אנו מודים NIAMS אור הדמיה המקטע למתן מיקרוסקופים וסיוע טכני. נוגדנים MF20 ו- Pax7 התקבלו מהבנק התפתחותית מחקרים ליפידים שפותח תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי העירייה במחלקה למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת איווה, איווה. עבודה זו נתמכה על ידי מגזר מחקר התוכנית של NIAMS של מכוני הבריאות הלאומיים.

ב פרוטוקול זה, שרירי הגפיים האחוריות הקדמי של עכברים בוגרים (2-6 חודשים), השוקתי הקדמי (TA), השריר פושט האצבעות הארוך (EDL), הועסקו בתור דוגמה כדי לבצע את immunofluorescence מכתים-SCs שלהם. כל השלבים טיפול עכברים שריר רקמות והניתוחים אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) של NIAMS/NIH.
1. לנתח את השריר ת א/אדי מן האיבר הינד העכבר
<ol><li>המתת חסד העכבר בחדר מלא המתת חסד2 CO תחת הנחיות ACUC של NIH. לבצע פריקה צוואר הרחם במידת הצורך.</li>
	<li>לשים את הפנים העכבר על משטח חיתוך (פרקדן). תרסיס אתנול 70% על גבי העור בבטן שלו. חתך של 1-2 ס מ פתיחה אופקית על המרכז של העור בטן העכבר, אז כן, עדיף את העכבר על ידי משיכת הפתח לכיוון כפות הרגליים העכבר. חושפים צד אחד של האיבר הינד העכבר.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים חדה שני: להשתמש אחד להחזיק את הגידים לצרף את ת א/אדי לקרסול ולהשתמש השני כדי לשבור להטיה fascia כיסוי ה-TA/EDL. לאחר fascia קולפה, להשתמש קצה חד של המלקחיים כדי לנתק את ת א/אדי של עצם השוקה על-ידי הפעלת את הקצה מתחת לשריר ת א/אדי.</li>
	<li>חתך הגידים הקרסול עם מספריים בעודו מחזיק אותם עם המלקחיים. חתוך את השריר עם מספריים לאורך קו האורך ת א/אדי בין הקרסול לברך כשאתם מרימים את ת א/אדי מהצד הקרסול עם המלקחיים. חותכים את הגידים בצד הברך כדי לנתק את אדי/ת א שלם של עצם השוקה.</li>
</ol>2. הקפאה-הטבעה של שריר ת א/אדי
<ol><li>הכנת אמבט חנקן נוזלי במיכל, למשל., חנקן נוזלי דיואר הבקבוק. שופכים methylbutane לתוך חבית פלסטיק קטנה (בערך 20 מ ל) עד חצי מלא. אז לשים את. הספל באמבטיה בחנקן נוזלי להקפיא אותו. לאחר כמה דקות, לבדוק methylbutane הוא קפוא. הערה: ניתן להחליף החנקן הנוזלי דלי קרח יבש, אך הזמן הקפוא הוא איטי יותר.</li>
	<li>להניח את אדי/ת א גזור על גבי משטח שטוח של פומפה מזרק פלסטיק קטנים. כיסוי מלא ה-TA/EDL עם מספר טיפות של האופטימלית חיתוך טמפרטורה (O.C.T.) מורכב (המדיום ההקפאה).</li>
	<li>לקחת את הספל methylbutane מהאמבטיה חנקן נוזלי, להפשיר את השטח עם חפץ חמים (למשל., נקודת האחיזה של מספריים). במהירות מח ש O.C.T. מכוסה ת א/אדי על הבוכנה לתוך methylbutane נמס אל snap-הקפאת הרקמה.</li>
	<li>לנתק את הרקמה מוטבע של הבוכנה עם מלקחיים, ושם את זה בתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. למקם את הצינור לתוך חנקן נוזלי לאחסן אותו לטיפול דגימות נוספות. הערה: הרקמה מוטבע ניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך (שנתיים) או-20 ° C לטווח קצר (6 חודשים).</li>
</ol>3. cryostat חלוקתה
<ol><li>להוסיף טיפה של מתחם במרכז בעל הדגימה cryostat O.C.T.. המתן עד למתחם O.C.T. כמעט פני השטח למוצק. מקל במהירות את אדי/ת א מוטבע למתחם O.C.T., בניצב עם הקרסול-בצד למטה ובצד הברך-למעלה.</li>
	<li>הר בעל הדגימה על גבי cryostat לחתוך את הרקמה במרווח 10 מיקרומטר, לאסוף את הסעיפים הקפאה על פרוסט מצופה שקופיות עם סעיפים 4-8 על שקופית אחת.</li>
	<li>יבש הסעיפים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 3 h ללון. הערה: למרות ייבוש הסעיפים במקפיא נלון או יותר קבילה, באופן בלתי נמנע יגדיל את autofluorescence. לקבלת תוצאות מיטביות, יבש הסעיפים עבור 0.5 h, ואז להמשיך עם קיבוע והשלבים מכתימים מיד.</li>
