אנחנו אסירי תודה ד ר רוברט Heinzen על מתן מניות של ביטוי mCherry Coxiella burnetii. אנו מודים ד ר לואיס טיישיירה על מתן וירוס ססגוני הגעה 6 מרכז מניות בלומינגטון מתן מניות לעוף. פרויקט זה מומן בחלקו על ידי NIH מענק R00 AI106963 (A.G.G.) ואת אוניברסיטת מדינת וושינגטון.

1. זיהום ex-vivo
<ol><li>בינוני וציוד<ol>
<li>תחת תנאים סטריליים, להכין טרי דרוזופילה Hemocyte בידוד בינוני (DHIM) הכוללת של 75% שניידר דרוזופילה בינוני עם 25% סרום שור עוברית (FBS) ומסנן לחטא זה.</li>
		<li>שכבה 2-3 חתיכות של 10 ס"מ על 10 ס"מ הסרט פרפין תחת stereomicroscope.</li>
		<li>הכינו את נימי זכוכית. הגדר את החימום פולר נימי 55% לכל היותר. משוך את צינור קפילרי כדי ליצור קצה חד של-10 מיקרומטר.</li>
		<li>מילוי נימי עם שמן מינרלי.</li>
		<li>להרכיב צינור קפילרי מלא על גבי nanoinjector (איור 1א') ופתח צינור קפילרי מאוחה עצה על ידי שבירת את קצהו עם מלקחיים (איור 1B). הקוטר החיצוני של הטיפ צריך להיות 100 מיקרומטר עבור ספיגת קל של hemocytes.</li>
		<li>להוציא כמה שיותר שמן ככל האפשר מקצה צינור קפילרי ולאחר מכן למלא את DHIM. להמחשת קל של הגבול של hemolymph למעלה, אני מסודר, והשמן, כוללים בועת אוויר בין שמן DHIM (איור 1ב'').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph החילוץ<ol>
<li>לבחור 3rd instar דרוזופילה הזחלים מבפנים קיר של מזון שבקבוקי בעדינות באמצעות מלקחיים, למקם אותם לתוך מסננת 100 מיקרומטר (איור 1C). 3rd לחלל הזחלים מצויים 3-6 ימים בעקבות הביצה פוריה הנחת על ידי אישה מבוגרת. הערה: ניסויים אלה להשתמש את גנוטיפ, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, מאחר hemocytes של החיות האלה מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) כדי לסייע בזיהוי של התאים על-ידי מיקרוסקופיה משופרות.</li>
		<li>שופכים 5 מ ל מים סטריליים הזחלים ולנער את מסננת על המקום ס' 5 מסננת על פעילות מחיקה להסיר את עודפי המים (איור 1ג').</li>
		<li>להעביר את הזחלים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. עזים ומתנגד אותם עם גז CO2 5 s (איור 1D).</li>
		<li>מניחים את הזחלים על גבי הסרט פרפין תחת stereomicroscope, בצד הגבי פונה כלפי מעלה (איור 2א).</li>
		<li>מקום הזכוכית נימי בקלילות אל הגוף האחורי זחל שיצמיד אותו למקום בו לשבש את הקוטיקולה אחורי פתח באמצעות מלקחיים המחודד בסדר (איור 2B).</li>
		<li>אפשר את hemolymph לזרום אל הסרט פרפין (איור 2C).</li>
		<li>להכין מאגר של hemolymph כולל hemocytes מ- 20-50 הזחלים בכל פעם על הסרט פרפין.</li>
		<li>תופסים hemolymph במאגר באמצעות הזכוכית נימי-nanoinjector (איור 2D). הערה: צריך להיות בערך 10-20 µL של hemolymph.</li>
		<li>הוצא את hemolymph לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 500 µL של DHIM (איור 2E).</li>
		<li>חזור על שלבים 1.2.4) - 1.2.9) על כל הזחלים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לספור את מספר hemocytes.<ol>
<li>פיפטה 5 µL של 0.4% פתרון Trypan blue בצינור microcentrifuge 0.6 מ"ל כדי להכתים את התאים המתים. בעדינות לערבב את DHIM ואת hemocytes בצינור 1.5 mL באמצעות פיפטה, ולא להעביר 5 µL של DHIM כולל hemocytes אל הצינור microcentrifuge 0.6 מ"ל ומערבבים בעדינות.</li>
		<li>פיפטה 10 µL של תאים מ- 1:1 Trypan blue: hemocyte התערובת לתוך hemocytometer.</li>
		<li>לספור את מספר hemocytes בשידור חי זה לא מוכתמים Trypan כחול כל אחד מהשדות בפינה של hemocytomter ולחשב את ריכוז hemocytes למיליליטר באמצעות הנוסחה: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> כאשר X הוא הריכוז של hemocytes חיה למיליליטר; a, b, c ו- d הם מספר תאים חיים (כפי שנקבע על ידי הדרה Trypan blue) כל 4 של השדות במניין את hemocytometer. חילוק ב 2 המספר הכולל של תאים נספרים הוא דילול 1:1 של התאים עם Trypan blue. תאים מוכתם Trypan blue נחשב מת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex-vivo זיהומים<ol>
<li>לקבוע מספר בארות כדי להיות נזרע עם תאים בהתבסס על timepoints, ביולוגיים משכפל לצורך ניסוי. 5.0 × 104 hemocytes הם רצויים לטיהור RNA וחלבון בעקבות זיהום.</li>
		<li>לחשב את עוצמת הקול של פתוגן מניות כדי לדלל אותו עם DHIM זיהום באמצעות הנוסחה הבאה: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> איפה ריבוי של זיהום (MOI) הוא המספר של נגיפי או חיידקים הרצוי בכל תא. הערה: MOI בשימוש תלוי בניסוי בודדים ואת מבחני שבוצעה. . הנה, הגנום 10 מקבילות (GE) / תא burnetii ג, 10 CFU/תא ליסטריהאו 150TCID /cell של IIV6 היה בשימוש.</li>
		<li>להכין µL 500 של פתוגן בינוני כל טוב של צלחת 24-טוב על-ידי הוספת נפח מתאים של DHIM לאמצעי האחסון נגיפי או חיידקי בשפופרת.</li>
		<li>המקום 12 מ מ עגול כיסוי זכוכית (מס ' 1 עובי) בטוב של צלחת 24-. טוב.</li>
		<li>לפצל את DHIM כולל את hemocytes לתוך בארות של צלחת 24-. טוב.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של פתוגן בינוני hemocytes בטוב.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת ב 1,000 x g למשך 5 דקות.</li>
		<li>דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 28 מעלות צלזיוס. כל 15 דקות, להטות בעדינות את הצלחת בחזרה קבלה, ואז משמאל לימין עבור 5 s ביד.</li>
		<li>לאחר האחד עשר של הפלישה/מצורף צעד 1.4.8), בעדינות פיפטה את המדיום הפתוגן לשטוף את hemocytes עם DHIM טריים ו למלא אותו עם 500 µL של DHIM טריים.</li>
		<li>תקופת דגירה של hemocytes נגוע של הזמן המבוקש. בניסויים אלה, burnetii ג- או נגועה IIV6 hemocytes מודגרת למשך 24 שעות, ליסטריה-hemocytes נגוע מודגרת למשך 1, 2 או 4 שעות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. זיהום in vivo
<ol><li>זיהום<ol>
<li>חמים צלחת אגר דרוזופילה מיץ פירות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות לוחות עשויים כאמור תיאר20.<ol>
<li>להוסיף 30 גרם של אגר 700 מ"ל של מים ושל אוטוקלב זה למשך 40 דקות.</li>
			<li>להמיס 0.5 גר' מתיל paraben ב- 10 מ"ל אתנול מוחלטת.</li>
			<li>הוסף את הפתרון paraben מתיל 300 מ ל תרכיז מיץ פירות.</li>
			<li>במהירות לערבב להתרכז מיץ בתוך תמיסת אגר בלוק, לוותר על 5 מ ל 10 × 35 מ מ פטרי.</li>
			<li>לאחר הצלחות קיררה למשך 15 דקות, לאחסן אותם ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין 3rd לחלל הזחלים ביצוע השלבים 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>מניחים את העיסה שמרים על צלחת אגר. לעשות חתך בסדר בצלחת אגר איפה הזחלים ניתן להעביר כדי למנוע ייבוש (איור 3א). להרכיב מחט טונגסטן המחודד מ מ 0.001 עם מחזיק מלקחיים באמצעות סרט פרפין (איור 3B, C).</li>
		<li>פיפטה 50 µL של mCherry גבוהה-כייל לביטוי -burnetii ג (5.95 × 109 ג ' נרל אלקטריק/mL) על גבי הפרפין סרט תחת המיקרוסקופ סטריאו ולמקם את הזחלים לתוך הבריכה של חיידקים.</li>
		<li>מקם את הזחלים לתוך הבריכה של חיידקים. . שמוק הזחלים עם מחט טונגסטן (איור 3ד') להעביר את הזחלים על גבי צלחת אגר (איור 3E).</li>
		<li>להעביר את המדיום הפתוגן הנותרים על צלחת אגר, לאטום את הצלחת עם סרט פרפין.</li>
		<li>להשאיר את הזחלים בצלחת באוויר לח עד הזיהום שלאחר הזמן הרצויים (איור 3F). בניסוי זה, burnetii ג-נגועים הזחלים הם על הצלחת במשך 24 שעות ביממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph החילוץ, ציפוי של hemocytes<ol>
<li>להכין את בינוני ציוד בעקבות צעד 1.1).</li>
		<li>המקום 12 מ מ עגול כיסוי זכוכית (מס ' 1 עובי) בטוב של צלחת 24-. טוב. פיפטה 500 µL של DHIM לתוך הבאר.</li>
		<li>לחלץ את hemolymph של הזחלים נגוע ביצוע השלבים 1.2.4) - 1.2.8).</li>
		<li>הוצא את hemolymph לתוך גם בעקבות צעד 2.2.2).</li>
		<li>חזור על 2.2.3) ו 2.2.4) עבור קבוצות מרובות של הזחלים.</li>
		<li>Centrifuge את הצלחת ב 1,000 x g למשך 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>תיקון ולא מכתים<ol>
<li>לאחר ומאפשר את hemocytes להתיישב על הזכוכית המכסה העגול בתוך הבאר, להסיר בעדינות את המדיום מכל קידוח.</li>
		<li>בעדינות להוסיף 200 µL של 4% paraformaldehyde (PFA) כל טוב של hemocytes התיישבו. דגירה של hemocytes עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להסיר את % 4 מחברים ולהוסיף בעדינות µL 200 ל- PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 ו- 1% אלבומין שור (BSA) כל טוב. דגירה של hemocytes 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להסיר את PBS ולהוסיף בעדינות µL 200 של 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי מכל קידוח. דגירה של hemocytes 10 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר את הפתרון דאפי ולהוסיף בעדינות PBS מכל קידוח. דגירה של hemocytes עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>ירידה 10 µL של המדיום antifade גובר על משטח זכוכית מיקרוסקופ.</li>
		<li>לאחר הסרת מגניב מכל קידוח, הסר הזכוכית המכסה הצלחת 24-ובכן באמצעות מלקחיים הארכית פיין. הנח בעדינות את הזכוכית המכסה על המדיום הרכבה antifade בשקופית זכוכית, עם hemocytes פונה כלפי מטה.</li>
		<li>לאפשר את השקופית להתייבש על-ידי הצבתו של הלילה האפל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה קונפוקלי<ol>
<li>קביעת התצורה של מיקרוסקופ קונפוקלי להדמיית צבע שלוש של דאפי, EGFP ו- mCherry. השתמש בהגדרה הבאה: עירור דאפי (לשעבר) 405 ננומטר, פליטה (em) 415-480 ננומטר; EGFP לשעבר 488 ננומטר, em 493-564 ננומטר; mCherry לשעבר 587 ננומטר, em 597-700 nm.</li>
		<li>למקם את הדגימה על המיקרוסקופ, דגש על המדגם באמצעות 63 X / 1.4 מטרת מפתח נומרי (NA). אתר hemocytes הרצוי בתחום התצוגה עבור הדמיה.</li>
		<li>להתאים את רווחי כוח, גלאי לייזר על מנת להשיג חשיפה המתאימה של המדגם. בדוק z-מישורים מרובים כדי להבטיח שרמת החשיפה מתאים העובי המדגם כולו.</li>
		<li>לאתר את המיקום העליון והתחתון על ציר z של hemocyte כולו. הגדר תפקידים אלה מיקומי ההתחלה והסיום עבור z-חלוקתה.</li>
		<li>השתמש רק זום סריקה תמונת אזור הכולל את hemocyte. זום גורמים של 3 X משמשים לעתים קרובות.</li>
		<li>לאסוף את סדרת תמונות ברזולוציה המתאימה כגון 1024 x 1024 פיקסלים במישור x-y, ומרווח 0.3 מיקרומטר בממד z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שחזור דגם תלת-ממד הערה: תוכנת קוד פתוח קיימת המבצעת מהפונקציות המתוארים להלן עבור שחזור דגם התלת-ממד.<ol>
<li>לייבא קובץ סדרת z-למחלקה התמונה לתוך התוכנה המשויכים מיקרוסקופ קונפוקלי עבור שחזור דגם התלת-ממד.</li>
		<li>בחר בתא מציג שיתוף לוקליזציה של גרעינים צבעונית עם דאפי, mCherry הבעת burnetii ג ב EGFP לבטא hemocyte. לחתוך את הסידרה התמונה כדי להכיל רק התא הבודד.</li>
		<li>בחר באפשרות הצופה 3D, אשר משחזר את דגם התלת-ממד באמצעות אלגוריתם ארוזים מראש של התוכנה. בחר בסוג הרצוי של ייצוג תלת-ממד בין תערובת, משטח ואפשרויות מעורבת. בשיטה זו, hemocytes, גרעינים, ג burnetii מוצגים באמצעות מודלים השטח.</li>
		<li>להתבונן התא המשוחזרת 3D מזוויות צפייה שונות על-ידי החזקת לחצן העכבר וגרירת הסמן סביב המסך. התאם את הכיוון התא ואת המיקום של מקור האור מעוצבת כדי למטב את התמונה. קיימות גם אפשרויות אחרות עבור אטימות, מינימום הסף המרבי, Specular, אמביינט, Shineness ואת גמא כדי למטב את התמונה.</li>
		<li>קח חתכים דרך המודל באמצעות מסיכה ואופטים כדי להמחיש את תכולת hemocyte הפנים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. יישום לניתוח ג'ין ו/או חלבון
<ol><li>בעקבות הזיהום עם IIV6, ליסטריה, lyse תאים עבור לרביעיית עוקבות-PCR או ניתוח תספיג תיאר כאמור21 והוראות היצרן הבא. הערה: עיין טבלה של חומרים עבור צבעי יסוד לרביעיית-PCR והנוגדנים עבור תספיג חלבון.</li>
	<li>לנתח PCR מוצרים על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose, כפי שתואר לעיל22, כדי להבטיח אורך תקין של המוצר מוגבר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+of+Drosophila.">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li><li>Regan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steroid+hormone+signaling+is+essential+to+regulate+innate+immune+cells+and+fight+bacterial+infection+in+Drosophila.">Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).</li><li>Yano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagic+control+of+listeria+through+intracellular+innate+immune+recognition+in+Drosophila.">Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila.</a> Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).</li><li>Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Bacterial+Factors+Control+Susceptibility+of+Drosophila+melanogaster+to+Coxiella+burnetii+Infection.">Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection.</a> Infect Immun. 85 (7), (2017).</li><li>Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+hemocyte+load+is+associated+with+increased+resistance+against+parasitoids+in+Drosophila+suzukii,+a+relative+of+D.+melanogaster.">High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster.</a> PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).</li><li>Tsuzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+between+humoral+and+cellular+immune+responses+in+Drosophila.+is+guided+by+the+cytokine+GBP.">Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP.</a> Nat Commun. 5, 4628 (2014).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Drosophila.+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens.">Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).</li><li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+Drosophila+immunity.">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li><li>Arefin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+Hemocytes+Induces+a+Shift+in+Effector+Mechanisms+in+the+Drosophila.+Immune+System+and+Leads+to+a+Pro-Inflammatory+State.">Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State.</a> PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).</li><li>Rus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+Filamin-240+in+Drosophila+blood+cells.">Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells.</a> Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).</li><li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemese,+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein,+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila.">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).</li><li>Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicing+of+viral+replication+intermediates+during+silencing+of+latent+Drosophila+viruses.">Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).</li><li>Jovel, J., Schneemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Drosophila+cells+persistently+infected+with+Flock+House+virus.">Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus.</a> Virology. 419 (1), 43-53 (2011).</li><li>Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+extracting+hemocytes+from+wild+caterpillars.">A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars.</a> J Vis Exp. (69), e4173 (2012).</li><li>Sampson, C. J., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+ex+vivo+incubation+of+Drosophila+primary+post-embryonic+haemocytes+for+real-time+analyses.">Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses.</a> Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).</li><li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster.">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fruit+juice+egg+plates.">Drosophila fruit juice egg plates.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).</li><li>Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+Iridescent+Virus+6,+a+DNA+Virus,+Stimulates+a+Mammalian+Innate+Immune+Response+through+RIG-I-Like+Receptors.">Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors.</a> PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva.">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li><li>Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+inverse+Poisson+distribution+to+calculate+multiplicity+of+infection+and+viral+replication+by+a+high-throughput+fluorescent+imaging+system.">Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.</a> Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).</li><li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina.">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li><li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li><li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus.">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li><li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus:+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus.">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li><li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole.">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2++and+have+different+activity+in+vitro.">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li><li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila.">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li><li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells.">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li><li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development.">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li><li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting.">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq.">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li><li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution.">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כדי להבין טוב יותר איך נדבקים התאים המארחים, חשוב להבהיר הלוקליזציה של פתוגן בתאים, במיוחד כאשר ערך ניסויים על הפתוגן נבדק בעבר ותא סוג שילובים4. בעוד לומד את המפל תגובת תאי בעקבות זיהום יכול להצביע על פלישת פתוגן פרודוקטיבי, השילוב של נתוני ההיענות הדמיה וסלולריות חיוני כדי ל...

דרוזופילה melanogaster הוא אורגניזם מודל ומבוססת המחקר של מולדת חסינות1. במהלך התגובה החיסונית מולדת, hemocytes יש תפקיד חשוב בתגובה לאתגר הפתוגן. Hemocytes הם קריטיים עבור לבצע טפילים, כמו גם יש תפקיד חשוב במאבק נגד המחלה דרך פעולה phagocytic במהלך זיהום פטרייתי, ויראלי, חיידקי2,3.
על מנת להבין בצורה הטובה ביותר של המחשב המארח תגובה חיסונית מולדת לזיהום חיידקים פתוגניים, חשוב להמחיש איך הפתוגן חודר התאים המארחים במהלך זיהום. הדמיה זו תורמת להבנת המנגנון של פלישה. יחד עם הפרטים של פתוגן לוקליזציה תאיים ואת התגובה התאית, נתונים אלה יכולים לספק רמזים על התגובה מארח זיהום, את organelles הסלולר שבה אינטראקציה תא החיידק. לפיכך, דגם התלת-ממד שחזור לאחר הדמיה על ידי מיקרוסקופ יכול להיות מועיל לקבוע את המיקום המדויק של פתוגנים בתוך התאים המארחים. במחקר זה, אנו דמיינו את הפלישה Coxiella burnetii (burnetii ג), סוכן סיבתי של קדחת Q, מחלה נגיפית אשר מהווה איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים, לתוך ראשי דרוזופילה hemocytes. לאחרונה, הוכח כי דרוזופילה רגישים רמת אבטחה 2 פאזות 9 מייל II (NMII) לשבט 4 מזן burnetii ג ו הזן זה אפשרות לשכפל דרוזופילה4, המציין את דרוזופילה יכול לשמש כאורגניזם מודל ללמוד burnetii ג פתוגנזה.
מחקרים קודמים השתמשו hemocytes כדי לבדוק תגובה חיסונית מולדת של המחשב המארח. Hemocytes שימשו הבחנות מורפולוגיות5,6,7, morphometric ניתוח2,8, phagocytosis ניתוח2,3, לרביעיית-PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, ניתוח immunofluorescent10,12immunostaining13,3,immunoblotting10, 9, 11 ו אימונוהיסטוכימיה14. למרות דרוזופילה S2 תאים זמינים גם עבור ניסויים במבחנה שונים, immortalization, פוטנציאל זיהום ויראלי הקיימת מראש לשנות התנהגות שלהם,15,16. השימוש העיקרי תאים לעומת קו תא מונצחים, כגון תאים S2, מאפשר המחקר של תפקוד מערכת החיסון מולדים במערכת יותר ייצוגית של האורגניזם כולו. בנוסף, הזיהום של hemocytes ויוו, לפני החילוץ, מאפשר את התאים אינטראקציה עם המארח חלבונים אחרים רקמות, יתרון על החילוץ של hemocytes לפני שמחוץ זיהום. כבר מנוצל מספר שיטות שונות להשגת מספר מספיק של hemocytes בתקופה קצרה של זמן לשמור את hemocytes בחיים8,17,18,19.
במחקר זה, אנו מציגים שיטה כדי לחלץ hemocytes דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים זיהום חיידקים פתוגניים burnetii ג, ליסטריה (ליסטריה) או חסרי חוליות ססגוני וירוס 6 (IIV6). אנו מתארים את פעולות השירות עבור זיהומים hemocyte הן vivo והן ex-vivo . In vivo- ו - ex-vivo-hemocytes הנגועים היו דמיינו מיקרוסקופיה קונפוקלית, ששימשו לבניית מודלים 3D הפלישה burnetii ג . בנוסף, באמצעות פרוטוקול החילוץ, ex-vivo-hemocytes נגועות שימשו עבור ביטוי גנים וחלבונים מבחני. באופן ספציפי, לבחון את היקף זיהום עם IIV6, ליסטריה, הכולל RNA או חלבון היה מבודד את התאים לרביעיית-PCR או ניתוח תספיג. יחדיו, הפרוטוקול מספקת שיטות לאסוף במהירות מספר גבוה של hemocytes מן 3rd לחלל הזחלים וראיות hemocytes הראשית, נגוע או ויוו או vivo לשעבר, הם פלטפורמה מתאימה עבור חיידקים הפתוגן זיהום מחקרים וניתוחים במורד הזרם הרלוונטיים כגון מיקרוסקופ, transcriptomics פרוטאומיקס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1128px;" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:303px;">Schneider&#39;s Drosophila Medium&#160;</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:145px;">21720024</td>
			<td style="width:179px;">1.1.1), 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:288px;">GE Healthcare Life Sciences&#160; (HyClone)</td>
			<td style="width:145px;">SH30070.03HI</td>
			<td style="width:179px;">1.1.1), 2.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Filter (0.22 &#181;L)</td>
			<td style="width:288px;">RESTEK</td>
			<td style="width:145px;">26158</td>
			<td style="width:179px;">1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Strainer (100 &#181;m)</td>
			<td style="width:288px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:145px;">542000</td>
			<td>1.2.1), 2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:288px;">Amscope</td>
			<td style="width:145px;">SM-1BSZ-L6W</td>
			<td style="width:179px;">1.2), 2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">21-171-4</td>
			<td style="width:179px;">1.1), 1.2), 2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Capillary puller</td>
			<td style="width:288px;">Narishige International USA, Inc.</td>
			<td style="width:145px;">PC-10</td>
			<td style="width:179px;">1.1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:288px;">Snow River Products</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:179px;">1.1.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Nanoinjector</td>
			<td style="width:288px;">Drummond Scientific Company</td>
			<td style="width:145px;">3-000-204</td>
			<td style="width:179px;">1.1), 1.2), 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Forceps</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">82027-402</td>
			<td style="width:179px;">1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:303px;">CO2 delivery apparatus</td>
			<td style="width:288px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:145px;">59-122BC</td>
			<td style="width:179px;">1.2), 2)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td style="width:145px;">15250061</td>
			<td style="width:179px;">1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:288px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:145px;">3100</td>
			<td style="width:179px;">1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">24 well plate</td>
			<td style="width:288px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:145px;">662160</td>
			<td style="width:179px;">1.4), 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Coxiella burnetii - mCherry</td>
			<td style="width:288px;">Dr. Heinzen, R.</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:179px;">1.4), 2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:303px;">Drosophila fruit juice plates</td>
			<td style="width:288px;">Cold Spring Harbor Protocols</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Agar</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:145px;">BP1423-500</td>
			<td style="width:179px;">2.1.1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Methyl paraben</td>
			<td style="width:288px;">Amresco</td>
			<td style="width:145px;">0572-500G</td>
			<td style="width:179px;">2.1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:303px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:145px;">BP2818-500</td>
			<td style="width:179px;">2.1.1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:303px;">Welch&#39;s 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td>
			<td style="width:288px;">Amazon</td>
			<td style="width:145px;">B0025UJVGM</td>
			<td style="width:179px;">2.1.1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:303px;">Petri dishes, 10 x 35 mm</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08-757-100A</td>
			<td style="width:179px;">2.1.1.4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-545-80</td>
			<td style="width:179px;">1.4.4), 2.2.2)</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:303px;">Yeast, Bakers Dried Active</td>
			<td style="width:288px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:145px;">0210140001</td>
			<td>2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Tungsten needle</td>
			<td style="width:288px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">10130-20</td>
			<td style="width:179px;">2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Holding forceps</td>
			<td style="width:288px;">VWR</td>
			<td style="width:145px;">HS8313</td>
			<td style="width:179px;">2.1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">FLO4042-500</td>
			<td style="width:179px;">3.1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP151-500</td>
			<td style="width:179px;">3.1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP9706-100</td>
			<td style="width:179px;">3.1.3)</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:303px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">62247</td>
			<td style="width:179px;">3.1.4)</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:303px;">Antifade mounting medium</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">P36930</td>
			<td style="width:179px;">3.1.6)</td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;width:303px;">Confocal microsope</td>
			<td style="width:288px;">Leica</td>
			<td style="width:145px;">TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td style="width:179px;">3.2)</td>
		</tr>
		<tr height="103">
			<td height="103" style="height:103px;width:303px;">3D imaging reconstruction software</td>
			<td style="width:288px;">Leica</td>
			<td style="width:145px;">LASX with 3D visualization module</td>
			<td style="width:179px;">3.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:288px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-552-3</td>
			<td style="width:179px;">3.1.6)</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:303px;">Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td>
			<td style="width:288px;">Dr. Teixeria, L.</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td>
		</tr>
		<tr height="141">
			<td height="141" style="height:141px;width:303px;">Listeria monocytogenes</td>
			<td style="width:288px;">ATCC</td>
			<td style="width:145px;">strain: 10403S</td>
			<td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &#181;g/ml streptomycin at 30 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">DNase I</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td>
			<td style="width:145px;">18068015</td>
			<td>gDNA degradation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:288px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">1708891</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">IIV6_193R_F</td>
			<td style="width:288px;">IDT</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>qRT-PCR, 5&#39;- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">IIV6_193R_R</td>
			<td style="width:288px;">IDT</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>qRT-PCR, 5&#39;- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">RpII_qRTPCR_fwd</td>
			<td style="width:288px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>qRT-PCR, 5&#39;- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:303px;">RpII_qRTPCR_rev</td>
			<td style="width:288px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>qRT-PCR, 5&#39;- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">SYBR Green qRT-PCR reagent</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">K0251, K0252, K0253</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:303px;">Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:288px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">4351107, 7500 Software v2.0</td>
			<td>qRT-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Anti-Listeria monocytogenes antibody</td>
			<td style="width:288px;">abcam</td>
			<td style="width:145px;">ab35132</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Anti-Actin antibody produced in rabbit</td>
			<td style="width:288px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:145px;">A2066</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td>
			<td style="width:288px;">Promega</td>
			<td style="width:145px;">W4011</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis

במהלך זיהום פתוגניים של דרוזופילה melanogaster, hemocytes יש תפקיד חשוב בתגובה החיסונית לאורך כל הזיהום. לכן, המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח שיטה כדי להמחיש את פלישת פתוגן בתא החיסון הספציפי של זבובים, כלומר hemocytes. באמצעות השיטה המוצגת כאן, עד 3 × 106 hemocytes בשידור חי ניתן להשיג 200 דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים 30 דקות לשעבר vivo זיהום. לחלופין, hemocytes יכולים להיות נגועים ויוו באמצעות הזרקה של 3rd לחלל הזחלים ואחריו hemocyte החילוץ עד 24 שעות לאחר הפגיעה. אלו תאים נגועים הראשי היה קבוע, צבעונית, עם תמונה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר מכן, ייצוגים תלת-ממד נוצרו מן התמונות להראות באופן מוחלט לפלישה הפתוגן. בנוסף, ה-RNA באיכות גבוהה עבור לרביעיית-PCR ניתן להשיג איתור של פתוגן mRNA הבאים לזיהום, ולא מספיק חלבון יכול להיות מופק תאים אלה לניתוח תספיג חלבון. יחדיו אנו מציגים שיטה התאמת מובהק של פלישת פתוגן ואישור של זיהום באמצעות סוגי הפתוגן בקטריאליים וויראליים שיטה יעילה לחילוץ hemocyte כדי להשיג מספיק hemocytes בשידור חי של דרוזופילה הזחלים לניסויים זיהום ex-vivo ו ויוו .

לחיות לאסוף hemocytes vivo לשעבר זיהום, 3 × 106 hemocytes היו מופק 200 דרוזופילה 3rd לחלל הזחלים. כדי לפתח את השיטה שלנו, נעשה ניסיון מספר טכניקות שונות. דיסקציה זחל בודדים ינצל עד 1.5 שעות, ממוצע של ~ 8000 תאים התקבלו באמצעות זו שיטה18, אשר רובם לא היו בחיים עד ...

Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis at JoVE.com

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחזור תאי תלת-ממד.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

11.6K Views.  Washington State University. שיטה זו מדגימה כיצד להמחיש הפתוגן הפלישה לתוך תאים חרקים עם דגמים תלת ממדיים (3D). Hemocytes של הזחלים דרוזופילה נדבקו בנגיף פתוגנים נגיפי או חיידקי, או vivo לשעבר או ויוו. Hemocytes נגוע היו לאחר מכן קבועה, צבעונית עבור הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, עוקבות שיחז?...

Video: Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

פשוט פרוטוקול Chelex למיצוי DNA מ<em&gt; אנופלס</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...