Questo lavoro è stato supportato dal National Science Fund per illustri giovani studiosi (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), programma di Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal Sostegno di formazione della Commissione Gaofeng medicina clinica Grant (20152209), Shanghai Shenkang Hospital Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 e 14XJ10019), Programma di vela di Shanghai (18YF1413000) e programma di innovazione post-laurea di Bengbu Medical College (Byycx1722). Ringraziamo il dottor Erhe Gao per il suo aiuto precedente nel nostro laboratorio.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo gli istituti nazionali di salute orientamenti sull'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell'Istituto. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi maschii di C57BL/6J (8-10 settimane di età). Topi sono stati alloggiati in condizioni esenti da patogeni a 24 ° C ± 4 ° C, con un ciclo luce/buio di 12 h, con libero accesso all'acqua e cibo.
1. preparazione della soluzione di Adenovirus
<ol><li>All'arrivo della soluzione purificata dell'adenovirus, conservare la soluzione in un congelatore a-80 ° C. Nota: L'iniezione dell'adenovirus è stato effettuato in topi praticabili. Per garantire la sterilità del vettore dell'adenovirus, l'adenovirus (codifica luciferasi, VDR o shRNA targeting VDR) sono stati preparati e purificato commercialmente9,10.</li>
	<li>Il giorno di apertura, estrarre la soluzione purificata dell'adenovirus (3 x 1010 placca formando unità [pfu] /mL) dal congelatore-80 ° C e scongelare l'adenovirus vettore soluzione sul ghiaccio.</li>
	<li>Mettere su una maschera facciale, guanti sterili e abito sterile.</li>
	<li>Preparare un 50-µ l siringa Hamilton che è stato sterilizzato il giorno prima dell'operazione. Nota: Per la sterilizzazione, la siringa Hamilton era avvolto in una garza e disposto in uno sterilizzatore di pressione ad alta temperatura/alto. È stata selezionata la modalità di "Sterilizzazione per il solido" e sterilizzazione è stato avviato premendo il pulsante "start".</li>
	<li>Dopo lo scongelamento completo della soluzione purificata dell'adenovirus, spruzzare nella provetta contenente la soluzione dell'adenovirus con 75% di etanolo e spostare la soluzione dell'adenovirus in cappa sterile a flusso laminare.</li>
	<li>In una cappa a flusso laminare sterile, aspirare 50 µ l di soluzione dell'adenovirus utilizzando la siringa senza ago, seguita da pignoramento di un ago 30g alla siringa Hamilton Hamilton.</li>
	<li>Tenere la siringa con l'ago 30g verso l'alto e spingere delicatamente lo stantuffo della siringa fino a quando l'ago è riempito con la soluzione dell'adenovirus (confermato dalla comparsa delle prime gocce di soluzione dalla punta dell'ago). Nota: Ci vogliono circa 45 µ l di soluzione per riempire l'ago 30g, così ora quasi nessuna soluzione è visibile nella siringa.</li>
	<li>Utilizzare la siringa preparata sopra per aspirare accuratamente un altro 30 µ l di soluzione di adenovirus e mettere la siringa senza bloccare con un massimo di sul ghiaccio per un utilizzo successivo.</li>
</ol>2. l'anestesia e la preparazione operativa
<ol><li>Aggiungere 20 mL isoflurano in un vaporizzatore di isoflurano e connettersi il vaporizzatore di isoflurane una bombola d'ossigeno.</li>
	<li>Aprire il rubinetto e lasciare che l'ossigeno flusso dal serbatoio di ossigeno per il vaporizzatore di isoflurane. Mantenere il tasso di flusso di ossigeno a 2 L/min tramite un monitor di flusso di ossigeno nel vaporizzatore isoflurano.</li>
	<li>Indurre l'anestesia del mouse con isoflurano 4% a 100% di ossigeno (2 L/min) per 2 min in una gabbia di plastica collegata al vaporizzatore di isoflurane.</li>
	<li>Estrarre il mouse anestetizzato dalla gabbia in plastica e fissarlo su una piattaforma di plastica in posizione prona in cappa sterile a flusso laminare e mantenere l'anestesia con isoflurano 2% a 100% di ossigeno (2 L/min) tramite un cono di naso.</li>
	<li>Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di risposta di pizzico di punta.</li>
	<li>Applicare la crema oftalmica sterile per ogni occhio per proteggere le cornee da essiccazione.</li>
	<li>Radere il torace e l'addome superiore. Applicare la crema depilatoria commercialmente disponibile al sito rasato per 1 min, rimuovere la crema depilatoria e restanti pelliccia con garze bagnate.</li>
	<li>Sterilizzare il sito chirurgico (parte inferiore sinistra del torace) con 3 scrub di iodio-clorexidina basata antisettico (ad es. entoiodine). Coprire il sito chirurgico con un telo sterile.</li>
</ol>3. intramiocardico iniezione dell'Adenovirus nel cuore del topo
<ol><li>Togliere i guanti e mettere su un nuovo paio di guanti sterili.</li>
	<li>Sterilizzare il forcipe, un emostato micro-zanzara, un paio di forbici chirurgiche, e un porta-aghi il giorno prima dell'operazione in un'alta temperatura/alta pressione Sterilizzatore (vedi passo 1.4 Nota).</li>
	<li>Fare un'incisione della pelle 0,5 centimetri lungo la linea che collega il xifoideo e del axilla. Senza mezzi termini di sezionare le pettorali grandi e minori pettorali con pinze e una pinza emostatica micro-zanzara.</li>
	<li>Esporre gli spazi intercostali ritraendo le pettorali grandi e minori pettorali. Perforare e aprire il quarto spazio intercostale (o il più ampio spazio intercostale di osservazione) con una pinza emostatica micro-zanzara.</li>
	<li>Spingere il cuore verso l'incisione di esternare il cuore con il dito indice della mano non dominante premendo delicatamente contro il lato destro della parete di cassa.</li>
	<li>Dolcemente fissare il cuore esternalizzato con il dito indice e il pollice della mano non dominante.</li>
	<li>Iniettare un totale di 30 µ l di soluzione di adenovirus nel miocardio del ventricolo sinistro in tre siti (parete ventrale, dorsale e laterale del ventricolo sinistro) tramite la siringa Hamilton riempita con adenovirus (Figura 1) con la mano dominante.</li>
	<li>Dopo il completamento dell'iniezione, posizionare immediatamente il cuore nuovamente dentro lo spazio intratoracico.</li>
	<li>Manualmente è possibile evacuare l'aria nello spazio intratoracico premendo delicatamente la parete toracica verso il sito di incisione della pelle. Nota: Evacuazione di aria riuscita può essere evidenziato da sbattimento dei pettorali grandi e minori pettorali causate da aria espulsa.</li>
