עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית עבור חוקרים צעירים מכובד (81625002), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81470389, 81270282, 81601238), התוכנית של שנגחאי אקדמי למחקר מנהיג (18XD1402400), שנגחאי העירוני חינוך הנציבות Gaofeng ברפואה קלינית גרנט תמיכה (20152209), מרכז פיתוח בית החולים של שנגחאי Shenkang (16CR3034A), אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי (YG2013MS42), שנגחאי ג'יאו טונג אוניברסיטת בית הספר לרפואה (15ZH1003 ו- 14XJ10019), שנגחאי שיט התוכנית (18YF1413000), ואת התוכנית חדשנות לתואר שני במכללה לרפואה Bengbu (Byycx1722). אנו מודים ד ר Erhe גאו לעזרתו קודמים במעבדה שלנו.

כל הניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של הבריאות הנחיות על שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעל חיים של המכון. עכברים C57BL/6J זכר (בגילאי 8-10 שבועות) שימשו כל הניסויים. עכברים שוכנו בתנאים ללא הפתוגן ב 24 ° C ± 4 ° C, תחת מחזור/כהה 12-h, עם גישה חופשית מים ומזון.
1. הכנת אדנו פתרון
<ol><li>עם ההגעה של הפתרון אדנו מטוהרים, לאחסן את הפתרון במקפיא-80 ° C. הערה: הזריקה אדנו בוצעה בעכברים קיימא. כדי להבטיח העקרות של וקטור אדנו, אדנו (לוציפראז קידוד, VDR או shRNA מיקוד VDR) הוכנו וטיהרו מסחרית9,10.</li>
	<li>ביום של הניתוח, להוציא את הפתרון אדנו מטוהרים (3 x 1010 פלאק ויוצרים יחידות [pfu] /mL) מהמקפיא-80 ° C, להפשיר פתרון וקטור אדנו על קרח.</li>
	<li>לשים על facemask כפפות סטריליות, שמלת סטרילי.</li>
	<li>הכנת 50-µL של מזרק המילטון אשר יש עברו עיקור כפוי יום לפני הניתוח. הערה: עבור עיקור, המזרק המילטון היה עטוף גזה והניח מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה. המצב של "עיקור עבור המוצק" נבחר והחלה עיקור היה על-ידי לחיצה על כפתור "התחל".</li>
	<li>לאחר מלאה הפשרתו של הפתרון אדנו מטוהרים, לרסס את הצינור המכיל אדנו פתרון עם 75% אתנול, להעביר את הפתרון אדנו לתוך תא סטרילי למינארי.</li>
	<li>ב תא סטרילי למינארי, תשאף 50 µL אדנו פתרון באמצעות המזרק המילטון ללא מחט, ואחריו מצורף של מחט 30 G כדי המזרק המילטון.</li>
	<li>. תחזיק את המזרק עם המחט 30 G כלפי מעלה, דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק עד המחט מתמלא פתרון אדנו (אושר על ידי הופעת הטיפות הפתרון הראשון מהקצה מחט). הערה: זה לוקח כ 45 µL פתרון כדי למלא את המחט 30 G, אז עכשיו כמעט אין פתרון מוצגת במזרק.</li>
	<li>משתמשת במזרק מוכן לעיל לרוקן בזהירות אחר פתרון אדנו µL 30 ולמקם את המזרק רצ'ט באופן רופף על הקרח לשימוש עוקבות.</li>
</ol>2. הרדמה והכנות פעיל
<ol><li>להוסיף 20 מ"ל איזופלוריין לתוך מכשיר אידוי איזופלוריין, והתחבר מאדה איזופלוריין את מיכל חמצן.</li>
	<li>פתח את השסתום. ותן את החמצן זרימת ממיכל חמצן מאדה איזופלוריין. לשמור על קצב הזרימה חמצן ב 2 ל'/דקה באמצעות צג זרימת חמצן במאדה איזופלוריין.</li>
	<li>לגרום הרדמה של העכבר עם 4% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) למשך 2 דקות בתוך כלוב מפלסטיק מחובר מאדה איזופלוריין.</li>
	<li>להוציא את העכבר anesthetized מן הכלוב פלסטיק, לאבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה ב תא סטרילי למינארי ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) באמצעות קונוס האף.</li>
	<li>לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.</li>
	<li>קרם עיניים סטרילי חלות על כל עין כדי להגן על הקרנית מפני ייבוש.</li>
	<li>מגלח את החזה והבטן העליונה. להחיל קרם depilatory הנמכרים באתר מגולח עבור מינימלית 1 להסיר את הקרם depilatory, שנותרו פרווה עם פדים רטוב.</li>
	<li>לחטא באתר כירורגית (החלק התחתון השמאלי של החזה) עם 3 קרצוף של חיטוי יוד-chlorhexidine מבוסס (למשל entoiodine). מכסים באתר כירורגית עם תלוי סטרילי.</li>
</ol>3. Intramyocardial הזרקה של אדנו בלב העכבר
<ol><li>. תוריד את הכפפות ולהניח על זוג חדש של כפפות סטריליות.</li>
	<li>לחטא מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים, זוג מספריים כירורגיים, ולחץ בעל מחט ביום שלפני הניתוח בקול רם טמפרטורה/גבוהה מעקר (ראה הערה שלב 1.4).</li>
	<li>עושים חתך בעור 0.5 ס מ לאורך הקו המחבר בין מצאתי את בית השחי. בלשון בוטה לנתח את החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן עם מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים.</li>