	<li>לאסוף את השקופיות בתיבה שקופיות, להשתמש בהם באופן מיידי, או לאחסן את השקופיות ב- 80 ° C או-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.</li>
</ol>4. הכנה של ריאגנטים Immunofluorescence מכתים
<ol><li>
הכן מאגרים:
	<ol>
<li>להכין 2 ל' 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) מהערוץ 10 x.</li>
		<li>להכין 40 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS 1 x מ- 16% מחברים.</li>
		<li>להכין 2 ל' של PBST: 1 x PBS עם 0.1% טריטון-100.</li>
		<li>להכין 50 מ של PBST-b: PBST עם 2% אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>הכינו 10 מ"ל של PBST-ב'-ז': PBST עם סרום עז נורמלי BSA ו- 5% 2%.</li>
		<li>להכין 1 מ"ל של חסימת פתרון. AffiniPure Fab שתדללו פרגמנט עז אנטי עכבר אג (H + L) (1:10) PBST-ב'.</li>
		<li>להכין 200 מ ל 1 x ציטראט המאגר. הערה: הכרכים של הפתרונות שלעיל מספיקים עבור שקופיות לפחות 5. אמצעי אחסון צריך להיות מותאם על פי מספר השקופיות והגודל של המכולות שקופיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין נוגדן כתמים:
	<ol>
<li>ראשי נוגדנים (ריכוז בעבודה): להכין 1.2 מ של נוגדן ראשוני מיקס על ידי דילול Pax7 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG1) (1-5 µg/mL) + Laminin ארנב polyclonal נוגדנים (0.5-2 µg/mL) + MF20 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG2b) (0.5-2.5 µg / מ"ל) ב- PBST-B-G. הערה: MF20 העכבר monoclonal נוגדנים (IgG2b) היא אופציונלית.</li>
		<li>נוגדנים משניים (ריכוז בעבודה): להכין 1.2 מ של נוגדנים משניים מיקס על ידי דילול עז העכבר אנטי IgG1 קרוס-הספוחה משני נוגדן, אלקסה עבור חיל הים 488 (0.5-2 µg/mL) + עז ארנב אנטי איג (H + L) מאוד קרוס-הספוחה משני נוגדנים, אלקסה עבור חיל הים בתוספת 555 (0.5-2 µg/mL) + עז אנטי-העכבר IgG2b קרוס-הספוחה משני נוגדן, אלקסה עבור חיל הים 647 (0.5-2 µg/mL) ב- PBST-B-G. הערה: עבור חיל הים אלקסה 647 היא אופציונלית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. immunofluorescence מכתים צעדים
<ol><li>
נתרענן ונחזור לתקן את הסעיפים הקפאה עם כדורגלן.
	<ol>
<li>הסר את מספר השקופיות הקפאה. באזור ת א/אדי תיבת שקופיות. חממו את השקופיות מגש שקופית החזקת בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>השתמש עט חוסם נוזלי (PAP עט) כדי לצייר אזור הכולל כל הקפאה-הסעיפים בשקופית. מעגל זה ימנע את הפתרונות זורם מחוץ לשקופית.</li>
		<li>קח את המגש ברדס fume מעבדה. להוסיף 300-500 µL של 4% מחברים אותן לשקופית בתוך חגו באזור לתקן את הסעיפים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לשטוף החוצה כדורגלן עם PBS 1 x לפחות 3 x 5 דקות בתוך מיכל שקופיות. התראה: PFA היא toxic של פסולת מסוכנת; זה צריך להיות פעלו בזהירות, הושלך לתוך מיכל פסולת מסוכנת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אחזור אנטיגן
	<ol>
<li>למלא מיכל שקופית אחרת עם 200 מ ל מאגר ציטראט.</li>
		<li>להעביר את השקופיות לתוך המיכל. העברת המכולה עם השקופיות סיר לחץ לבשל את השקופיות במצב לחץ גבוה למשך 10 דקות.</li>
		<li>לקרר את המיכל עם ניקוז מים במשך 10 דקות העברת כל השקופיות כדי מיכל חדש עם PBST (200 מ"ל), לשטוף את השקופיות עם PBST למשך לפחות 3 x 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חסימת
	<ol>
<li>להוסיף kimwipes ספוגי מים במגש מחזיק את השקופיות כדי ליצור סביבה לחה כדי למנוע ייבוש של השקופיות.</li>
		<li>העבר את השקופיות חזרה המגש, וכן להוסיף 200 µL של חסימת פתרון על כל שקופית. מכסים את המגש עם כובע ולתת את חסימת לפתח למשך 30 דקות. הערה: נוגדן Pax7 הוא נוגדן חד שבטי עכבר, אז יש איגוד לא ספציפי של העכבר IgG ברקמות השריר העכבר יוצר רקע. שימוש AffiniPure Fab פרגמנט עז העכבר אנטי אג (H + L) חוסם של עכבר-על הכריכה לא ספציפי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
החל נוגדנים העיקרי.
	<ol>
<li>יש לשטוף את השקופיות עם PBST פעם בגורם המכיל של השקופית. ואז להעביר את השקופיות בחזרה למגש מכתימים.</li>
		<li>החל µL 200 של נוגדן ראשוני תערובת על כל שקופית, מכסים את המגש עם כובע, והנח את התגובה לפתח בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 ° C נלון. הערה: התגובה לילה ב 4 ° C נותן את התוצאה הטובה ביותר, למרות פיתוח התגובה בטמפרטורת החדר נותן תוצאות משביעות רצון. ניתן להוסיף הנוגדן MF20 צולבות הקישור חוטים שרירן בתערובת לבצע תיוג של טריפל (Pax7, Laminin, MF20). כתמים MF20 הבדיל סיבי השריר. שלב זה משמש גם צעד חסימת נוסף עם PBST-B-G כדי להפחית מחייב לא ספציפי פוטנציאלי משני הנוגדנים (עז נוגדנים) בשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
החל נוגדנים משניים.
	<ol>
<li>תשטוף את הנוגדנים ראשי עם PBST בטמפרטורת החדר לפחות 3 x 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של נוגדנים משניים לערבב כל שקופית, ולאפשר את התגובה לפתח בטמפרטורת החדר במשך לפחות שעה. הערה: עבור Pax7 + Laminin, להשתמש עז העכבר אנטי IgG1 אלקסה 488 עז ארנב אנטי אלקסה 555. עבור Laminin + Pax7 + MF20, להוסיף עז אנטי-העכבר IgG2b אלקסה 647 בתערובת.</li>
		<li>תשטוף את הנוגדנים משני עם PBST לפחות 3 x 5 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דאפי (4', 6-diamidino-2-phenylindole) נגד הכתם מכשירי הרכבה
	<ol>
<li>לדלל דאפי (1:20, 000) ב- PBST בגורם המכיל של שקופיות, למשל, 10 µL של דאפי ב 200 מ של PBST.</li>
		<li>מכתים את השקופיות בגורם המכיל של דאפי למשך 3 דקות.</li>
		<li>לשטוף את דאפי עם PBST למשך לפחות 5 x 5 דקות.</li>
		<li>לטעון את השקופיות הרכבה בינונית. מכסים את השקופיות עם coverslips. זהירות: דאפי היא רעילה, מסוכנים; זה צריך להיות שטופלו עם טיפול והוא מסולק בבקבוק פסולת מסוכנת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הערה: פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent דיווח מעל יאפשר SCs ויזואליזציה עם גם שדה רחב פלורסנט או קונאפוקלית מיקרוסקופ. זה יכול להיות מאתגר בתחילה לזהות SCs... להלן כמה צעדים מומלצים שעשויים להיות לעזר.
<ol><li>השתמש דאפי ערוץ הגדלה נמוכה מטרות להמחיש את המקטעים של השקופיות.</li>
	<li>מתג ההגדלה מנמוך לגבוה. להתבונן SCs, לפחות 20 X מטרה נדרש).</li>
	<li>שמתשהל סינון כפול עבור 488 (FITC) / 555 (Rhodamine) כדי לצפות גם Pax7 וגם Laminin אותות בו-זמנית כדי לזהות SCs. תחת הגדרה זו, האות של Pax7 מכתים יש ניגוד יותר רעשי הרקע.</li>
	<li>במהירות לסירוגין את הערוץ של FITC כדי דאפי לזהות כראוי SCs. כל SCs צריך להיות Pax7 דאפי-חיובי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity.">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li><li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+the+engines+of+muscle+repair.">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li><li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration:+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes.">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation.">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li><li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li><li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

הפרוטוקול הנ ל מבוססת על שיטה של Pax7/MF20 מכתים על שרירי השלד דג זברה12. הפתרונות בשימוש וחסימת צעדים הן זהות או דומות. הנוגדנים בשימוש זהים. השלבים מנוכי עונתיות התבססו על התכונות של רקמת שריר עכבר ו- SCs. ראשית, Laminin נוגדן נוסף בתערובת שיעזרו להמחיש, לאשר את המיקום של SCs. זה היה מועיל ...

שרירי השלד הוא מורכב של תאי שריר multinucleated, הנקרא myotubes, המסודרות myofibers, המניבות כוח ותנועות דרך ציר. שרירי השלד ביותר, למעט כמה שרירים ואסטתיים, נגזרות מבנה עובריים זמני בשם somite1. קודמן myogenic תאים delaminate מ somite אפיתל להפוך myoblasts. Myoblasts נוספות להבדיל לתוך השריר כי הפתיל כדי להפוך myotubes כדי ליצור myofibers רב nucleated. התהליך הנ ל נקרא myogenesis והוא מאופיין על ידי מוסדר חנותם בקרת ביטוי גנים. מבשרי myogenic אקספרס Pax3 ו- Pax7, ואילו myoblasts אקספרס אלוהים ו/או Myf5 ונייטרלים אקספרס2,myogenin ו- myosins3. השריר הוא תהליך שבו myofibers להיות גדולים יותר על ידי שילוב myonuclei יותר קיימים סיבים (היפרפלזיה) ועל ידי עלייה סיבי השריר (היפרטרופיה) בגודל4. במהלך השריר, יש מקור בר-קיימא של תאי myogenic יש מאפייני תא גזע בכך שהם יכולים להבדיל ולחדש את עצמי. תאים אלה מכונים תאי לוויין לפי מיקומם הפיזי בין הנדן הבזליים5sarcolemma (קרום התא של myofiber). SCs נמרצות לתרום לצמיחה שרירים על הבמה לנוער (2-3 השבועות הראשונים של עכברים כמחנכת), אבל להיות השבתה הדרגתית ב נח שריר למבוגרים6. למרבה הפלא, הם יכולים להיות מופעל מחדש בתגובה שריר פצעה, להבדיל לתוך תאי שריר חדשים כדי לתקן את השריר הפגוע7.
מאפייני תא גזע לבצע חקר SCs הרלוונטיים עבור שריר בסיסיים בביולוגיה והן טיפולים של מחלות שריר8. כתוצאה מכך, עבר שטח של חקירה אינטנסיבית בעשורים האחרונים. התקדמות עצומה נעשתה בניתוח את הגנטיקה ואת אפיגנטיקה SCs9,10. מעורב בידוד וזיהוי SCs בחיי עיר היו שפותח וטכניקות אופטימיזציה לאורך הדרך11. צביעת immunofluorescent מאפשר זיהוי SCs באמצעות נוגדנים ספציפיים, כולל זה עבור Pax7. עם זאת, המחסור ואת גודל קטן של ה-SCs בשילוב עם auto-פלורסצנטיות חזקה של רקמת שריר השלד למבוגרים לדקלם את הפריט החזותי מאתגר. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מוכתמים immunofluorescent הממוטבות עבור העכבר שריר Pax7, המבוסס על שיטה קיימת עבור דג זברה שריר12. בנוסף, נוגדן Laminin המסומנת fluorophore ברורים הוא מועסק כדי לזהות הנדן הבזליים שתחתיו ה-SCs ממוקמים. פרוטוקול זה מאפשר באופן עקבי את החזיית SCs Pax7-חיובית, מבשרי myogenic תחת כל נבדק בתנאים פיזיולוגיים ושלבים התפתחותיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62550-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco, Themo Fisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>0 1-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Citrate Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1860 cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart electronic pressure cooker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

Immunofluorescence היא שיטה יעילה המסייעת לזהות סוגי תאים שונים במקטעי רקמות. ללימוד האוכלוסייה התא הרצוי, נוגדנים עבור תאים מסוים סמנים מוחלים על רקמות חלקים. בשרירי השלד למבוגרים, תאי לוויין (SCs) הם תאי גזע שתורמים שריר תיקון והתחדשות. לכן, חשוב להמחיש ולאתר האוכלוסייה בלוויין תא בתנאים פיזיולוגיים שונים. נח שרירי השלד, SCs שוכנים בין הנדן הבזליים קרום פלזמה myofiber. סימן נפוץ לזיהוי SCs את myofibers או תרבית תאים הוא החלבון לזווג תיבת Pax7. במאמר זה, פרוטוקול immunofluorescence Pax7 אופטימיזציה במקטעי שרירי השלד מוצג זה ממזער שאינם ספציפיים מכתים ורקע. עוד נוגדן מזהה חלבון (laminin) של הנדן הבזליים נוספה גם כדי לסייע בזיהוי SCs-בדומה פרוטוקולים יכול לשמש גם כדי לבצע כפולים או משולשים תיוג עם Pax7, נוגדנים חלבונים נוספים של עניין.

השלבים לעיל, SCs ניתן לאבחן בהצלחה בסעיפים למבוגרים מנוחתו השריר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). למרות לרקמת שריר למבוגרים יש חזקה אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית בסוג מסוים של סיבים, אלקסה סדרת צבעים בהירים ניתן להתגבר על רעשי הרקע ואת האות בולטת (<strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies at JoVE.com

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

זיהוי מדויק של תאים הלוויין חיוני ללמוד את הפונקציות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לזהות תאים הלוויין במקטעי שרירי השלד למבוגרים מאת מבוססי immunofluorescence מכתים.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

20.8K Views.  National Institutes of Health. זיהוי מדויק של תאים הלוויין חיוני ללמוד את הפונקציות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לזהות תאים הלוויין במקטעי שרירי השלד למבוגרים מאת מבוססי immunofluorescence מכתים.

Video: Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite cells. Satellite cells are characterized by the expression of the transcription factor Pax7 and their location underneath the basal lamina in the resting skeletal muscle. Upon injury, satellite cells get activated, undergo self-renewal or differentiation to either form new myofibers or to fuse with damaged ones. The functionality of satellite cells in vivo can be investigated using a cardiotoxin based injury model of skeletal muscle. To study the function of one gene during the regeneration of skeletal muscle, transgenic mouse models are mostly used. Here, we present an alternative method to transgenic mice, to investigate the gene function in satellite cells during regeneration, e.g., in cases where transgenic mice are not available. We combine the cardiotoxin mediated injury of a specific skeletal muscle with the injection of a self-delivering siRNA into the regenerating muscle which is then taken up by satellite cells among other cells. Thereby, we provide a method to analyze gene function in satellite cells during regeneration under physiological conditions without the need for transgenic mice.

We describe an in vivo method to investigate the functional loss of a specific gene in satellite cells by using a combination of cardiotoxin mediated injury of skeletal muscle and the injection of a self-delivering siRNA.

ניתוח תא לווין פונקציה במהלך התחדשות שריר השלד על ידי פציעה קרדיאטוקסין הזרקה של העצמי הספק siRNA ב Vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

Genetics

בידוד תאי לוויין משרירי גפיים של עכבר וניתוח ציטומטריית זרימה

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

מחבר זרקור: ניתוח Cistrome בתאי גזע שריר עכבר 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Biology

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...