Name: a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice
Uploaded: 2018-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
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이 작품 고유 영 학자 (81625002), 국립 자연 과학 재단의 중국 (81470389, 81270282, 81601238), 프로그램의 상하이 학술 연구 지도자 (18XD1402400), 상하이 시 국립 과학 기금에 의해 지원 되었다 교육 위원회 Gaofeng 임상 의학 보조금 지원 (20152209), 상하이 Shenkang 병원 개발 센터 (16CR3034A), 상해 Jiao 집게 대학 (YG2013MS42), 상해 Jiao 집게 대학 대학원 의학 (15ZH1003 및 14XJ10019), 상하이 항해 프로그램 (18YF1413000), 그리고 Bengbu 의학 대학 (Byycx1722)의 대학원 혁신 프로그램. 우리는 우리 실험실에서 그의 이전 도움 박사 Erhe가 오를 감사합니다.

모든 동물 실험 실험 동물의 사용에 건강 지침의 국가 학회에 따르면 실행 했다 하 고 연구소의 동물 윤리 위원회에 의해 승인 했다. (8-10 주 세) 남성 C57BL/6J 마우스는 모든 실험에 사용 되었다. 마우스는 24 ° C ± 4 ℃, 12 h 명암 주기, 물과 음식에 대 한 무료 액세스 아래에서 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
1입니다. 아 데 노비 루스 솔루션의 준비
<ol><li>순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 도착-80 ° C 냉동 고에서 솔루션을 저장 합니다. 참고: 아 데 노 바이러스 주입 가능한 쥐에서 수행 되었다. 아 데 노 바이러스 벡터의 무 균을 보장 하기 위해, 아 데 노 바이러스 (인코딩 luciferase, VDR, 또는 대상으로 VDR shRNA) 준비 했다 고 정화 상업적으로9,10.</li>
	<li>작업 일에-80 ° C 냉동 고에서 순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션 (3 x 1010 플 라크 형성 단위 [pfu] /mL) 밖으로 하 고 아 데 노 바이러스 벡터 솔루션 얼음에 녹여.</li>
	<li>안 면, 멸 균 장갑, 멸 균 가운에 넣어.</li>
	<li>50 µ L를 준비 작업 전날 소독 된 해밀턴 주사기. 참고: 살 균, 해밀턴 주사기는 거 즈에 싸서 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 배치. "고체에 대 한 살 균"의 모드를 선택 하 고 살 균 "시작" 버튼을 누르면 시작 했다.</li>
	<li>순화 된 아 데 노 바이러스 솔루션의 완전 한 녹고 후 75% 에탄올, 아 데 노 바이러스 솔루션을 포함 하는 튜브를 스프레이 하 고 층 류 살 균 후드에 아 데 노 바이러스 솔루션을 이동 합니다.</li>
	<li>층 류 살 균 후드, 30 G의 바늘의 첨부 파일 다음에 해밀턴 주사기, 바늘 없는 해밀턴 주사기를 사용 하 여 50 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 발음.</li>
	<li>30g 바늘 위쪽으로, 주사기를 누른 바늘 (바늘 끝에서 첫 번째 솔루션 상품의 외관에 의해 확인) 아 데 노 바이러스 솔루션으로 채워질 때까지 부드럽게 주사기의 플런저를 밀어. 참고: 30g 바늘을 채우기 위해 약 45 µ L 솔루션 걸립니다 그래서 지금은 거의 없는 솔루션 주사기에 표시 됩니다.</li>
	<li>위의 준비 된 주사기를 사용 하 여 신중 하 게 또 다른 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션, 발음 하 고 사용에 대 한 얼음에 느슨하게 출장된 주사기를 놓습니다.</li>
</ol>2. 마 취와 수술 준비
<ol><li>20 mL isoflurane isoflurane 기화 기에 추가 하 고 산소 탱크 isoflurane 기화를 연결.</li>
	<li>밸브를 열고 고 산소 isoflurane 기화 기에 산소 탱크에서 흐름. 2 L/분 isoflurane 기화 기에 산소 흐름 모니터를 통해 산소 유량을 유지 합니다.</li>
	<li>플라스틱 케이지 isoflurane 기화 기에 연결 된에서 2 분 100% 산소 (2 L/min)에서 4 %isoflurane 마우스의 마 취를 유도.</li>
	<li>플라스틱 케이지에서 마 취 마우스를 꺼내 고 층 류 살 균 후드에서 발생 하기 쉬운 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안을 코 콘을 통해 100% 산소 (2 L/min)에서 2 %isoflurane 마 취를 유지.</li>
	<li>발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.</li>
	<li>건조에서 각 막을 보호 하기 위해 각 눈에 메 마른 눈 크림을 적용 합니다.</li>
	<li>가슴 및 위 복 부를 면도. Depilatory 크림을 제거 하는 1 분에 대 한 면도 사이트에 상용 depilatory 크림을 적용 하 고 남은 젖은 gauzes와 모피.</li>
	<li>기반으로 요오드 액체 살 균 (예: entoiodine)의 3 스크럽으로 외과 사이트 (가슴의 왼쪽된 아래 부분)을 소독. 무 균 드 레이프와 수술 부위의 커버.</li>
</ol>3. Intramyocardial 마우스 마음에 아 데 노 바이러스의 주입
<ol><li>장갑에서 고 멸 균 장갑 한 켤레를 입었다.</li>
	<li>집게, 마이크로-모기 hemostat, 수술가 위를 소독 하 고 높은 작업 전에 하루에 바늘 홀더 온도/높은 압력 소독 기 (단계 1.4 참고 참조).</li>
	<li>칼과 겨드랑이 연결 하는 선 따라 0.5 cm 피부 절 개를 확인 합니다. 퉁 명 스럽게 가슴 주요와 집게와 마이크로-모기 hemostat 가슴 작은 근육 해 부.</li>
	<li>큰 가슴 및 가슴 작은 근육을 제거 하 여 있는 공간을 노출 합니다. 통해 피어스 하 고 마이크로-모기 hemostat로 4 번째 있는 공간 (또는 관찰 하 여 넓은 있는 공간)을 엽니다.</li>
	<li>가슴 벽의 오른쪽에 부드럽게 눌러 비 지배적인 손 검지 손가락으로 하트를 외부화 하 절 개를 향해 마음을 밀어.</li>
	<li>부드럽게 검지 손가락과 엄지손가락의 비 지배적인 손 가진 외부화 심장 보호.</li>
	<li>지배적인 손을 가진 총 30 µ L 아 데 노 바이러스 솔루션 아 데 노 바이러스 (그림 1C)로 채워진 해밀턴 주사기를 통해 3 개의 사이트 (좌 심 실의 복 부, 등, 그리고 측면 벽)에 좌 심 실 심근으로 주사.</li>
	<li>주입의 완료 후 즉시 intrathoracic 공간으로 다시 마음을 놓습니다.</li>
	<li>수동으로 부드럽게 피부 절 개 사이트 쪽으로 가슴 벽을 누르면 intrathoracic 공간에서 공기를 철수. 참고: 성공적인 공기 피난 가슴 큰 가슴 작은 근육 퇴 학된 공기에 의해 발생의 펄 럭 여 명시 될 수 있다.</li>
	<li>수평 매트리스 5-0 비단 봉합 사로 봉합 하 여 피부를 닫습니다. 참고: 주요 가슴 및 가슴 작은 근육 해야 하지 수 봉합, 때문에 그들은 단지 솔직 해 부 그들의 해 부 구조는 작업을 통해 그대로.</li>
</ol>4. 수술 후 관리
<ol><li>관리 buprenorphine (3 mg/kg) 두번 매일 작업11후 첫 번째 48 h에 대 한 수술 후 통증을 줄이기 위해 피하 주사를 통해.</li>
	<li>수술 후, 완전히 복구 될 때까지 즉시 열 패드 (37 ° C)에 마우스를 유지. 그것은 완벽 하 게 복구 후 다시 감 금 소에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>해밀턴 주사기 사용된 및 높은 온도/높은 압력 소독 기에 30 G 주사기 바늘 소독 (1.4 단계 참고). 소독된 30 G 주사기 바늘은 sharps 용기에 수집 합니다.</li>
</ol>5. 심장 Luciferase 식 측정에 대 한 Vivo에서 이미징
<ol><li>아 데 노 바이러스 주입 후 5 일에 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)에 15 mg/mL에서 소의 신선한 재고 솔루션을 준비 합니다. 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>Intra-peritoneally 150mg/kg 몸 무게에서 소 솔루션 깨어 쥐를 주사.</li>
	<li>이미징 시스템을 켭니다.</li>
	<li>자동 이미징 시스템의 자체 검사 후 "발광"으로 영상 모드를 선택 하 고 다음 설정을: 노출: 자동; Binning: 8; FStop: 1; 여기: 블록; 방출: 오픈.</li>
	<li>소 주사 후 10 분 chloral 하이드 레이트 주입 (300 밀리 그램/kg 체중) 쥐를 anesthetize. 발가락 핀치 응답의 부재에 의해 적절 한 마 취를 확인 합니다.</li>
	<li>카메라를 향해 이동 하는 가슴으로 발생 하기 쉬운 위치에 온수 이미징 단계에 마 취 쥐 보안.</li>
	<li>이미지 (1 이미지 각 마우스에 대 한)를 수집 하 고 신호 강도 가슴 주위 관심 (ROI) 동일한 원형 측정 영역을 그려서 계량.</li>
	<li>이미지의 컬렉션 후 쥐를 희생 하 고 다음 섹션에서 설명 했 듯이 조직을 수집 합니다.</li>
</ol>6. 수확 조직
<ol><li>다른 시간 지점에서 바이러스 주사 (그림 1B) 후, 4 %isoflurane 쥐 anesthetize 및 코 콘을 통해 2 %isoflurane 마 취를 유지 하 고 경향이 위치에 플라스틱 플랫폼에 보안.</li>
	<li>앞쪽 목에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Omohyoid 및 sternocleidomastoid 근육을 제거 하 여 바로 일반적인 경 동맥을 노출 합니다.</li>
	<li>바로 일반적인 경 동맥을 transecting 하 고 혈액을 배출 하 여 쥐를 희생.</li>
	<li>복 부에 중간 복 부 절 개를 확인 합니다. Midclavicular 라인을 따라 흉 곽의 양쪽에서 갈비뼈를 잘라내어 transect 횡 경 막.</li>
	<li>심장에 칼을 해제 하 여 노출. 오름차순 대동맥 찾아서 혈관 주위 지방 조직 제거.</li>
	<li>대동맥을 cannulate 하 고 retrogradely 30 G 바늘 4 ° C 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS)의 0.5 mL 가득 1 mL 주사기에 부착 된 마음을 perfuse.</li>
	<li>관류, 후 심장, 소비 세 그리고 왼쪽 및 오른쪽 심 나눕니다. 간, 폐, 그리고 비장을 삭제할.</li>
	<li>차가운 PBS (4 ° C)에 두 세척 후 액체 질소에 극저온 튜브에 수집 된 모든 조직을 별도로 저장 합니다.</li>
</ol>7입니다. 단백질 식의 결정
<ol><li>프로 테아 제 억제 물 칵테일 1: 100의 비율에서 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼에 추가 하 여 균질 버퍼를 준비 합니다. 샘플 처리 수의 수에 따라 총 볼륨을 계산 합니다. 이후 사용에 대 한 4 ° C에서 준비 균질 버퍼를 유지.</li>
	<li>액체 질소 탱크에서 조직을 꺼내 주세요. 조직 높은-정밀 저울 (직물의 각 조각 위한 약 60 mg)에 무게.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 조직. Microcentrifuge 튜브에 200 µ L 균질 버퍼 및 precooled 1.5 m m 강철 공 (4 ° C) 즉시 추가 합니다.</li>
	<li>Precooled (4 ° C)에서 microcentrifuge 튜브 금속 홀더 연 삭 기, 자동 조직에 고 다음 설정을 사용 하 여 컴퓨터를 시작 하 여 균질을 개시: 주파수: 70hz; 시간: 120 s.</li>
	<li>균질, 후 원심 (16000 × g, 4 ° C), homogenate 하 고는 상쾌한 100 µ L 피펫으로 새로운 1.5 mL 튜브에 신중 하 게 전송 합니다.</li>
	<li>추가 로드 1: 4의 비율로 단백질 표면에 뜨는 솔루션 (5 배)를 버퍼링 하 고 5 분 동안 100 ° C에서 단백질을 변성.</li>
	<li>심장 및 기타 장기 조직에서 단백질 식 레벨은 더 서쪽 오 점 분석 (대표 결과 그림 2C 와 그림 3에 표시 됩니다)에 의해 모니터링 프로토콜에 따라 앞에서 설명한12.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

현재 보고서가 오 외. 심근 경색 유도 하는 방법에서 수정한 심장 유전자 조작에 대 한 바이러스 성 벡터의 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 기술을 보여줍니다. 13 현재, vivo에서 특성의 특정 유전자 기능 대부분 포함 녹아웃 또는 유전자 변형 쥐3,,1415,16,17 세대 , 비싼, 시간이 걸리는, 및 노동 집약. 또는 유전자 벡터 또는 조직 또는 지방 주입 하 여 siRNA의 전달 또한 널리 심장 혈관 연구4,,57에 유전자 조작에 대 한 연습입니다. 특히, intramyocardial 주입 특정 상황에서 심장 유전자 조작에 대 한 대체 될 수 없습니다: 때 사이트 감독 주입 필요 (예, 심근 경색 모델에서 테두리 영역 주입)11; 때 기간 제한 유전자 조작 필요 (예를 들어, 아 데 노 바이러스 주입)입니다. 여기, 우리는 수정된 intramyocardial 주입 메서드는 단순, 시간-절약, 및 고효율을 보였다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계 문제 해결:
이 프로토콜의 성공적인 운영에 대 한 몇 가지 중요 한 단계를 지적 한다. 전에 발음 바이러스, 해밀턴 주사기와 연결 된 바늘 공기 대피 해야 합니다, 그렇지 않으면 심근에 주입 하는 공기 발생할 수 있습니다 국 소 심장 상해 또는 죽음. 추가이 문제를 방지 하려면 준비-사용 해밀턴 주사기는 적절 한 바이러스 볼륨으로 가득 하지 두어야 한다 아래로, 플런저 끝이 자발적으로 금속 플런저의 중력에 의해 공기를 발음 수 있습니다 때문에. 마 취 해야 신중 하 게 모니터링, 깊은 마 취 후 작업 복구 지연 될 수 있습니다 그리고 심각 하 게 깊은 마 취 사망을 일으킬 수 있습니다. 적절 한 마 취 후 심장 해야 하지 수 externalized 가슴 구멍에서 힘에 의해 때문에이 심각한 폐 상해에 발생할 수 있습니다. 실제로, 적절 한 심장 외부화 마음, 부드럽게 밀어만 필요 하 고 어떤 저항 든 지 부적절 한 방향으로 밀어 나타낼 수 있습니다.
기술의 한계:
이 기법에서 절차에 필요한 시간을 줄여, 삽 관 법의 죽음을 피하기 위해 상대적으로 제한 된 시간 창에서 intramyocardial 주입 절차를 완료 해야 합니다 제안 합니다. 우리의 경험에의 하면 심장 해야 하지 이상 30 externalized 수 s,이 사망률을 증가 때문에 수술 후 회복 속도가 느려집니다. 따라서, 삽 관 법의 사용은 여기에서 설명 하는 프로토콜의 첫 번째 시도 대 한 권장 됩니다. 또 다른 한계는 또한 intramyocardial 주입7의 전통적인 방법에 있는이 방법으로 전달 하는 바이러스 성 벡터의 고르지 못한 배급 이다. 또한, 다른 심장 질환 모델18,,1920의 설립에 의해 지켜질 수 있다, 손상 되지 않은 마음에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 여기에 설명 하는 방법을 더 유용 21,,2223. 그러나, infarcted 마음 등 다친된 마음에 에이전트를 제공 하는 현재 메서드를 사용 하 여 있을 수 있습니다, 이러한 마우스 절차를 용납 하지 않을 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여 의미:
기존의 intramyocardial 주입 삽 관 법 그리고 기계 환기24, 필요 하 고 빠른 마우스 심장 박동으로 인해 주사 사이트를 찾을 수 어렵습니다. 이러한 문제는 크게 작업 시간13, 따라서 증가 변화 시간 지연으로 인 한 연장 됩니다. 여기에 제시 된 수정된 기술 빠른 이며 수동으로 외부화 심장;을 확보 하 여 정밀 사출 사이트 위치를 수 있습니다. 전반적으로, 후속 연구를 크게 potentiating입니다. 또한, 삽 관 법 그리고 기계 환기의 제거 수정된 메서드를 액세스할 수 있도록 거의 모든 실험실에.

심장 질환은 병 적 상태와 사망률 전세계1,2의 주요 원인. 심근 경색, 심장 마비 등 생명이 심장 상태에 대 한 효과적인 치료 전략의 부족에는 기본 pathomechanisms의 집중 탐구와 새로운 치료 옵션3의 붐 빕니다. 이러한 과학적인 탐험에 대 한 심장 관련 유전자 조작 널리4,5입니다. 심장 유전자 조작과 강력한 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nuclease (TALEN)를 사용 하 여 편집 하는 게놈에 의해 달성 될 수 있다 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 도구, 또는 소성 유전 물질 (예, 바이러스 벡터 관심사의 단백질을 부호화 하는 유전자를 나르는)의 전달6. 게놈 편집과 살아있는 생쥐에서 정확 하 고 spatiotemporal 게놈 수정 허용, 그것은 여전히 시간과 노동 집약 연습6. 또는, 바이러스 벡터 또는 작은 간섭 RNA (siRNA) 복잡 한 납품은 정기적으로 심장 관련 유전자 조작 수행6.
바이러스 벡터 배달 성인 마우스 마음에 대략 두 가지 전략에 의해 달성 된다: 조직 또는 지방 주입. Cardiotropic serotype AAVs AAV9 등의 조직의 주입은 심장 특정 유전자 조작7에 대 한 비 침 투. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환 및 유전자 발현에 필요한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 근육과 간7같은 nontarget 기관의 중요 한 변환에서 발생할 수 있습니다. 로컬 바이러스 주입 intramyocardial 주입 또는 intracoronary 배달7에 의해 이루어집니다. Intracoronary 납품 intramyocardial 주입에 비해 심장 내에서 바이러스의 더 동등한 배급에 지도 한다. 그러나,이 기술의 불리는 전신 순환과 nontarget 기관8, 그리고 작업 중 압력 측정 장치의 그 요구에 변환에 바이러스 성 벡터의 밖으로 빠른 세척. 대조적으로, intramyocardial 주입 하면 심근으로 사이트 특정 배달, 하지만 그것은 더 나은 바이러스 유지 실패 균일 하 게 배포 바이러스 성 벡터7. 작은 동물에 대 한 intracoronary 납품은 기술적으로 수행, 조직 AAV9 주입 intramyocardial 주입은 더 일반적으로 연습된4,,57어렵다. 조직의 주입은 실행 하기 쉬운, 기존의 intramyocardial 주입 기계 환기 및 thoracotomy, 광범위 한 조직 손상, 원인과 많은 시간이 소요 됩니다.
이 보고서에서 우리는 intramyocardial 주입에 대 한, 시간-절약, 쉽고 효율적인 방법 설명. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase와 VDR, 또는 shRNA 대상으로 VDR, 심장 유전자 발현 조작에 주입 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 다른 재료의 사출으로 서 유전자 조작,이 메서드를 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow sterile hood</td><td>Fengshi Animal Experimental&amp;nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinding machine</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>High temperature/high pressure sterilizer</td><td>Hirayama (Saitama, Japan)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, USA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III imaging system</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&amp;nbsp;balance</td><td>Sartorius (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Curved tip</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micro-mosquito hemostat</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Curved, tip width 1.3mm</td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Syringe</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luciferase antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Chloralic hydras</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang (Shanghai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Pore size 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer for western&amp;nbsp; blot</td><td>Beyotime (Shanghai, China)</td><td>P0013J</td><td>Without inhibitors</td></tr><tr><td>Ophthalmic cream</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel ball</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Width 1.5 mm</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Warm mat</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

유전자 조작에 특별히 크게 심장 질병 pathomechanisms 및 그들의 치료 잠재력 조사 약효. 심장 관련 유전자 배달 vivo에서 체계 또는 로컬 배달에 의해 일반적으로 이루어집니다. 꼬리 정 맥을 통해 조직의 주입은 간단 하 고 효율적인 재조합 형 adeno 관련 바이러스 9 (AAV9)를 사용 하 여 심장 유전자 발현 조작에. 그러나,이 메서드는 효율적인 변환에 대 한 벡터의 상대적으로 높은 금액을 요구 하며 nontarget 기관 유전자 변환에서 발생할 수 있습니다. 여기, 우리는 간단한, 효율적, 시간 절약 방법을 intramyocardial 사출의 비보에 심장 관련 유전자 조작 생쥐에 대 한 설명. (환기) 없이 마 취, 가슴 중요 하 고 작은 근육은 퉁 명 스럽게 해 부, 그리고 마우스 심장 4 있는 공간에 작은 절 개를 통해 수동 외부화에 의해 신속 하 게 노출 되었다. 그 후, 아 데 노 바이러스 인코딩 luciferase (루크)와 비타민 D 수용 체 (VDR), 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 대상으로 VDR, 심근에 해밀턴 주사기와 주입 했다. 후속 vivo에서 영상 시연 그 luciferase 성공적으로 특별히 마음에에서 overexpressed 했다. 또한, 서쪽 오 점 분석은 성공적인 overexpression 또는 마우스 마음에 VDR의 입을 확인 했다. 일단 마스터, 셀 또는 마우스 마음에 nanogels 같은 다른 물자의 주입으로 유전자 조작,이 기술을 사용할 수 있습니다.

실험 프로토콜 및 보고 방법에 대 한 주요 단계 중 일부는 그림 1에 표시 됩니다. 아 데 노비 루스 인코딩 luciferase (전진-루크)의 intramyocardial 주입 후 5 일, vivo에서 전진-뤽 주입 마우스에서 이미지 표시 했다 (그림 2A, B), 마음에 특별히 luciferase의 강력한 overexpression 서쪽 오 점 분석 (그림 2C), 제안 nontarget 장기 변환의 부재에 의해 확인. 대조적으로, 아무 luciferase 식 통제 쥐에 있는 발견 되었습니다. Luciferase의 성공적인 overexpression와 일치, 서양 분석 제안된 크게 증가 VDR 식 좌 심 실에 쥐의 VDR (전진-VDR) (그림 3A) 인코딩 하는 아 데 노 바이러스 주사 오 점. 또한, 전진 shVDR 주입 크게 좌 심 실 (그림 3B)에 VDR 식 감소. 대조적으로, VDR 식 변경 되지 않았습니다 크게 오른쪽 심도 전진 VDR 주입 마우스 또는 전진 shVDR 주입 마우스 (그림 3C, D)에 아 데 노 바이러스만 왼쪽된 심 실 심근에 주입 했다 때문에.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> 그림 1 . 마우스 intramyocardial 주입 및 유전자 표현 검색 프로토콜에 대 한 스키마. (A) 그림의 좌 심 실 심근에 3 사출 사이트를 보여주는. 표시 된 바이러스의 주입 후 마우스 마음에 유전자 식 검색 (B) 프로토콜. 전진-luciferase: 아 데 노 바이러스 luciferase; 인코딩 AdVDR: 아 데 노 바이러스 VDR; 인코딩 AdshVDR, 아 데 노 바이러스 인코딩 shRNA VDR를 대상으로 (C) 대표 이미지 마우스 intramyocardial 주입에 대 한 수정된 방법의 여러 단계를 표시 합니다. a. 상용 depilatory 크림 모피의 제거. povidone-요오드의 3 스크럽과 외과 사이트의 b. 균 c. 무 균 드 레이프와 외과 사이트 취재. d. 칼 및 겨드랑이 연결 하는 선 따라 0.5 cm 피부 절 개. e. 무딘 가슴 큰 집게와 마이크로-모기 hemostat 가슴 작은 근육의 해 부. 심장의 f. 외부화입니다. 해밀턴 주사기를 통해 좌 심 실 심근에 30 µ L 아 데 노비 루스 솔루션의 g. 주입 h - 5-0 비단 봉합 사로 봉합 하는 지갑-문자열에 의해 피부 나 폐쇄. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> 그림 2 . 마음에 luciferase 식의 검출. (A) 이미지 제어 마우스 및 마우스 주입 후 5 일 luciferase 인코딩 하는 아 데 노 바이러스 주입에 심장의 발광 신호를 보여주는 이미징 시스템에 의해 수집 된. 서로 다른 그룹에 (B) 발광 신호 강도 (n = 3) t 검정에 의해 통계 분석을 복종 된다. p < 0.01 제어 마우스 대. (C) 서쪽 오 점 분석 결과 마음에 luciferase 단백질 수준을 보여주는, 폐, 간, 그리고 비장에 아 데 노 바이러스 주입 후 5 일에 그룹 표시 (n = 3). 이후 luciferase 식만 전진-뤽 주입 쥐의 심장에 감지 했다, 통계 분석은 수행 되지 않습니다. 전진-루크: 아 데 노 바이러스 luciferase 인코딩입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> 그림 3 . 마음에 VDR 식의 검출. (A) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 5 일, 7 일, 14 일 adv VDR 주입 후에 (여기서는 아 데 노 바이러스 주입) 좌 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). 결과는 GAPDH에 대 한 정규화 하 고 접어 0 하루를 기준으로 변경으로 변환 했다. 단방향 분산 분석 (ANOVA) Bonferroni 후 테스트 (등분산 가정) 다음 또는 Tamhane 테스트 후 (등분산 하지 생각) 통계 분석을 위해 수행 되었다. p < 0.05 또는 * *p < 0.01 0 일 대. (B) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 3 일, 5 일, 그리고 7 일 전진 shVDR 주입 후에 좌 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). p < 0.05 0 일 대. (C) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 5 일, 7 일, 14 일 adv VDR 주입 후에 (여기서는 아 데 노 바이러스 하지 주입) 우 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). (D) 상단 패널: 서쪽 오 점 0 일, 3 일, 5 일, 그리고 7 일 전진 shVDR 주입 후에 우 심 실에서 보여주는 VDR 수준 밴드. 하단 패널: 서로 다른 그룹에 VDR 식 레벨의 반 정량적 분석 (n = 4 시간 마다). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.8K 조회수.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. 여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

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Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

연구

의학

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

유전학

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

발생학

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Electroporation-based transgenesis of Cardiac cells in mouse hearts(생쥐 심장의 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환)

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

저자 스포트라이트: 신속한 유전자 스크리닝을 위한 심장 세포 형질전환(Cardiac Cell Transgenesis)

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

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마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

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