	<li>Chiudere la pelle da sutura orizzontale materasso con una sutura in seta 5-0. Nota: Le pettorali grandi e minori pettorali devono non essere suturati, perché essi sono solo senza mezzi termini dissecati e loro strutture anatomiche sono intatte nel corso dell'operazione.</li>
</ol>4. postoperatorio Management
<ol><li>Amministrare buprenorfina (3 mg/kg) due volte al giorno tramite iniezione sottocutanea per ridurre il dolore post-operatorio per le prime 48 h dopo l'operazione11.</li>
	<li>Dopo l'operazione, immediatamente mantenere i topi su una piastra di calore (37 ° C) fino a che completamente ha recuperato. Posizionare il mouse indietro alla gabbia dopo recupera completamente.</li>
	<li>Sterilizzare l'usate Hamilton siringa e l'ago della siringa 30 G in uno sterilizzatore di pressione ad alta temperatura/alto (vedere la nota di passaggio 1.4). Raccogliere l'ago della siringa sterile 30 G in un contenitore di sharps.</li>
</ol>5. in Vivo Imaging per la misurazione cardiaca Luciferase espressione
<ol><li>Il giorno 5 dopo l'iniezione dell'adenovirus, preparare una soluzione stock fresca di luciferina a 15 mg/mL in soluzione salina tamponato fosfato di Dulbecco (DPBS). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 µm.</li>
	<li>Intra-peritoneally iniettare i topi svegli con la soluzione di luciferina a 150 mg/kg di peso corporeo.</li>
	<li>Accendere il sistema di imaging.</li>
	<li>Dopo automatico auto-test del sistema di imaging, selezionare la modalità di imaging come "Luminescente" e definire le seguenti impostazioni: esposizione: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Eccitazione: Blocco; Emissione: aperta.</li>
	<li>A 10 min dopo l'iniezione di luciferina, anestetizzare i topi iniettando cloralio idrato (300 mg/kg di peso corporeo). Confermare un'anestesia adeguata dall'assenza di risposta di pizzico di punta.</li>
	<li>Fissare i topi anestetizzati su un piatto riscaldato imaging in posizione prona, con il petto diretto verso la macchina fotografica.</li>
	<li>Raccogliere immagini (1 immagine per ogni mouse) e quantificare l'intensità dei segnali dal disegno di regioni di identica misura circolare di interesse (ROI) intorno al petto.</li>
	<li>Dopo la raccolta di immagini, sacrificare i topi e raccogliere i tessuti come accennato nella sezione seguente.</li>
</ol>6. raccolta di tessuti
<ol><li>In diversi momenti dopo l'iniezione di virus (Figura 1B), anestetizzare i topi con 4% isoflurane e mantenere l'anestesia con isoflurano 2% tramite un cono di naso e fissarlo su una piattaforma di plastica in posizione prona.</li>
	<li>Fare un'incisione ventrale del midline nel collo anteriore. Esporre l'arteria carotica comune di destra ritraendo i muscoli omohyoid e sternocleidomastoideo.</li>
	<li>Sacrificare i topi da sezionare l'arteria carotica comune di destra e drenare il sangue.</li>
	<li>Fare un'incisione ventrale del midline nell'addome. Tagliare le costole da entrambi i lati della gabbia toracica lungo la linea emiclaveare e transetto il diaframma.</li>
	<li>Esporre il cuore sollevando il xifoideo. Trovare l'aorta ascendente e rimuovere delicatamente il tessuto adiposo perivascolare.</li>
	<li>Incannulare l'aorta e retrogradely irrorare il cuore con un ago 30g attaccato ad una siringa da 1 mL riempita con 0,5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo aspersione, asportare il cuore e dividerlo nei ventricoli destro e sinistro. Asportare il fegato, il polmone e la milza.</li>
	<li>Dopo due lavaggi in PBS freddo (4 ° C), memorizzare tutti i tessuti raccolti separatamente in flaconcini criogenici in azoto liquido.</li>
</ol>7. determinazione dell'espressione della proteina
<ol><li>Preparare il tampone di omogeneizzazione aggiungendo cocktail inibitore della proteasi nel tampone di lisi commercialmente disponibili ad un rapporto di 1: 100. Calcola il volume totale in base al numero di campioni da elaborare. Mantenere il buffer di omogeneizzazione preparati a 4 ° C per un uso successivo.</li>
	<li>Estrarre i tessuti dal serbatoio di azoto liquido. Pesare il tessuto sulle scale di alta precisione (circa 60 mg per ogni pezzo di tessuto).</li>
	<li>Trasferire il tessuto ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Immediatamente aggiungere 200 µ l di tampone di omogeneizzazione e preraffreddate sfere d'acciaio di 1,5 mm (4 ° C) nel tubo del microcentrifuge.</li>
	<li>Fissare i tubi del microcentrifuge preraffreddato (4 ° c) portalampade in metallo in un tessuto automatico macchina per la frantumazione e iniziare omogeneizzazione avviando la macchina con le seguenti impostazioni: frequenza: 70 Hz; tempo: 120 s.</li>
	<li>Dopo omogeneizzazione, centrifugare l'omogeneizzato (16.000 × g, 4 ° C) e attentamente trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 mL nuova con una pipetta 100 µ l.</li>
	<li>Aggiungere carico buffer soluzione (5x) alla proteina del surnatante in un rapporto di 1:4 e denaturare la proteina a 100 ° C per 5 min.</li>
	<li>I livelli di espressione della proteina nel cuore ed altri tessuti dell'organo sono ulteriormente monitorati mediante Western blot (rappresentante risultati sono mostrati in Figura 2 e Figura 3) secondo il protocollo descritto in precedenza12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2017+ACC/AHA/HFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF/AHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure:+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America.">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li><li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia/reperfusion+injury.">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+melatonin+receptor+ROR&#945;+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury.">The nuclear melatonin receptor ROR&#945; is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramyocardial+cell+delivery:+observations+in+murine+hearts.">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il rapporto attuale dimostra una tecnica modificata per iniezione intramiocardica di vettori virali per la manipolazione del gene cardiaco, che è stato modificato da un metodo per l'induzione di infarto miocardico da Gao et al. 13 attualmente, in vivo caratterizzazione delle funzioni dei geni specifici più spesso coinvolgono la generazione di Ko o topi transgenici3,14,15,<su...