	<li>לחשוף את בצלעות על ידי מפסק את החזה הגדולים ואת שרירי החזה משנית. . נקבי ופתח לחלל הבין-צלעי הרביעי (או לחלל הבין-צלעי הרחב באמצעות התבוננות) עם עוצר דימום מיקרו-יתושים.</li>
	<li>לדחוף הלב לכיוון החתך כדי להחצין את הלב עם האצבע המורה. של היד-הדומיננטי בהקשת בעדינות כנגד הצד הימני של הקיר החזה.</li>
	<li>בעדינות לאבטח את הלב מוחצן עם האצבע והאגודל של היד האחרת.</li>
	<li>להזריק סך של 30 µL אדנו פתרון לתוך שריר הלב של החדר השמאלי בשלושה אתרים (הגחון, הגבי ו לרוחב הקיר של החדר השמאלי) באמצעות המזרק המילטון מלא עם אדנו (איור 1C) עם היד הדומיננטית.</li>
	<li>לאחר סיום הזרקה, מיד מקום הלב בחזרה לחלל intrathoracic.</li>
	<li>לפנות באופן ידני את האוויר בחלל intrathoracic בהקשת קיר החזה בעדינות לכיוון מקום החתך בעור. הערה: פינוי אוויר מוצלח יכול להיות שמעידים נפנוף של החזה גדול, שרירי החזה קטין הנגרמת על ידי האוויר גורשו.</li>
	<li>לסגור את העור על ידי מזרון אופקי תפר בתפר משי 5-0. הערה: החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן צריך לא להיות sutured, כי הם רק בלשון בוטה ביתר מבנים אנטומיים שלהם ניזוקו במהלך הפעולה.</li>
</ol>4. לאחר הניתוח ניהול
<ol><li>לנהל הבופרנורפין (3 מ"ג/ק"ג) פעמיים מדי יום באמצעות הזרקה תת-עוריים כדי להפחית את הכאב עבור ה 48 הראשון אחרי מבצע11.</li>
	<li>לאחר המבצע, מיד לשמור על העכברים על משטח חום (37 מעלות צלזיוס) עד החלים לחלוטין. הנח את העכבר בחזרה לכלוב לאחר מלא התאוששות מתקלה.</li>
	<li>לחטא את המזרק המילטון בשימוש ואת מחט מזרק 30 G מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה (ראה הערה שלב 1.4). לאסוף את המחט מזרק 30 G סטיריליים במיכל החדים.</li>
</ol>5. דימות in Vivo למדידת ביטוי לוציפראז הלב
<ol><li>ביום 5 לאחר ההזרקה אדנו, להכין פתרון מניות טריים של luciferin ב- 15 מ ג/מ ל תמיסת מלח פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 µm.</li>
	<li>Intra-peritoneally להזריק העכברים ער הפתרון luciferin-150 מ"ג/ק"ג משקל גוף.</li>
	<li>הפעל את מערכת הדמיה.</li>
	<li>לאחר אוטומטי בדיקה עצמית של מערכת ההדמייה, לבחור את מצב הדמיה כמו "זורח" ובצע את ההגדרות הבאות: חשיפה: אוטומטי; Binning: 8; FStop: 1; עירור: לחסום; פליטה: פתוח.</li>
	<li>ב- 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, עזים ומתנגד העכברים בזריקה כלורין (300 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.</li>
	<li>לאבטח העכברים anesthetized על הבמה הדמיה מחומם במצב שכיבה, עם החזה לכיוון המצלמה.</li>
	<li>לאסוף תמונות (תמונה 1 עבור כל עכבר) ולכמת את עוצמת האותות על ידי ציור זהה מדידה מעגלית אזורים מעניינים (ROI) סביב בית החזה.</li>
	<li>לאחר האוסף של תמונות, להקריב את העכברים ולאסוף את הרקמות כאמור בסעיף הבא.</li>
</ol>6. קצירת רקמות
<ol><li>בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת וירוס (איור 1B), עזים ומתנגד העכברים עם 4% איזופלוריין, ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין באמצעות קונוס האף ואבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה.</li>
	<li>עושים חתך הגחון קו האמצע בצוואר הקדמי. חושפים את עורק תרדמני של ממש על ידי מפסק השרירים omohyoid, שריר הצוואר.</li>
	<li>להקריב את העכברים מאת transecting עורק תרדמני נכון, וגומר את הדם.</li>
	<li>עושים חתך הגחון קו האמצע בבטן. לחתוך את הצלעות משני צידי הצלעות לאורך הקו midclavicular, ו transect הסרעפת.</li>
	<li>לחשוף את הלב על-ידי הרמת מצאתי. לאתר של אבי העורקים ולהסיר בעדינות את רקמת השומן perivascular.</li>
	<li>נקרר אבי העורקים, retrogradely perfuse את הלב עם מחט 30 G המצורפת מזרק 1 מ"ל מלא 0.5 מ של 4 ° C בופר פוספט (PBS).</li>
	<li>לאחר זלוף, לסלק את הלב, ומחלקים אותו לתוך מתגלה ימינה ושמאלה. לסלק את הכבד, הריאות, הטחול.</li>
	<li>לאחר שני שוטף ב- PBS קר (4 ° C), לאחסן כל רקמות שנאספו בנפרד בקבוקונים קריוגני בחנקן נוזלי.</li>
</ol>7. קביעה של ביטוי חלבון
<ol><li>להכין מאגר המגון על-ידי הוספת קוקטייל מעכב פרוטאז לתוך מאגר פירוק זמינים מסחרית ביחס של 1: 100. לחשב את הנפח הכולל מבוסס על מספר דוגמאות יעובדו. לשמור על המאגר המגון מוכן ב 4 ° C לשימוש עוקבות.</li>
