עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של NIA כדי YW.CF (AG21068, AG31086).

1. פתרון אינסולין הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אינסולין טרי פתרון שור ידי המסת אינסולין PBS כדי להשיג את הריכוז של 0.01 מ&quot;ג / מ&quot;ל. שניהם אינסולין / PBS ושליטה פתרונות PBS חייב להישמר על הקרח לאורך הליך ההזרקה. פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים עם 0.5% (V / V) FD &amp; C Blue לא. 1 מזון צביעה. </li></ol> 2. מחט הכנה הזרקת הקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מחטים זכוכית נימי באמצעות puller.The micropipette הבאים הגדרות חולץ לייצר מחטים באיכות מספיק להזרקה: חום, 345; משוך, 210;, מהירות 100, זמן, 200 (100ms). מחטים משך טרי חייב להיות קהה על ידי לחיצה על קצה דרך רקמות Kimwipe. תהליך זה מסיר להקהות את חוד מוארך עמידות גבוהה ומייצרת טיפ יותר שמן עם נקבוביות בקוטר גדול יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום המחטים הקהה טיפ למעלה בצינור microcentrifuge המכיל את אינסולין / PBS פתרון או PBS לבד. נימי תוצאות הפעולה גב מילוי כל מחט. שים את קצה המחט תחת stereomicroscope, כדי לוודא ששום בועות אוויר פסולת או להופיע בקצה. מחק כל מחטים שלא למלא נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מלא מחטים לתוך מחזיק microinjector ידני מחט עמדת בעל מחט עם micromanipulator כך חוד המחט גלוי דרך stereomicroscope. להפעיל לחץ חיובי על הטור נוזל המחט על ידי סיבוב ידית ידנית מיקרומטר microinjector המצורפת הבוכנה על המזרק microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הלחץ מספיק עקירה נוזל הוחל על ידי נגיעה Kimwipe אל קצה המחט, המאשר זרימת הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המחט הוכן הזרקה, להדביק תרשים כיול לפיר מחט עם סרט ברורה, ולהביא את קצה המחט אל המוקד באמצעות stereomicroscope בהגדלה 20X. </li></ol> 3. טוס הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרה ימים בת זבובים הנקבה משמשים לניסויים ההזרקה. איסוף זבובים בתוך 24 שעות של eclosion. הרדימי זבובים עם CO 2 humidified על כרית גז, למיין את הזכרים וזבובים המקום הנשי בתוך מבחנות המכילות סטנדרטי או דיאטה טיפול. שמור על זבובים הנשי על דיאטות ניסיונית למשך 10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום העשירי לאחר eclosion והפרדה על דיאטות ניסיוני, העברת זבובים צלוחיות מזון המכילים שלהם בקבוקונים המכילים תקע 5 מ&quot;ל של אגר 2% ולהרעיב אותם במשך 12-16 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת זבובים רעב בקבוקונים המכילים מסנני גלוקוז 10% ספוג שעה 1 לפני הזרקת אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדים הזבובים עם 2 CO humidified לאחר האכלה גלוקוז ואז קר לשתק אותם על הקרח. </li></ol> 4. הזרקת נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לתפוס זבוב קר משותק עם זוג מלקחיים בסדר להחזיק אותו קרוב קצה המחט, כך קצה צמוד באזור הקדמי של הצד השמאלי של בית החזה של הזבוב. תביאו גם את קצה המחט החזה של הזבוב אל המוקד תחת stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להזיז את לעוף לכיוון קצה המחט כך חוד המחט נוגעת מרכז בליטה של ​​האזור prescutum השמאלי של בית החזה של הזבוב (איור 1). לאחר לטוס מכוונת כראוי מיושר עם קצה המחט, להמשיך לקדם את זבוב על המחט כך המחט נועצת את מרכז prescutum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ חיובי כנדרש על ידי קידום על הבוכנה מזרק עם ידית micromanipulator של microinjector עד 0.1 μl של נוזל כבר מוזרק לטוס. זרם של נוזל לתוך hemocoel של הזבוב יהיה להקנות צבע כחול בצד שמאל של בית החזה הקדמי. לעיתים יש לחזור ולקדם מספר פעמים כדי לסלק כל חסימה קצה מחט ולאפשר זרימת הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זבובים מוזרק להתאושש צלוחיות אגר 2% עבור נקודות זמן המיועד לפני מיצוי hemolymph. </li></ol> 5. Hemolymph אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להרדים זבובים עם CO 2 humidified במוצב הזרקת נקודות הרצוי בזמן כל עמדה לטוס הגב בצד למטה על קלטת דו צדדית מודבקת על פני השטח של כרית CO 2. סדר זבובים אפילו שורות עם קפסולות ראש מיושר. אפשר להשתמש במקל המוליך עץ גזומים ללחוץ כנפיהם לתוך דבק קלטת להבטיח immobilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זבובים קבועים לקלטת, לתפוס חוטם כל זבוב עם מלקחיים בסדר בעדינות למשוך אותו לכיוון האזור הגחוני ואז האחורי של הזבוב, כך הקדמי של הקפסולה בראש גלוי מבעד למיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם היד השנייה ובזמן חוטם מחזיק בעמדה, לנקב את מרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal באמצעות מחט טונגסטן חדה (איור 2). יש להיזהר לא להכניס את המחט עמוק מדי כמו קל אגרוף קצה המחט דרך הצד השני של הקפסולה ראש ולאחר מכן לאבד גontrol של זרימת hemolymph. לנקב את כל הזבובים בקבוצה זריקה לפני איסוף hemolymph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקפסולה הראש כבר ניקב, השתמש במקל המוליך עץ גזומים בעדינות כדי להפעיל לחץ על הבטן של הזבוב. זה עשוי להיות מועיל לגלגל את לטוס מעל כך שהוא נשען על הצד הגחוני שלה כפי שאתה להפעיל לחץ. הליך זה יהיה לייצר טיפה של hemolymph מאתר הקפסולה ראש לנקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע קצה אחד של צינור microcapillary 1μl כדי אגל hemolymph המתעוררים מאתר הקפסולה ראש לנקב. Hemolymph ייכנסו לפעולה באמצעות צינור נימי. קבע ולהקליט את כמות hemolymph שנאספו על ידי בדיקת נוזל עמוד בתוך הצינור microcapillary נגד תרשים נפח בוגרת. </li></ol> 6. גלוקוז Hemolymph קביעת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצאת דגימות hemolymph לתוך microplate בארות המכיל 100 μl של גלוקוז מגיב אינפיניטי. שמור על צלחת על הקרח בעת טעינת דגימות hemolymph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת עקומת סטנדרט ידי טעינת בנפרד 1 μl כל המניות של פתרונות גלוקוז ב 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM ו 3.125mM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי ספיגת ב 340 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבון עבור נפח hemolymph אסף לקבוע ריכוז הגלוקוז מדגם המבוססת על עקומת רגיל עם ריכוזי הגלוקוז ידוע. </li></ol> 7. נציג תוצאות תגובה טיפוסית סבילות לאינסולין מזוהה האינסולין מוזרק זבובים היכן ירידה במחזור רמות הגלוקוז מזוהה 15 דקות לאחר ההזרקה. לעומת זאת, תגובה כזו לא ראיתי אצל זבובי PBS מוזרק (איור 3). זו התגובה סילוק הגלוקוז ההיקפי ממשיך להזריק אינסולין זבובים עד 30 דקות לאחר ההזרקה. אנו שגרתי לחלץ 0.2-0.5 μl של hemolymph לכל 4-5 זבובים בכל קבוצה ההזרקה. שלוש קבוצות הזרקת כלולים כל ניסוי. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. בצד שמאל של בית החזה תסיסנית מראה הכניסה מחט באתר (השתנה מ Demerec, 1950) 7. הכנס את המחט דרך מרכז prescutum על האזור הקדמי של הגב בצד שמאל של החזה. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. התצוגה פרונטלי של ראש תסיסנית מראה מיקום לנקב להפקת hemolymph (השתנה מ Demerec, 1950) 7. לנקב את הקפסולה עם ראש בדיקה טונגסטן חידד דק במרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal. <img src="/files/ftp_upload/2722/2722fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. אינסולין טיפוסי סובלנות בתגובה זוהה מבוגר לשלוט זבובים. בקרת זבובים w 1118 הוזרקו אינסולין שור (1 ננוגרם ב PBS) או PBS בלבד. זבובים בקבוצות לשכפל הורשו אז להתאושש במשך דקות 0, 15 או 30 רמות הגלוקוז במחזור נמדדו.

<ol>
	<li>Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1118 (2002).</li><li>Kim, S. K., Rulifson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+mechanisms+of+glucose+sensing+and+regulation+by+Drosophila+corpora+cardiaca+cells.">Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells.</a> Nature. 431, 316-316 (2004).</li><li>Broughton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longer+lifespan,+altered+metabolism,+and+stress+resistance+in+Drosophila+from+ablation+of+cells+making+insulin-like+ligands.">Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).</li><li>Haselton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+ablation+of+adult+Drosophila+insulin-producing+neurons+modulates+glucose+homeostasis+and+extends+life+span+without+insulin+resistance.">Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance.</a> Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).</li><li>Haselton, A. T., Fridell, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+the+study+of+glucose+homeostasis.">Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis.</a> Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).</li><li>Belgacem, Y. H., Martin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+insulin+pathways+alters+trehalose+level+and+abolishes+sexual+dimorphism+in+locomotor+activity+in+Drosophila.">Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila.</a> J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).</li><li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Drosophila. , (1950).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה שתוארו בדו&quot;ח זה הוא שימושי באופן פוטנציאלי בכל מחקר החוקר תהליכים פיזיולוגיים וכתוצאה מכך לגילוי שינויים בהרכב hemolymph תסיסנית. על ידי שילוב של הזרקה ואיסוף hemolymph באופן זה, ניתן לקבוע את ההשפעות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מיידית של טיפול ניסיוני מניפולצ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> שור אינסולין </td><td> סיגמא </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> אינפיניטי מגיב גלוקוז </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> TR1541 </td></tr><tr><td> ידני microinjector </td><td> סאטר Instrument </td><td></td></tr><tr><td> P-87 Flamming / בראון micropipette חולץ </td><td> סאטר Instrument </td><td></td></tr><tr><td> חבית בודדת נימי זכוכית בורוסיליקט </td><td> AM מערכות </td><td> 626000 </td></tr><tr><td> FD &amp; C Blue מס &#39;1 </td><td> מקורמיק &amp; Company </td><td></td></tr><tr><td> 1 צינורות microcapillary μl </td><td> דראמונד </td><td></td></tr><tr><td> שלושה צירים ידני micromanipulator ובסיס </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td></td></tr></tbody></table>

insulin injection and hemolymph extraction to measure insulin sensitivity in adult drosophila melanogaster

שימור מנגנוני חישה התזונתיים הקיימים בין יונקים זבוב הפירות שבו פפטידים הדומה אינסולין גלוקגון יונקים, בהתאמה פונקציה לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז 1,2 במהלך שלבי התפתחות הזחל. מחקרים בעיקר שלאחר mitotic זבובים בוגרים חשפו ההפרעות של הומאוסטזיס הגלוקוז כתוצאה אבלציה הגנטי של פפטיד דמוי אינסולין (ILP) לייצר תאים (IPCs) 3. לפיכך, זבובי פירות בוגרים לקיים הבטחה גדולה כמערכת מודל מתאים גנטי הפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג II. על מנת להמשיך ולפתח את המערכת זבוב הפירות, מבחני השוואה פיזיולוגית למדידת סבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין אצל יונקים יש להקים. לשם כך, יש לנו תיאר לאחרונה הליך חדשנית למדידת גלוקוז העמסת תגובה לטוס מבוגרים הראו את החשיבות של IPCs מבוגרים בשמירה על הומאוסטזיס הגלוקוז 4,5. הנה, יש לנו נוהל שונה שתואר קודם להזרקת אינסולין 6 בשילוב עם שיטת השאיבה רומן hemolymph למדוד את הרגישות לאינסולין הפריפריה הזבוב הבוגר. באופן ייחודי, פרוטוקול שלנו מאפשרת מדידות פיזיולוגיות ישירה של היכולת לעוף של מבוגר להיפטר עומס הגלוקוז היקפית על הזרקת אינסולין, מתודולוגיה שעושה את זה אפשרי לאפיין מוטנטים אינסולין איתות התערבויות העשויים להשפיע על הסבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין הזבוב הבוגר.

Watch this Scientific Journal Video about Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster at JoVE.com

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; להפוך את האורגניזם כלי פוטנציאל דוגמנות והפרעות מטבוליות כולל סוכרת מסוג II. לשם כך, חיוני להקים מבחני פיזיולוגיים ביעילות למדוד את פעילות האינסולין מערכתי סילוק הגלוקוז הפריפריה הזבוב הבוגר.

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

insulin-injection-hemolymph-extraction-to-measure-insulin-sensitivity

Research

JoVE Journal

Biology

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

19.6K Views.  State University of New York. איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב הפירות תסיסנית melanogaster להפוך את האורגניזם כלי פוטנציאל דוגמנות והפרעות מטבוליות כולל סוכרת מסוג II. לשם כך, חיוני להקים מבחני פיזיולוגיים ביעילות למדוד את פעילות האינסולין מערכתי סילוק הגלוקוז הפריפריה הזבוב הבוג...

Video: Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genetics

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Immunology and Infection

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Developmental Biology

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב<em&gt; תסיסנית</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Neuroscience

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human disease in this organism. Sensitive methods for measurements of parameters such as metabolic rates are needed to drive the understanding of physiology and disease in small animals such as the fruit fly. The method described here assesses fuel oxidation in small numbers of adult flies fed food containing trace amounts of 14C-labeled substrates such as glucose or fatty acid. After the feeding period and any additional experimental manipulations, flies are transferred to short tubes capped with mesh, which are then placed in glass vials containing KOH-saturated filter paper that traps exhaled, radiolabeled CO2 generated from oxidation of radiolabeled substrates as potassium bicarbonate, KHCO3. This radiolabeled bicarbonate is measured by scintillation counting. This is a quantitative, reproducible, and simple approach for the study of fuel oxidation. The use of radiolabeled glucose, fatty acids, or amino acids allows determination of the contribution of these different fuel sources to energy metabolism under different conditions such as feeding and fasting and in different genetic backgrounds. This complements other approaches used to measure in vivo energy metabolism and should further the understanding of metabolic regulation.

Measurement of Carbon Dioxide Production from Radiolabeled Substrates in Drosophila melanogaster

This paper describes a method for the measurement of fuel oxidation in Drosophila melanogaster in which trace amounts of specific radiolabeled metabolic substrates are fed to flies. The exhaled radiolabeled CO2 that is a produced from fuel oxidation is collected and measured.

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב<em&gt; תסיסנית</em

The power of Drosophila genetics is increasingly being applied to questions of hormone signaling and metabolism and to the development of models of human ...

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Here we present a method to measure organismal fat levels in the third instar (L3) larval stage of Drosophila melanogaster. This method exploits the comparatively low density of fat tissue to differentiate between larvae with altered fat stores. Buoyancy-based analysis is a valuable tool for rapid, reproducible, and economical screening.

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן<em&gt; תסיסנית</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

הפרעה בקוטיקולה: שיטה לאיסוף המולימפה מזחלי דרוזופילה

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

הזרקת אינסולין ו Extraction Hemolymph כדי למדוד את הרגישות לאינסולין אצל מבוגרים תסיסנית melanogaster

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה

שיטת שלמות המוח בדם בדרוזופילה מלאנוסטר

את assay נימי מזין מודד צריכת המזון ב

החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Drosophila melanogaster פרוטוקול הזרקת זחלים

מדידת ייצור פחמן דו-חמצני מן radiolabeled מצעים ב

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן

הפרעה בקוטיקולה: שיטה לאיסוף המולימפה מזחלי דרוזופילה