La malattia cardiaca è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo1,2. La mancanza di strategie terapeutiche efficaci per circostanze life-threatening di cuore compreso l'infarto miocardico e insufficienza cardiaca attira intensa esplorazione di pathomechanisms sottostante e l'identificazione di nuove opzioni terapeutiche3. Per queste esplorazioni scientifiche, manipolazione del gene specifico è ampiamente usato4,5. Manipolazione del gene cardiaco può essere ottenuta utilizzando la nucleasi di attivatore-come effettore potente trascrizione (TALEN) l'editing genomico e cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) / CRISPR associated protein 9 (Cas9) strumenti, o di consegna del materiale genetico ectopici (ad es., vettori del virus portatori di geni che codificano per le proteine di interesse)6. Se l'editing genomico permette modifiche precise e spaziotemporali genoma in topi vivi, è ancora una pratica molto tempo e laborioso6. In alternativa, la manipolazione del gene specifico di vettore del virus o interferire piccolo consegna complesso RNA (siRNA) sono regolarmente eseguita6.
Consegna di vettore di virus nel cuore di topo adulto è raggiunto da circa due strategie: iniezione sistemica o locale. Iniezione sistemica di cardiotropi sierotipo di adenoassociati come AAV9 è non invadente per gene specifico cardiaco manipolazione7. Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente alta di vettore necessarie per trasduzione efficiente e l'espressione genica e può provocare significative trasduzione del nontarget organi quali il muscolo e fegato7. Iniezione di virus locale avviene mediante iniezione intramiocardica o intracoronary consegna7. Consegna intracoronary conduce ad una distribuzione più uniforme del virus all'interno del cuore rispetto all'iniezione intramiocardica. Tuttavia, gli svantaggi di questa tecnica sono il lavaggio rapido fuori di vettori virali per la circolazione sistemica e la trasduzione in organi del nontarget8e relativo requisito di dispositivi per la misurazione della pressione durante il funzionamento. Al contrario, consente di iniezione intramiocardica migliore ritenzione del virus nel miocardio nonché consegna sito specifico, ma non riesce a distribuire uniformemente virale vettore7. Piccoli animali, consegna intracoronary è tecnicamente difficile da eseguire, mentre sistemica AAV9 iniezione e iniezione intramiocardica sono più comunemente praticato4,5,7. Anche se iniezione sistemica è facile da eseguire, iniezione intramiocardica convenzionali richiede la toracotomia e la ventilazione meccanica, provoca vasto danno di tessuto e richiede tempo.
In questo rapporto, abbiamo descritto un metodo facile, risparmio di tempo e altamente efficiente per iniezione intramiocardica. L'adenovirus codifica luciferasi e VDR o shRNA VDR, il targeting è stato iniettato per modificare l'espressione genica cardiaco. Una volta imparato, questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali nel cuore del mouse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="914">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td colspan="4" height="40" style="height:40px;width:916px;">Equipments</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Laminar flow sterile hood</td>
			<td style="width:267px;">Fengshi Animal Experimental&#160; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td>
			<td style="width:143px;">FS-CJ-2F</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">75005282</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Tissue grinding machine</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;">Scientz-48</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">High temperature/high pressure sterilizer</td>
			<td style="width:267px;">Hirayama (Saitama, Japan)</td>
			<td style="width:143px;">HVE-50</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane vaporizer&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Matrix (Orchard Park, USA)</td>
			<td style="width:143px;">VIP3000</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">IVIS&#160; Lumina III imaging system</td>
			<td style="width:267px;">PerkinElmer (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">CLS136334</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Precision&#160;balance</td>
			<td style="width:267px;">Sartorius (G&#246;ttingen, Germany)</td>
			<td style="width:143px;">28091873</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Instruments&#160;</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (100 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000059</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Eppendorf pipette (10 &#181;L)</td>
			<td style="width:267px;">Eppendorf (Westbury, USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;4920000113</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Forceps</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">JD4020</td>
			<td style="width:156px;">Curved tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Hamilton syringe</td>
			<td style="width:267px;">Hamilton (Nevada, USA)</td>
			<td style="width:143px;">80501</td>
			<td style="width:156px;">Volume 50 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Micro-mosquito hemostat</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">13011-12</td>
			<td style="width:156px;">Curved, tip width 1.3mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Needle holder&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">J32110</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:267px;">F.S.T (Foster City, USA)</td>
			<td style="width:143px;">14002-12</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">1-mL Syringe</td>
			<td style="width:267px;">WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Materials and reagents</td>
			<td style="width:267px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-GAPDH antibody</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">#2118</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-Luciferase antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">ab187340</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:267px;">CST (Danvers,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;#7074</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Anti-VDR antibody</td>
			<td style="width:267px;">Abcam (Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:143px;">&#160;ab109234</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PA175056</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Chloralic hydras</td>
			<td style="width:267px;">LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Cryogenic Vials</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">375418</td>
			<td style="width:156px;">1.8 mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Depilatory cream</td>
			<td style="width:267px;">Veet (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">14040133</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Entoiodine</td>
			<td style="width:267px;">LiKang (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">310132</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">EP tube</td>
			<td style="width:267px;">Sarstedt (Newton, USA)</td>
			<td style="width:143px;">PCR001</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Filter</td>
			<td style="width:267px;">Millipore (Bedford, USA)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Pore size 0.2 &#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:267px;">Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Luciferin</td>
			<td style="width:267px;">Promega (Madison, USA)</td>
			<td style="width:143px;">P1041</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Lysis buffer for western&#160; blot</td>
			<td style="width:267px;">Beyotime (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;">P0013J</td>
			<td style="width:156px;">Without inhibitors</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Ophthalmic cream</td>
			<td style="width:267px;">Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">PBS</td>
			<td style="width:267px;">Gibco (Grand Island,&#160; USA)</td>
			<td style="width:143px;">10010023</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific (Waltham, USA)</td>
			<td style="width:143px;">78438</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">5-0 silk suture</td>
			<td style="width:267px;">Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Steel ball</td>
			<td style="width:267px;">Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">Width 1.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Syringe needle</td>
			<td style="width:267px;">Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:156px;">30 gauge&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:351px;">Warm mat</td>
			<td style="width:267px;">Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td>
			<td style="width:143px;">NF-GNCW</td>
			<td style="width:156px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

Manipolazione del gene specificamente nel cuore potenziare significativamente l'inchiesta di malattia cardiaca pathomechanisms e loro potenziale terapeutico. In vivo consegna specifico gene comunemente viene ottenuta tramite consegna o sistemica o locale. Iniezione sistemica tramite vena caudale è facile ed efficiente nel manipolare l'espressione genica cardiaca utilizzando virus adeno-associato ricombinante 9 (AAV9). Tuttavia, questo metodo richiede una quantità relativamente elevata di vettore per la trasduzione efficiente e può provocare la trasduzione del gene di organo del nontarget. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e risparmio di tempo di iniezione intramiocardica per in vivo manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia (senza ventilazione), senza mezzi termini sono stati sezionati i muscoli pettorali maggiori e minori, e il cuore del topo è stato rapidamente esposti dal manuale esternalizzazione attraverso una piccola incisione presso il quarto spazio intercostale. Successivamente, l'adenovirus codifica luciferasi (Luc) e del recettore della vitamina D (VDR) o short hairpin RNA (shRNA) VDR, il targeting è stato iniettato con una siringa Hamilton nel miocardio. Successivi in vivo imaging ha dimostrato che quel luciferase era correttamente overexpressed in particolare nel cuore. Inoltre, l'analisi Western blot ha confermato la sovraespressione di successo o silenziamento di VDR nel cuore del mouse. Una volta imparato, questa tecnica può essere utilizzata per la manipolazione del gene, così come l'iniezione di cellule o di altri materiali quali nanogel nel cuore del mouse.

Il protocollo di esperimento e alcuni dei passaggi chiavi per il metodo segnalato sono mostrati nella Figura 1. 5 giorni dopo l'iniezione intramiocardica di luciferasi codifica dell'adenovirus (Adv-luc), in vivo imaging in adv-luc iniettato topi indicato robusta sovraespressione di luciferasi specificamente nel cuore (Figura 2A, B), che era confermato da analisi Western blot (Figura ...

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

Un metodo semplice ed efficace per In Vivo manipolazione del Gene specifico tramite l'iniezione intramiocardica in topi

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.7K Views.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. Qui presentiamo un protocollo per la manipolazione del gene specifico in topi. Nell'ambito dell'anestesia, i cuori di topo sono stati esternalizzati attraverso il quarto spazio intercostale. Successivamente, gli adenovirus codifica specifici geni sono stati iniettati con una siringa nel miocardio, seguito dalla misura di espressione della proteina in vivo imaging e Western blot analisi.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pirosequenziamento: un metodo semplice per genotipizzazione accurata

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Utilizzando Sequence SECM arresto come uno strumento per isolare ribosoma Polipeptidi Bound

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. Therefore, it is important to establish an efficient transient gene expression system in soybean. Here, we report a simple protocol for the preparation of soybean protoplasts and its application for transient functional analyses. We found that young unifoliate leaves from soybean seedlings resulted in large quantities of high quality protoplasts. By optimizing a PEG-calcium-mediated transformation method, we achieved high transformation efficiency using soybean unifoliate protoplasts. This system provides an efficient and versatile model for examination of complex regulatory and signaling mechanisms in live soybean cells and may help to better understand diverse cellular, developmental and physiological processes of legumes.

We developed a simple and efficient protocol for the preparation of large quantities of soybean protoplasts to study complex regulatory and signaling mechanisms in live cells.