	<li>להוציא את רקמות ממיכל חנקן נוזלי. שוקלים את הרקמה על סולמות דיוק גבוהה (כ 60 מ"ג עבור כל פיסת הרקמה).</li>
	<li>להעביר את רקמת צינור 1.5-mL microcentrifuge. מיד מוסיפים 200 µL המגון מאגר precooled כדורי ברזל 1.5 מ מ (4 ° C) לתוך הצינור microcentrifuge.</li>
	<li>לאבטח צינורות microcentrifuge precooled (4 ° C) מחזיקי מתכת רקמה אוטומטית מכונת גריסה, ומתחילים המגון על-ידי הפעלת המכונה ההגדרות הבאות: תדירות: 70 הרץ; זמן: 120 s.</li>
	<li>לאחר המגון, centrifuge את homogenate (16,000 × g, 4 ° C), בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL עם פיפטה 100 µL.</li>
	<li>להוסיף טעינת מאגר לפתרון החלבון supernatant (5 x) ביחס של 1:4, denature החלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>רמות ביטוי חלבון את הלב ואת רקמות איברים אחרים נוספים המפוקחים על-ידי ניתוח תספיג (נציג התוצאות יוצגו ב- 2C איור , איור 3) לפי הפרוטוקול12שתואר קודם לכן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2017+ACC/AHA/HFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF/AHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure:+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America.">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li><li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia/reperfusion+injury.">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury.">The nuclear melatonin receptor ROR&#945; is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).</li><li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D+receptor+activation+protects+against+myocardial+reperfusion+injury+through+inhibition+of+apoptosis+and+modulation+of+autophagy.">Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy.</a> Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+liver-X-receptor+alpha+but+not+liver-X-receptor+beta+protects+against+myocardial+ischemia/reperfusion+injury.">Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts.">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li><li>Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+delivery+to+the+heart.">Adeno-associated virus vector delivery to the heart.</a> Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).</li><li>Michael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+gene+delivery+with+cardiopulmonary+bypass.">Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass.</a> Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).</li><li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Hepatic+Fatty+Acids+Uptake+and+Oxidation+by+LRPPRC-Driven+Oxidative+Phosphorylation+Reduces+Blood+Lipid+Levels.">Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.</a> Front Physiol. 7, 270 (2016).</li><li>Zhang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats.">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li><li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction.">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blot:+technique,+theory,+and+trouble+shooting.">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li><li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse.">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+protective+role+of+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+in+diabetic+cardiomyopathy.">Novel protective role of nuclear melatonin receptor ROR&#945; in diabetic cardiomyopathy.</a> J Pineal Res. 62 (3), (2017).</li><li>Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+toll-like+receptor+4+in+melatonin-induced+cardioprotection.">Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection.</a> J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).</li><li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JNK-TLR9+signal+pathway+mediates+allergic+airway+inflammation+through+suppressing+melatonin+biosynthesis.">JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis.</a> J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).