamak. Yine de beyin hareketleri yok denecek kadar azdır, başlangıç ve z-yığın sonunda ekstra z-bölümleri ekleyin.</li>
	<li>Mark & paneli ve set-up çok pozisyonlu resim alma bulmak için gidin. 40 X amacı ile 1 beyin yarıküre görüş alanı içinde yakalanabilir</li>
	<li>Toplama modu paneli ve seçin xyzt (z-yığın hızlandırılmış) gidin. Zaman edinme Masası'na gidin ve uygun zaman aralığı ve sıklık parametrelerini ayarlamak. Not: İstenen frekansı ile hızlandırılmış görüntüleri elde etmek. Nöronlar canlılığı azalttığı muhtemelen Not uzun vadeli canlı görüntüleme (24-72 saat) zaman atlamalı aralığı 2 h kısa ile daha az Bisiklete binme nöronlar, sonuçlarında eğilimindedir. Veri birimi görüntü edinme artar, daha zorlu veri analizi ve depolama kılan oranı genişletir.</li>
</ol>5. farmakolojik tedavisi beyin Explants vadeli canlı görüntüleme ile
Not: Aşağıdaki yordam aslında uzun vadeli görüntüleme için aynıdır ancak PTFE membran gerektirmez. Kimyasal kültür için eklendiğinde ışık mavi beyin kullanılmasını önlemek için mikroskop kırmızı ışık ile karanlık odada yer almalıdır.
<ol><li>Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve uyuşturucu uygulamadan önce temel verileri elde etmek için tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır.</li>
	<li>Sonra temel tarama tamamlandıktan, mikroskop sistem inceden inceye gözden geçirmek başkanı kaldır. Sahne-üst nem denetleyicisi kapağını kaldırmak ve çok dikkatli hareket ettirmeden cam alt çanak kapağı kaldırın.</li>
	<li>Kültür orta uygun miktarda kaldırın. Deneysel çözüm orta ve, dikkatli ve yavaşça, beyin explants dokunmadan bir steril Pasteur pipet ile karıştırın. Not: PDF banyo uygulanması için 2 µM PDF hisse senedi çözüm (% 10 DMSO içinde) kullanın.</li>
	<li>Cam alt çanak ve nemli odası ve tarama başın kapakları değiştirin. Kullanıyorsanız, siyah opak kumaş mikroskop odası yeniden konumlandırın.</li>
	<li>Beyni canlı tarama modu özgün konumlarında, olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse ayarlayın.</li>
	<li>Zaman edinme Masası'na gidin ve istediğiniz zaman aralığını ve tarama sayısını ayarlayın. Tarama başlatır. Not: Burada en fazla 10 saat için her saat alınan hızlandırılmış görüntüleri test ettik.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit:+Pas+De+Deux+or+Tarantella?.">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li><li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clock+shop:+coupled+circadian+oscillators.">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li><li>Zhang, Y., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15+-+Molecular+and+neural+control+of+insects+circadian+rhythms.">Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms.</a> Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).</li><li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila.">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li><li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clocks+in+the+brain:+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila.">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li><li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila.">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li><li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock.">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560 (2017).</li><li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF.">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li><li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G+protein-coupled+receptor,+groom-of-PDF,+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior.">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li><li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors.">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culturing+of+whole,+developing+Drosophila+brains.">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling.">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699 (2014).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony.">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li><li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+entrainment+of+Drosophila's+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain.">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca(2)(+)+rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs.">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li><li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses.">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro.">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada biz kültürlü larva beyin uzun vadeli Floresans hızlandırılmış mikroskopi yöntemi nitelendirdi. Beyin explant, floresan yoğunluğu ve sinyal-gürültü oranı gazeteci, zamansal ve mekansal çözünürlüğü, immobilizasyon için yöntem Multipl faktörler, kültür, sağlık gibi bu tür deneyler başarısı bağlıdır ve erişilebilirlik için explant. Bu faktörler dışlayan olabilir. Örneğin, hızlandırılmış sıklığı artan kültür sağlık etkiler ve beyin explant immobilizasyon gaz deği...

Sirkadiyen saatler organizmaların dünya 24 h döndürme tarafından oluşturulan Periyodik çevresel değişikliklere uyum yardımcı. Hatırlayan translasyonel transkripsiyon geribesleme döngüsü yaygın tür1arasında moleküler makineler sirkadiyen saatler altında yatan. Sirkadiyen kalp pili devre oluşur saat içeren nöronlar entegre açık/koyu (LD) ve günlük bir bolluk ritimlerin yönetmek için sıcaklık döngüsü gibi çevre yardımlar ifade zaman günün bilgi fizyolojik ve davranışsal işlemleri2,3. Moleküler ritimleri nöronal girişleri ve çıkışları ile koordinasyon kritik sirkadiyen devre ama sadece kısmen anladım kalır çalışması için önemlidir.
Drosophilaiçinde moleküler saat özünde saat/döngüsü (CLK/CYC) heterodimerdir dönemi (başı), transkripsiyonu etkinleştirir ve zamansız (tim). BAŞINA ve TIM bir kompleks oluştururlar ve çekirdeği, nerede onlar transkripsiyon etkinlik CLK/CYC ve sonuç olarak kendi transkripsiyonu inhibe girin. Çoğu ve translasyon düzenlemeler CLK/CYC-aracılı transkripsiyon ve baskı başına arasında gecikmelere neden / TIM yaklaşık 24-h moleküler titreşimler1,3,4 nesil sağlanması, . Yaklaşık 150 nöronlar bu moleküler saat formu içeren bir devre yetişkin denetimi sirkadiyen davranışı için5uçar. Saat nöronların - 5 ventral yanal nöronlar (LNvs; 4 PDF-pozitif LNvs ve aşağıya bakın bir PDF-negatif LNv), 2 Dorsal nöron 1s (DN1s) ve 2 Dorsal nöron 2s (DN2s) - 3 grupları oluşan bir çok basit henüz tam olarak işlevsel sirkadiyen devre larva mevcuttur beyin6,7.
Basit larva sirkadiyen devre arası nöronal iletişim ve moleküler saat arasındaki etkileşimler eğitim için mükemmel bir model sunuyor. Hangi düzeyde protein ve hücre altı konumu başına taklit eder, yeni geliştirilen floresan muhabirimiz başına-TDT, kullanarak farklı saat nöron gruplarının larva sirkadiyen devre moleküler saat dinamikleri karakterize istedi 8. Ayrıca, peptit pigment Dispergatör faktörü (PDF) rolünün sirkadiyen ritim nöronal düzeyde9,10,11düzenlenmesinde 4 LNvs tarafından üretilen bilmek, biz doğrudan incelemek istedim Moleküler saatler PDF etkisi. Bu amaçla, biz sirkadiyen gen ekspresyonu ritimleri larva beyin olarak birden fazla gün içinde tarafından hızlandırılmış confocal mikroskopi explant izlemek için bir yöntem geliştirdi. Protokol ayrıca PDF ya da diğer bileşikler etkisi başına TDT düzeyinde test etmek farmakolojik deneyleri için uyarlanmıştır. Böylece, beyin explant kültür ilaç uygulama erişilebilir hale getirme, zamansal çözünürlük artırmak ve daha kısa bir süre için Imaging uyum oluşur.
Ex vivo kültür, Drosophila beyinlerinin farklı gelişim aşamalarında,-si olmak be daha önce kurulan12,13,14,15,16,17 ,18. Bu protokoller çeşitli biyolojik olayları görüntüleme için kullanılmış olan ise, bazıları tek hücreli çözünürlükte görüntüleme ile uyumlu olmayan veya kültür daha--dan birkaç saat için desteklemiyor. Moleküler ritimleri19,20,21 bioluminescence görüntüleme ve floresan görüntüleme sirkadiyen nöronların uzun vadeli canlı görüntüleme Drosophila içinde gerçekleştirmek için alternatif yöntemler içerir Kalsiyum göstergesi ile hafif levha mikroskobu22,23. Bioluminescence görüntüleme yüksek zamansal çözünürlük elde edebilirsiniz ve hafif levha mikroskobu vivo içinde görüntüleme için uyarlanabilir olabilir rağmen Uzaysal çözünürlük sınırlı olduğunu ve özel mikroskop sistemleri gerektirir.
Burada açıklanan yöntemi birden fazla gün içinde tüm beyin kültür tek hücreli çözünürlükte floresan sinyallerini görselleştirmek için hazırlanmıştır. Bu facile ve çok yönlü yöntemi kültürlü görüntü yetişkin sinek beyin için ve pek çok farklı sorun Drosophila Nörobiyoloji yılında çalışmaya farmakolojik deneyler için adapte olabilir.

<table><tbody><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &quot;suitable for insect cell culture&quot; whenever available</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&amp;minus;)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Fumaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Ketoglutaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E&amp;amp;K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td></tr><tr><td>PDF, NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon FEP Film</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Three-well glass dissection dish</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, size 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature control chamber</td><td>Life Imaging Services</td><td>The CUBE &amp;amp; BOX temperature control system, custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top humidity controller</td><td>Life Imaging Services</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td><td>ImageJ software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x iterative deconvolution</td><td>AutoQuant and Imaris software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

Sirkadiyen kalp pili devre gündüz/gece döngüsü gibi çevre yardımlar ile koordine ritmik davranış ve fizyolojik çıkış orchestrates. Her kalp pili nöron içinde moleküler saat sirkadiyen ritim ritmik nöronal işlevleri devre çalışması için gerekli altında yatan gen ekspresyonu oluşturur. Kalp pili nöronların farklı alt sınıfları içinde bireysel moleküler osilatörler ve nöronal sinyal ile etkileşimlerini özelliklerinin incelenmesi sirkadiyen kalp pili devre daha iyi bir anlayış verir. Burada, saat nöronların beynin kültürlü Drosophila larva moleküler saat izlemek için geliştirilen bir hızlandırılmış floresan mikroskopi yaklaşım mevcut. Bu yöntem, tek hücreli çözünürlükte genetik olarak kodlanmış floresan sirkadiyen gazetecilere ritimler çok günlük kaydı sağlar. Bu kurulum yakından moleküler saat gerçek zamanlı yanıt çeşitli bileşikler olarak analiz etmek için farmakolojik manipülasyonlar ile kombine edilebilir. Sirkadiyen ritim, çok amaçlı bu yöntem güçlü Drosophila genetik teknikleri ile birlikte canlı beyin dokusunun farklı nöronal veya moleküler işlemde çalışma imkanı sunmaktadır.

İşte, ex vivo larva beyin kültür ve PDF banyo uygulaması muhabir ifade üzerinde canlı görüntüleme sonuçlarını sirkadiyen floresan muhabir uzun süreli kayıt temsilcisi sonuçlarını göstermektedir.
Sigara dolaşıp L3 larva moleküler saat muhabir başına TDT ve UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (şekil 1 c) ld beyinlerinde entrained bir saat nöron sürücü tarafında...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K Görüntüleme.  University of Geneva. Bu iletişim kuralının amacı ile uzun vadeli Floresans hızlandırılmış görüntüleme moleküler sirkadiyen ritimler izlemek için en iyi duruma getirilmiş ex vivo Drosophila larva beyin kültür kurmaktır. Bu yöntem uygulamaya farmakolojik deneyleri de ele alınmıştır.

Video: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Nörobilim

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Biyoloji

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme

Canlı Görüntüleme

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme