Name: extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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우리는 표현 하는 mCherry Coxiella burnetii의 주식을 제공 하기 위한 박사 로버트 Heinzen에 감사입니다. 우리는 비행 주식 제공 무척 추 동물 무지개 빛깔 바이러스 6 및 블루밍턴 재고 센터 제공을 위한 닥터 루이스 테 세이 라 감사 합니다. 이 프로젝트는 NIH 부여 R00 AI106963 (A.G.G.)와 워싱턴 주립 대학에 의해 부분적으로 투자 되었다.

1. 감염 비보 전
<ol><li>매체 및 장비<ol>
<li>무 균 조건 하에서 준비 신선한 초파리 Hemocyte 분리 매체 (작성자) 75% 슈나이더의 초파리 를 포함 보통 25%로 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 필터 살 균 그것.</li>
		<li>레이어는 stereomicroscope에서 10 cm x 10 cm 파라핀 영화의 2-3 조각.</li>
		<li>유리 모 세관을 준비 합니다. 최대의 55%를 모 세관 끌어당기는 히터를 설정 합니다. 약 10 µ m의 날카로운 포인트를 모 세관 튜브를 당겨.</li>
		<li>백필 미네랄 오일 모 세관입니다.</li>
		<li>Nanoinjector (그림 1A)에 채워진된 모 세관 튜브를 조립 하 고 집게 (그림 1B) 끝을 끊어서 융합된 세관 팁을 엽니다. 팁의 외부 직경은 hemocytes의 쉬운 이해를 위한 100 µ m 이어야 한다.</li>
		<li>모 세관 튜브 끝에서 가능한 많은 기름 추출 다음 작성자와 작성. 최대 촬영 hemolymph와 오일의 테두리 쉽게 시각화, 포함 석유와 작성자 사이 공기 거품 (그림 1B').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph 추출<ol>
<li>선택 3rd 탈피 초파리 애벌레 안쪽에서 음식의 벽 집게를 사용 하 여 부드럽게 리 바이 알 및 100 µ m 여과기 (그림 1C)에 그들을 배치. 3rd 탈피 애벌레는 성인 여성에 의해 누워 비옥한 계란을 다음 3-6 일 찾을 수 있습니다. 참고: 이러한 실험 사용 유전자 형, w1118; P {w+ mCHml GAL4.Δ =} 2, P {w+ mCUAS-2xEGFP =} AH2, 이후이 동물에서 hemocytes 표현 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 현미경으로 세포의 식별에 도움.</li>
		<li>애벌레에 붓는 살 균 물의 5 mL와 5 미 장소 작업 지우기에 여과기 과잉의 물을 제거 하는 여과기를 흔들어 (그림 1C').</li>
		<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 애벌레를 전송 합니다. 5 CO2 가스와 함께 그들을 anesthetize (그림 1D).</li>
		<li>등-면 (그림 2A) 최대 stereomicroscope, 아래 파라핀 필름에 애벌레를 놓습니다.</li>
		<li>제자리에 후부 표 피 중단을 장소 애벌레 후부 시체에 가볍게 모 세관 유리 정밀한 날카로운된 집게 (그림 2B)를 사용 하 여 엽니다.</li>
		<li>Hemolymph 파라핀 필름 (그림 2C)에 흐르는 것을 허용 한다.</li>
		<li>파라핀 영화에 한 번에 20-50 애벌레에서 hemocytes를 포함 하는 hemolymph의 풀을 확인 합니다.</li>
		<li>소요는 유리를 사용 하 여 풀링된 hemolymph nanoinjector (그림 2D)에 모 세관. 참고: hemolymph의 약 10-20 µ L을 하 고 있어야 합니다.</li>
		<li>작성자 (그림 2E)의 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL microcentrifuge 관으로는 hemolymph를 꺼냅니다.</li>
		<li>반복 단계 1.2.4)-1.2.9) 애벌레의 모든 일괄 처리에 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemocytes의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>죽은 세포 얼룩 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 5 µ L 플라스틱 부드럽게 작성자와는 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 튜브에 hemocytes 0.6 mL microcentrifuge 튜브에 hemocytes를 포함 하 여 작성자의 5 µ L를 전송 하 고 부드럽게 혼합.</li>
		<li>1:1 Trypan 파랑: hemocyte 혼합물에서 셀의 10 µ L는 hemocytometer에 플라스틱.</li>
		<li>라이브 hemocytes는 하지로 얼룩진 Trypan 블루는 hemocytomter의 4 모서리 필드의 각을 계산 하는 수식을 사용 하 여 밀리 리터 당 hemocytes의 농도의 수를 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> 여기서 X는 밀리; 당 라이브 hemocytes의 농도 a, b, c, 그리고 d는 필드의 각 4 (Trypan 블루 제외 결정)로 라이브 셀 수는 hemocytometer에 계산. 셀 계산의 총 수의 2에 의해 Trypan 블루 셀의 1:1 희석 때문입니다. Trypan 푸른 물 셀 죽으로 간주 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
비보 전 감염<ol>
<li>Timepoints 및 생물에 따라 세포와 시드를 우물의 수 복제 각 실험에 필요한 결정 합니다. 5.0 × 104 hemocytes는 RNA와 단백질 정화 감염 다음 필요한.</li>
		<li>작성자는 다음 수식을 사용 하 여 감염에 대 한 희석에 병원 체의 볼륨을 계산: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> 어디 감염 (MOI)의 다양성은 바이러스의 수 또는 박테리아 세포 당 원하는. 참고: 사용 하는 나는 개별 실험 및 분석 실험 수행에 따라 다릅니다. 여기, 10 게놈 등가물 (GE) / C. burnetii, Listeria의 10 CFU/셀 또는 IIV6의 1 TCID50/cell의 셀이 사용 되었다.</li>
		<li>튜브에 바이러스 성 또는 세균성 볼륨에 작성자의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 24-잘 접시의 각 음에 대 한 병원 체 매체의 500 µ L를 준비 합니다.</li>
		<li>장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드.</li>
		<li>24-잘 접시의 우물에는 hemocytes를 포함 하 여 작성자를 분할.</li>
		<li>잘에서 hemocytes에 병원 체 매체의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심</li>
		<li>1 h 28 ° c.에 대 한 접시를 품 어 모든 15 분 부드럽게 앞, 다음 5 오른쪽 왼쪽 뒤에서 접시 기울기 손으로 s.</li>
		<li>침공/첨부 파일 단계 1.4.8의 1 h), 후 부드럽게 병원 체 매체에서 플라스틱 세척 신선한 작성자와 hemocytes 그리고 신선한 작성자의 500 µ L 리필.</li>
		<li>원하는 시간에 대 한 감염된 hemocytes를 품 어. 이러한 실험, C. burnetii에서-또는 IIV6에 감염 된 hemocytes는 24 시간, 및 Listeriaincubated-감염된 hemocytes 1, 2, 또는 4 h 알을 품는.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. vivo에서 감염
<ol><li>감염<ol>
<li>따뜻한 실 온 15 분 접시에서 초파리 과일 주스 천 배지 이전 만들어집니다20을설명 합니다.<ol>
<li>물과 압력솥의 700 mL를 agar의 30 g 추가 40 분 동안 그것.</li>
			<li>메 틸 paraben 절대 에탄올 10 mL에 0.5 g을 녹.</li>
			<li>과일 주스 농축의 300 mL에 메 틸 paraben 솔루션을 추가 합니다.</li>
			<li>신속 하 게 압력가 한 솔루션으로 농축 혼합 하 고 10 × 35 mm 페 트리 접시에 5 mL을 분배.</li>
			<li>후 15 분 동안 냉각 판, 4 ° c.에서 그들을 저장합니다</li>
		</ol>
</li>
		<li>3rd 탈피 애벌레 1.2.1 단계 준비)-1.2.3).</li>
		<li>한 천 배지에서 효 모 반죽을 놓습니다. 애벌레 (그림 3A) 건조를 피하기 위해 마이그레이션할 수 한 천 배지에서 잘 컷을 확인 합니다. 파라핀 영화 (그림 3B, C)를 사용 하 여 집게를 들고와 0.001 m m 지적된 텅스텐 바늘을 조립.</li>
		<li>높은 titer mCherry의 50 µ L 플라스틱 표현-C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL)를 파라핀에 스테레오 현미경 영화 하 고 애벌레 박테리아의 수영장.</li>
		<li>박테리아의 수영장으로 애벌레를 놓습니다. 텅스텐 바늘 (그림 3D) 애벌레를 찌 르 기. 한 천 배지 (그림 3E)에 애벌레를 전송 합니다.</li>
		<li>한 접시에 나머지 병원 체 매체 전송 및 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.</li>
		<li>원하는 시간 후 감염 (그림 3F)까지 습 한 공기에는 접시에 애벌레 계속. 이 실험에서 C. burnetii-24 h에 대 한 접시에는 감염 된 애벌레.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymph 추출 및 hemocytes의 도금<ol>
<li>준비 단계 1.1 다음과 같은 장비와 매체).</li>
		<li>장소는 12 m m 24-잘 접시의 우물에 덮개 유리 (두께 1) 라운드. 우물에 작성자의 500 µ L 플라스틱</li>
		<li>에서 추출 하는 hemolymph 단계 1.2.4 감염 된 애벌레)-1.2.8).</li>
		<li>그럼 다음에 hemolymph를 추출 단계 2.2.2).</li>
		<li>2.2.3 반복) 및 2.2.4) 애벌레의 여러 일괄 처리에 대 한.</li>
		<li>1000 x g 5 분 동안에 격판덮개 원심</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 시각화
<ol><li>담합 및 얼룩<ol>
<li>우물에서 라운드 커버 유리에 hemocytes 수 있도록, 후 부드럽게 각 우물에서 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>부드럽게 정착된 hemocytes의 각 음에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 20 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>4% 제거 PFA 부드럽게 0.1%를 포함 하는 PBS의 200 µ L을 추가 하 고 트라이 톤 X-100 그리고 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 각 잘 하. 실 온에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>PBS를 제거 하 고 부드럽게 200 µ L의 ' 1 × 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 각 영역을 추가 합니다. 실 온에서 어둠 속에서 10 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 각 우물에 PBS를 추가. 실 온에서 5 분 동안 hemocytes를 품 어.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드에서 antifade 설치 매체의 10 µ L를 드롭.</li>
		<li>각 우물에서 PBS를 제거한 후 덮개 유리 잘 지적 집게를 사용 하 여 24-잘 접시에서 제거 합니다. 부드럽게 유리 슬라이드에 아래로 hemocytes antifade 장착 매체에 커버 유리 넣습니다.</li>
		<li>어두운 하룻밤에 그것을 배치 하 여 건조를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocal 영상<ol>
<li>DAPI, EGFP, 및 mCherry의 세 가지 컬러 이미징 공초점 현미경을 구성 합니다. 다음 설정 사용: (예) 405 DAPI 여기 nm, 방출 (em) 415-480 nm; 488 전 EGFP nm, em 493-564 nm; 587 ex mCherry nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>현미경과 63 X를 사용 하 여 샘플에 초점에 샘플 배치 / 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 목표. 이미징에 대 한 보기 필드에에서 원하는 hemocytes를 찾습니다.</li>
		<li>샘플의 적절 한 노출을 달성 레이저 파워 및 검출기 이익 조정 합니다. 여러 z-비행기 노출 수준 전체 샘플 두께 적합 한지를 확인 하십시오.</li>
		<li>전체 hemocyte의 z 축에서 위쪽 및 아래쪽 위치를 찾아. Z 단면에 대 한 시작 및 끝 위치도이 위치를 설정 합니다.</li>
		<li>검색 줌 이미지는 hemocyte에 포함 된 영역을 사용 합니다. 3 X의 확대/축소 요소는 자주 사용 하 고 있다.</li>
		<li>X-y 평면에서 1024 x 1024 픽셀 등 적절 한 해상도 이미지 시리즈와 z 차원에서 0.3 µ m 간격을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D 모델 재구성 참고: 오픈 소스 소프트웨어는 3D 모델 재구성에 대 한 대부분의 아래에 설명 된 함수를 수행 하는 존재 합니다.<ol>
<li>3D 모델 재구성 confocal 현미경과 관련 된 소프트웨어에 z sectioned 이미지 시리즈 파일을 가져옵니다.</li>
		<li>DAPI와 mCherry C. burnetii 는 EGFP hemocyte 표현에 표현 스테인드 핵의 공동 지역화를 표시 하는 셀을 선택 합니다. 자르기만 단일 셀을 포함 하도록 이미지 시리즈.</li>
		<li>3D 뷰어 옵션 소프트웨어의 사전 패키지 된 알고리즘을 사용 하 여 3D 모델을 재구성을 선택 합니다. 3D 표현 혼합, 표면, 및 혼합된 옵션 중 원하는 유형을 선택 합니다. 이 방법에서는, hemocytes, 핵, 및 C. burnetii 표시 됩니다 표면 모델을 사용 하 여.</li>
		<li>마우스 버튼을 누른 화면 커서를 드래그 하 여 보기의 다양 한 위치에서 3D 복원된 셀을 관찰 합니다. 셀 방향 및 이미지를 최적화 하기 위해 모델된 광원의 위치를 조정 합니다. 불투명도, 최소 및 최대 임계값, 스 페 큘 러, 주위, Shineness, 및 감마에 대 한 다른 옵션 이미지를 최적화 하기 위해 존재 합니다.</li>
		<li>횡단면은 hemocyte의 내부 내용을 시각화를 클리핑 및 단면 명령을 사용 하 여 모델을 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 유전자 및 단백질 분석에 대 한 응용 프로그램
<ol><li>후속 qRT-PCR를 위한 세포를 lyse 다음 IIV6 및 Listeria, 감염 또는 서쪽 오 점 분석 앞에서 설명한 다음 제조업체의 지침과21 . 참고: qRT-PCR를 위한 뇌관 및 서쪽 오 점을 위해 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	<li>증폭된 제품의 적절 한 길이 있도록 agarose 젤 전기 이동 법, 앞에서 설명한22로 PCR 제품 분석.</li>
</ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina.">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li><li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li><li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen.">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li><li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus.">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li><li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus:+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus.">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li><li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole.">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li><li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2++and+have+different+activity+in+vitro.">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li><li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila.">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li><li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster.">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).</li><li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods.">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li><li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells.">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li><li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development.">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li><li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting.">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq.">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li><li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution.">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

잘 이해 하려면 어떻게 호스트 세포 감염 될, 이전 안 된 병원 체와 세포 유형 조합4에 실험 하는 경우에 특히 셀, 병원 체의 지역화를 명확 하 게 중요 하다. 동안 감염에 따라 세포질 응답 캐스케이드 공부 생산 병원 체 침입을 나타낼 수 있습니다, 이미징 및 세포 응답 데이터의 조합 병원 체 침입 및 감염을 필수적 이다. 호스트 세포에 병원 체의 2 차원 이미지를 보여 주는 보고?...

초파리 melanogaster 타고 난 면제1의 연구에 대 한 기초가 튼튼한 모델 생물 이다. 타고 난 면역 반응 동안 hemocytes 병원 체 도전 하 응답에서 중요 한 역할을 재생합니다. Hemocytes는 캡슐화 기생충, 곰 팡이, 바이러스, 그리고 세균성 감염2,3중 phagocytic 행동을 통해 병원 체 퇴치에 중요 한 기능을가지고 위한 중요 합니다.
최고의 호스트의 병원 성 미생물 감염에 타고 난 면역 반응 이해, 그것은 병원 체 감염 시 호스트 셀을 침공 하는 방법을 시각화 하는 것이 중요. 이 시각화의 메커니즘의 이해에 기여 한다. 병원 체 세포내 지역화의 세부 사항 및 세포질 응답, 이러한 데이터는 감염 하는 미생물이 작용 하는 세포 세포 호스트 응답에 대 한 단서를 제공할 수 있습니다. 따라서, 영상 현미경 검사 법에 의해 후 3D 모델 재구성 호스트 세포에 병원 균의 정확한 위치를 확인 하려면 유용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Coxiella burnetii (C. burnetii), Q 열, 기본 초파리 hemocytes에 둘 다 인간과 동물 건강에 심각한 위협이 포즈 동물 매개 질병의 원인이 되는 대리인의 침공 시각. 최근에, 그것은 초파리 는 Biosafety 수준 2 9 마일 단계 II (NMII) 복제 4 C. burnetii 의 긴장과이 긴장은 초파리4를 복제할 수는 를 나타내는에 취약 입증 되었다 초파리 C. burnetii 병 인을 공부 하는 모델 생물으로 사용할 수 있습니다.
이전 연구는 호스트의 타고 난 면역 반응 검사를 hemocytes를 사용 했습니다. Hemocytes 형태학 관찰5,,67, 형태학 분석2,8, 먹어서 분석2,3, qRT-PCR2 사용 되었습니다. , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent 분석10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 및 immunohistochemistry9,14. 초파리 S2 세포, 다양 한 생체 외에서 실험에 사용할 수도 있지만 immortalization 및 잠재적인 기존의 바이러스 감염 그들의 행동15,16변경. S2 세포 같은 불멸 하 게 셀 라인, 반대로 1 차 셀의 사용 수 있습니다 타고 난 면역 기능 연구에 대 한 시스템에서 전체 유기 체의 더 대표. 또한, hemocytes에서 vivo에서, 추출, 이전 감염 다른 호스트 단백질 및 조직, 비보 전 감염 전에 hemocytes의 추출에 비해 우위를 셀 수 있습니다. 다른 방법의 수는 hemocytes 살아8,17,,1819계속 시간의 짧은 기간에 hemocytes의 충분 한 수를 이용 되어 있다.
이 연구에서는 hemocytes C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria), 또는 무척추동물 무지개 빛깔의 병원 성 미생물 감염에 대 한 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 하는 방법 소개 6 (IIV6) 바이러스입니다. Vivo에서 및 비보 전 hemocyte 감염에 대 한 방법을 설명합니다. Vivo에서-와 ex vivo-감염된 hemocytes confocal 현미경 검사 법으로 구상 되었고 C. burnetii 의 3D 모델을 구축 하는 데 사용. 또한, 프로토콜을 사용 하는 추출, ex vivo-감염된 hemocytes 유전자와 단백질 식에 사용 된 분석 실험. 특히, IIV6 및 Listeria감염의 정도 검사, 총 RNA 또는 단백질 했다 격리 qRT-PCR 또는 서쪽 오 점 분석에 대 한 셀에서. 함께 찍은, 프로토콜 빠르게 3rd 탈피 애벌레와 기본 hemocytes, vivo에서 또는 전 비보감염 증거에서 hemocytes의 높은 숫자를 수집 하는 메서드를 제공 합니다에 대 한 적합 한 플랫폼 미생물 병원 체 감염 연구 그리고 현미경 검사 법, transcriptomics, proteomics 등 해당 다운스트림 분석.

<table><tbody><tr><td>Schneider&#039;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Medium&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&amp;nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Strainer (100 &amp;micro;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillary puller</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Coxiella burnetii&lt;/em&gt; - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; fruit juice plates</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch&#039;s 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petri dishes, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)</td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Holding forceps</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D imaging reconstruction software</td><td>Leica</td><td>LASX with 3D visualization module</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 &amp;micro;g/ml streptomycin at 30 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA degradation</td></tr><tr><td>cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthesis</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3&#039;</td></tr><tr><td>IIV6_193R_R</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3&#039;</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_fwd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_rev</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5&#039;- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes antibody</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody produced in rabbit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>

extraction of hemocytes from drosophila melanogaster larvae for microbial infection and analysis

초파리 melanogaster 의 병원 성 감염 시 hemocytes 감염을 통해 면역 반응에 중요 한 역할을 재생합니다. 따라서,이 프로토콜의 목표, 즉 hemocytes의 특정 면역에 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 개발 하는 것입니다. 여기, 3 × 10에 제시 된 방법을 사용 하 여6 라이브 hemocytes ex vivo 감염에 대 일 분에서 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 얻을 수 있습니다. 또는, hemocytes는 감염 된 vivo에서 구명 hemocyte 추출에 의해 감염 된 후 24 시간에 3rd 탈피 애벌레의 주사를 통해 하실 수 있습니다. 이러한 감염된 1 차 셀 고정, 스테인드, 고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데. 그럼, 3D 표현 병원 체 침입을 결정적으로 보여 이미지에서 생성 되었습니다. 또한, qRT-PCR에 대 한 높은-품질 RNA 병원 체 mRNA 다음의 탐지를 위해 얻어질 수 있다 감염, 그리고 충분 한 단백질 서쪽 오 점 분석에 대 한 이러한 셀에서 추출할 수 있습니다. 함께 찍은, 우리 병원 체 침입의 확실 한 조정 및 세균성과 바이러스 성 병원 체 종류와 hemocyte 추출 위한 효율적인 방법 초파리 에서 충분 한 라이브 hemocytes를 사용 하 여 감염의 확인 하는 방법 제시 vivo ex vivo에서 감염 실험의 애벌레

수집 3 × 10에 ex vivo 감염에 대 한 hemocytes 살고6 hemocytes 200 초파리 3rd 탈피 애벌레에서 추출 되었다. 우리의 방법 개발, 다양 한 다른 기술 시도 했다. 개별 애벌레 해 부까지 1.5 h 걸릴 것 이라고 하 고 ~ 8000 셀의 평균이 방법18, 대부분의 컬렉션의 끝에 의해 살아 있던을 사용 하 여 얻은 했다. 다음, 우리는 hemocytes를 포함 하는 h...

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Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

11.6K 조회수.  Washington State University. 이 메서드는 3 차원 (3D) 모델 곤충 세포로 병원 체 침입을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 초파리 애벌레에서 hemocytes 바이러스 성 또는 세균성 병원 체, ex vivo 또는 vivo에서감염 되었습니다. 감염 된 hemocytes 다음 고정 되었고 confocal 현미경 및 후속 3D 셀룰러 재건 이미징 스테인드.

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

의 시금 혈액 세포 집단<em&gt; 초파리</em&gt; 유충

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

연구

발생학

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

면역학 및 감염병학

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

생물학

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

야생 유충에서 Hemocytes을 추출하기위한 간단한 프로토콜

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

인 비보 식세포 분석기를 사용하여 성인 Drosophila 멜라노가스터 혈구의 연령별 식세포 능력 평가

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

큐티클 파괴: 초파리 유충에서 혈림프를 수집하는 방법

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Larva

Larval Lymph Gland Dissection: Isolating the Drosophila Hemocyte-Producing Organ

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes the Drosophila lymph gland&#8212;the primary site of hematopoiesis in the fly larva&#8212;and shows an example protocol to dissect and mount the organ for immunohistochemistry and fluorescent imaging.

유충 림프선 박리: 초파리 혈구 생산 기관 분리

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes ...

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

요약

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의 시금 혈액 세포 집단

방법은 림프 글 랜드와 혈구 세포에서를 검사합니다

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에