</li><li>de Luxan-Delgado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+reduces+endoplasmic+reticulum+stress+and+autophagy+in+liver+of+leptin-deficient+mice.">Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice.</a> J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).</li><li>Scofield, S. L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography.">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit(+)+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675.">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li><li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome.">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li><li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression.">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies.">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1/Hes1/Akt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner.">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li><li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+cell+delivery:+observations+in+murine+hearts.">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הדו ח הנוכחי מדגים טכניקה שונה להזרקה intramyocardial של וקטורים נגיפי עבור מניפולציה ג'ין הלב, אשר היה שונה משיטה של אוטם שריר הלב אינדוקציה על-ידי גאו. et al. 13 . כעת, ויוו אפיון של פונקציות גנים ספציפיים לרוב לערב את הדור של העכברים הטרנסגניים3,14,15,16,17 או נוק , אשר הוא יקר, זמן רב ו מהגידולים. לחלופין, מסירה של וקטורים ג'ין או siRNA בזריקה מקומית או מערכתית נהוגה גם נרחב עבור מניפולציה ג'ין ב מחקר הלב וכלי הדם-4,-5,-7. בפרט, הזרקת intramyocardial לא ניתן להחליף על מניפולציה ג'ין לב בנסיבות מסוימות: מתי האתר ביים הזרקת היא חובה (למשל, גבול אזור ההזרקה במודל אוטם שריר הלב)11; כאשר מניפולציה ג'ין בעל הגבלת משך הוא נדרש (למשל, אדנו הזרקה). . הנה, הראינו כי בשיטת הזרקת intramyocardial ששונה הוא פשוט לחיסכון בזמן, יעילים ביותר.
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול לפתרון בעיות:
על הפעולה המוצלחת של פרוטוקול זה, יצויין מספר שלבים קריטיים. לפני וירוס שואבת, האוויר בתוך המזרק המילטון, המחט המצורפת לפנותן, אחרת האוויר מוזרק לתוך שריר הלב עלולים לגרום אקטואלי לב לפציעה או אפילו מוות. כדי למנוע עוד יותר את הבעיה, המזרק המילטון מוכן לשימוש מלא עם אמצעי אחסון נאותים וירוס לא יוצבו עם תום הבוכנה כלפי מטה, כי זה עשוי באופן ספונטני תשאף אוויר על-ידי חומרת הבוכנה מתכת. הרדמה צריך להיות לפקח בקפידה, כפי הרדמה עמוקה עלולה לעכב את ההחלמה שלאחר הניתוח, הרדמה עמוקה באופן חמור עלול לגרום למוות. לאחר הרדמה נאותה, הלב צריך לא להיות externalized בחלל החזה בכוח, שכן זה עלול לגרום לפציעה חמורה ריאות. אכן, הוצאתו הלב תקין דורש רק דחיפה עדינה של הלב, התנגדות כלשהי עשוי להצביע על דוחפים לכיוון הכיוון לא תקין.
מגבלות של הטכניקה:
חיסול של צנרור בטכניקה זו, אשר מפחית את הזמן הדרוש לקבלת ההליך, עולה כי ההליך הזרקת intramyocardial להסתיים בתוך חלון זמן מוגבל יחסית כדי למנוע מוות. הניסיון שלנו, הלב צריך לא להיות externalized במשך יותר מ-30 s, כי זה מגביר את שיעור התמותה ומאט את ההחלמה שלאחר הניתוח. לכן, מומלץ השימוש צנרור הניסיונות הראשונים של הפרוטוקול המתואר כאן. מגבלה נוספת היא התפלגות לא אחידה של וקטורים ויראלי מועברים על ידי שיטה זו, אשר קיים גם בשיטות קונבנציונליות של הזרקת intramyocardial7. יתר על כן, השיטה המתוארת כאן הוא יותר שימושי עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בלבבות שציווית, אשר יכולה להיות מלווה את הקמת מחלות לב שונות מודלים18,19,20, 21,22,23. עם זאת, השימוש של השיטה הנוכחית באספקת סוכנים פצועים ללבבות לבבות infarcted ייתכן מוגבל, כי אלו עכברים לא אוכל לסבול את ההליך.
משמעות לגבי שיטות קיימות:
הזרקת intramyocardial המקובלת דורש צנרור ו אוורור מכני24, וזה מקשה על אתר עקב מהירות עכבר פעימות ההזרקה. בעיות אלה להאריך באופן משמעותי את פעולת הזמן13, ובכך מגדילים וריאציות שמציב משך ההשהיה. הטכניקה שונה המוצג כאן הוא מהיר ומאפשר מיקום האתר הזרקה מדויקת נאבטח באופן ידני את הלב מוחצן; בסך הכל, באופן משמעותי שמגדיל יכולתו המחקר העוקבות. יתר על כן, חיסול של צנרור, אוורור מכני להפוך את השיטה שונה נגיש כמעט כל מעבדה.

