RNA שונה היא שיטה חדשנית להעברת גנים ללב, ואיברים אחרים. פרוטוקול זה יספק גישה מדויקת של אספקת הגנים הרצויים באופן ארעי ללב, לאחר אוטם שריר הלב. שיטה זו אינה מוגבלת לאוטם שריר הלב, אך ניתן להחילה גם על כתוצאה מכך, ומודלים של התכווצות אבי הרוח הרוחב.
RNA שונה נמצא בשימוש במספר ניסויים קליניים בבני אדם. עם זאת, אין פרוטוקול מתוקן לגן המועבר ללב בשיטה זו. הדגמה חזותית תאפשר לחוקרים להזריק כראוי RNA שונה באתרים המתאימים בלב.
הפגנת הפרוצדורה תהיה אג'יט מגדום, פוסט דוקטורנט, ואלנה צ'פורקו מפקחת על בעלי חיים מהמעבדה שלנו. בהתבסס על הריכוז של modRNA שהוכן בעבר ב modRNA, לחשב את נפח modRNA הדרושים להזרקת 100 מיקרוגרם. עושה כמויות שוות של פתרונות סוכרוז וציטראט.
לאחר מכן הוסיפו את הנפח המחושב של modRNA, ומספיק תמיסת מלח כדי להביא את נפח ההזרקה ל-60 מיקרוליטרים. לאחר הרדמה של החיה, מניחים אותה בצד הגחון כלפי מעלה, עם פיו פונה לכיוון הניסוי. לאחר מכן, כדי לשמור על דרכי הנשימה הפתוחות על ידי ביצוע צנרור תוך-מאמץ, משוך בעדינות את הלשון.
כוונן את זווית הצוואר כדי ליישר את נתיב הצנרור, ולדחוף את cannula הצנרור. שימו לב לתנועת בית החזה של העכבר כדי לוודא ששתי הריאות מקבלות חמצן. קצב הנשימה צריך להיות כ 120 נשימות לדקה.
כדי להתחיל את הרצועה LAD, להפוך את העכבר בזהירות על הצד הימני שלה. להרים את העור, ולבצע כריתת חזה בצד שמאל בין הצלעות השלישית והרביעית. פתח את בית החזה בזהירות, מבלי לגעת בריאות עם חפצים חדים.
מניחים מפשקים לתוך החתך כדי לשמור על חלל בית החזה פתוח, מתן תצוגה ברורה של הלב. לאחר מכן, להזיז את הריאות לקצה החתך, ולהסיר את החלק של הדם הצלע כי הוא מכסה את הלב. זהה בזהירות את LAD, כלי אדום באור עמוק, הממוקם בין עורק הריאה לבין האוריאל השמאלי.
ליגטה LAD proximal עם תפר משי יחיד. באמצעות מזרק אינסולין, לספק סך של 60 microliters של פתרון modRNA ללב. להזריק 20 microliters תוך שרירית, בשלושה אתרים שונים.
אתר אחד בכל צד של הרצועה ואחד ב לשיא הלב. הדרך הטובה ביותר להזריק את RNA שונה באתרים הנכונים, היא לבחון את שינוי הצבע של הרקמה תחת מיקרוסקופ, לאחר ההרסה של LAD. גם כאשר מוזרק, לא ללכת עמוק מדי לתוך הרקמה כדי להגיע תאי הלב לתוך זרימת הדם.
סגור את החתך בבית החזה בשכבות. השימוש הראשון היה 6-0 תפרים ריצת משי כדי להתאים את הצלעות. לאחר מכן השתמש 5-0 תפרים ריצת משי כדי לסגור את העור.
לשלב ההחלמה, להסיר את ה Cannula, ולאפשר נשימה ספונטנית. מניחים את החיה על משטח חימום עד שהיא חוזרת להכרה. אין להשאיר את החיה ללא השגחה עד שהיא ערה לחלוטין.
כדי לנהל כאב פוסט-ורגלי, הזרקת buprenorphine תת עורית במרווחים של 12 שעות במשך שלושה ימים. במינון של 0.1 מיליגרם לקילוגרם של משקל גוף. 24 שעות לאחר רצועות LAD והזרקה של modRNA לוציפראז בעכברי CFW, transfection אומתה על ידי בדיקת ביטוי חלבון לוציפראז באמצעות מערכת הדמיה bioluminescence.
אות luciferase ניתן לזהות בבירור בתמונות השוואת עכברי בקרה, לעכברים מוזרק עם modRNA לוציפראז. כימות אות לוציפראז מראה ביטוי חלבון גבוה משמעותית בעכברים מטופלים מאשר בעכברי בקרה. ביטוי Cre modRNA אומת על ידי בדיקת התרגום וההפצה הביולוגית שלו בעכברי ROSA26 mTmG מהונדסים.
24 שעות לאחר הניתוח והזרקת cre modRNA, האמנויות תוקנו ומעובדות לכשל חיסוני עם סמן קרדיומיוציט, טרופונין לב I ו- DAPI סמן גרעיני. הבעת קרי מוצלחת ניכרה בשל הופעתם של קרדיומיוציטים בצבע ירוק. תמונה ממוזגת מציגה תאים המופעלים על-ידי cre סביב שני אתרי ההזרקה הנראים לעין.
כחול הוא DAPI כתם גרעיני. פלטפורמת RNA שונה יכולה לספק שילובי גנים או גנים בודדים במגוון איברים. וכך ניתן להשתמש למטרות טיפוליות, כגון תיקון הפרעות גנטיות, או הפעלת מנגנונים מועילים בגוף.
הפרמקוקינטיקה הייחודית של רנ"א שונה מאפשרת לנו להעריך את תפקוד הגנים מיד לאחר הזרקתו. זה מאפשר לחוקר למקד מסלולי איתות, אשר משתנים בשעות הראשונות של אוטם.