מחלת לב היא הגורם המוביל של התחלואה והתמותה ברחבי העולם1,2. העדר אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות עבור הלב מסכני כולל אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב מושך אינטנסיבית חקר pathomechanisms כבסיס וזיהוי של אפשרויות טיפוליות הרומן3. עבור האלה החקירות מדעי, מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב הוא בשימוש נרחב4,5. מניפולציה ג'ין הלב יכולה להיות מושגת על ידי הגנום עריכת בעזרת נוקלאז activator דמוי אפקטור את תמלול חזק (TALEN), מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) / CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) כלים, או דרך אספקה של חומרי גנטי חוץ רחמי (למשל, וקטורים וירוס נושאת גנים קידוד חלבונים עניין)6. למרות הגנום עריכה מאפשר שינויים הגנום ייתכן ומדויק בעכברים חי, זה עדיין מהגידולים ועתירת תרגול6. לחלופין, מניפולציה ג'ין הלב ספציפיים על-ידי וירוס וקטוריים או הפרעה קטנה מסירה מורכבת RNA (siRNA) יש לבצע6.
וירוס משלוח וקטור ללב העכבר למבוגרים מושגת על ידי בערך שתי אסטרטגיות: הזרקה מקומית או מערכתית. הזרקת מערכתית של cardiotropic serotype של AAVs כגון AAV9 היא לא פולשנית הלב גנים ספציפיים מניפולציה7. עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור הכרחי עבור התמרה חושית יעילה של ביטוי גנים, עלול לגרום משמעותי התמרה חושית של איברים nontarget כגון שרירים, כבד7. הזרקת וירוס המקומית מושגת על ידי הזרקת intramyocardial או משלוח intracoronary7. משלוח intracoronary מוביל הפצת וירוס בתוך הלב לעומת הזרקה intramyocardial אפילו יותר. עם זאת, החסרונות של שיטה זו הם כביסה מהירה החוצה של וקטורים ויראלי מחזור מערכתי, התמרה חושית איברים nontarget8, וכן את הדרישה של מכשירי מדידת לחץ במהלך המבצע. לעומת זאת, מאפשר הזרקת intramyocardial השמירה וירוסים יותר שריר הלב, כמו גם משלוח באתר מסוים, אבל זה נכשל לפיזור אחיד ויראלי וקטור7. לבעלי-חיים קטנים, משלוח intracoronary קשה מבחינה טכנית לבצע, בעוד הזרקת AAV9 מערכתית, הזרקת intramyocardial הם יותר נפוץ התאמן4,5,7. למרות הזרקת מערכתית הוא קל לביצוע, הזרקת intramyocardial המקובלת דורש אוורור מכני ניקור חזה גורמת נזק לרקמות נרחב, הרבה זמן.
בדו ח זה, אנחנו תיאר שיטה נוחה לחיסכון בזמן, יעילה במיוחד עבור intramyocardial הזרקה. אדנו קידוד לוציפראז VDR, או shRNA מיקוד VDR, הוזרק לתמרן ביטוי גנים הלב. לאחר mastered, ניתן להשתמש בשיטה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים בלב העכבר.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow sterile hood</td><td>Fengshi Animal Experimental&amp;nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinding machine</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>High temperature/high pressure sterilizer</td><td>Hirayama (Saitama, Japan)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, USA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III imaging system</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&amp;nbsp;balance</td><td>Sartorius (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Curved tip</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micro-mosquito hemostat</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Curved, tip width 1.3mm</td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Syringe</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luciferase antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Chloralic hydras</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang (Shanghai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Pore size 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer for western&amp;nbsp; blot</td><td>Beyotime (Shanghai, China)</td><td>P0013J</td><td>Without inhibitors</td></tr><tr><td>Ophthalmic cream</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel ball</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Width 1.5 mm</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Warm mat</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

מניפולציה ג'ין במיוחד בלב פלאטין באופן משמעותי את החקירה של מחלות לב pathomechanisms, הפוטנציאל הטיפולי שלהם. In vivo המסירה הגן הספציפי דום לב מושגת בדרך כלל על ידי משלוח מקומי או סיסטמי. הזרקת מערכתית דרך וריד הזנב היא קלה ויעילה לתמרן את ביטוי גנים הלב באמצעות וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 (AAV9). עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור עבור התמרה חושית יעילה, עלול לגרום איברים nontarget ג'ין התמרה חושית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה ו לחיסכון בזמן של הזרקת intramyocardial עבור ויוו מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה (ללא אוורור), שרירי החזה ראשיות ומשניות היו גזור בלשון בוטה, בלב העכבר נחשף במהירות על-ידי הוצאתו ידני דרך חתך קטן ברווח הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, אדנו קידוד לוציפראז (לוק), קולטן ויטמין D (VDR), או סיכת ראש קצר RNA (shRNA) מיקוד VDR, הוזרק עם מזרק המילטון לתוך שריר הלב. הדמיה עוקבות ויוו הפגינו שלוציפראז הזה היה בהצלחה overexpressed באופן ספציפי בלב. יתר על כן, ניתוח תספיג אישר את ביטוי מוצלח או להחרשת VDR בלב העכבר. לאחר mastered, ניתן להשתמש בטכניקה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים כגון nanogels בלב העכבר.

פרוטוקול הניסוי וחלק השלבים המפתח עבור שיטת דיווח מוצגים באיור1. ב- 5 ימים לאחר הזרקת intramyocardial אדנו קידוד לוציפראז (עו ד-לוק), ויוו הדמיה בעכברים עו ד-לוק מוזרק המצוין ביטוי חזקים של לוציפראז במיוחד בלב (איור 2 א, ב'), אשר היה לאשר תספיג ניתוח (איור 2C), רומז העדר איברים nontarget התמרה חושית. לעומת זאת, אין ביטוי לוציפראז זוהה בעכברים שליטה. בקנה אחד עם ביטוי מוצלח של לוציפראז, ווסטרן כתם ניתוח הציע ולעלייה משמעותית VDR ביטוי החדר השמאלי של עכברים מוזרק עם אדנו קידוד VDR (עו ד-VDR) (איור 3 א). יתר על כן, עו ד-shVDR הזרקת הקטינה באופן משמעותי VDR ביטוי החדר השמאלי (איור 3B). לעומת זאת, הביטוי VDR לא משמעותית השתנה ב החדרים נכון אף עו ד-VDR מוזרק עכברים או עו ד-shVDR מוזרק עכברים (איור 3C, יח), כי אדנו היה רק מוזרק חדרית שריר הלב השמאלי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> איור 1 . הסכימה עבור העכבר intramyocardial הזרקת וג'ין ביטוי גילוי הפרוטוקול. (א) איור המציג שלושה אתרים הזרקת בשריר של החדר השמאלי. (B) פרוטוקול לגילוי גנים ביטוי בלב העכבר לאחר ההזרקה של וירוסים המצוין. עו ד-לוציפראז: אדנו קידוד לוציפראז; AdVDR: אדנו קידוד VDR; AdshVDR, אדנו shRNA קידוד מיקוד VDR. (ג) להחליפן בתמונות מציג מספר השלבים של השיטה שונה להזרקה intramyocardial העכבר. א . פינוי הפרווה על ידי קרם depilatory זמינים מסחרית. b. עיקור של האתר כירורגית עם המדים 3 של povidone יוד. ג. כיסוי באתר כירורגית עם תלוי סטרילי. ד 0.5 ס מ מבצעים חתך לאורך הקו המחבר מצאתי ובית השחי. אי קהה דיסקציה של החזה גדול, שרירי החזה קטן עם מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים. פ הוצאתו של הלב. ג זריקה של 30 µL אדנו פתרון לתוך שריר הלב של החדר השמאלי דרך המזרק המילטון. h - אני הסגר של העור על-ידי תפירת התיק-מחרוזת בתפר משי 5-0. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> איור 2 . זיהוי לוציפראז הביטוי ליבה. (א) תמונות שנאספו על ידי מערכת הדמיה מציג את האות זורח של הלב בקרת עכברים ועכברים מוזרק עם אדנו של קידוד לוציפראז 5 ימים לאחר ההזרקה. (B) עוצמות האות זורח בקבוצות שונות (n = 3) הם נתון סטטיסטי על ידי מבחן t . p < 0.01 לעומת בקרת עכברים. (ג) תספיג ניתוח תוצאות מציג לוציפראז רמות החלבון בלב, ריאות, כבד, טחול ב המצוין קבוצות ב 5 ימים לאחר הזרקת אדנו (n = 3). מאז לוציפראז ביטוי התגלתה רק בלב של עו ד-לוק מוזרק עכברים, ניתוח סטטיסטי לא בוצעה. עו ד-לוק: אדנו קידוד לוציפראז. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> איור 3 . זיהוי VDR הביטוי ליבה. (א) הדף פאנל: תספיג להקות מראה רמות VDR החדר השמאלי (איפה אדנו מוזרק) ביום 0, 5 ימים, 7 ימים, ו-14 ימים לאחר ההזרקה VDR-עו ד. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). התוצאות היו מנורמל נגד GAPDH, המרה לקפל שינוי יחסית ליום 0. בכיוון אחד השונות (ANOVA) ואחריו פוסט-הבחינה Bonferroni (שונויות שוות ההנחה) או Tamhane שלאחר הבדיקה (שונויות שוות שלא הנחתי) בוצע לשם ניתוח סטטיסטי. p < 0.05 או * *p < 0.01 לעומת יום 0. החלונית העליונה (B): תספיג להקות מראה רמות VDR החדר השמאלי ביום 0, 3 ימים, 5 ימים, ו- 7 ימים לאחר ההזרקה עו ד-shVDR. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). p < 0.05 לעומת יום 0. (ג) הדף פאנל: תספיג להקות רמות VDR מראה החדר הימני (איפה אדנו לא מוזרק) ביום 0, 5 ימים, 7 ימים, ו-14 ימים לאחר ההזרקה VDR-עו ד. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). החלונית העליונה (D): תספיג להקות רמות VDR מראה החדר הימני ביום 0, 3 ימים, 5 ימים, ו- 7 ימים לאחר ההזרקה עו ד-shVDR. פאנל התחתונה: ניתוח כמותי למחצה של VDR רמות הביטוי של קבוצות שונות (n = 4 לכל נקודת זמן). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice at JoVE.com

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.9K Views.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

Video: A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Medicine

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genetics

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Developmental Biology

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

טרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בלבבות עכברים

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

מחבר זרקור: טרנסגנזה של תאי לב לבדיקת גנים מהירה

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

Summary

Explore More Videos

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

משלוח mRNA שונה במודל לעכבר אוטם שריר הלב

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

הזרקת Intramyocardial מונחה אקוקרדיוגרפיה ניגודיות מלעורית ואספקה תא בדגם פרה גדולה

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים