NIAMS ışık Imaging mikroskoplar ve teknik yardım sağlamak için bölüm teşekkür ediyoruz. MF20 ve Pax7 antikor bankadan gelişim çalışmaları Hibridoma NICHD himayesinde geliştirilip Biyolojik Bilimler Bölümü Iowa Üniversitesi Iowa City tarafından elde edilmiştir. Bu eser Intramural araştırma programı, NIAMS tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri ile desteklenmiştir.

Bu protokol için yetişkin fareler (2-6 ay), tibialis anterior (TA) ve ekstansiyon digitorum longus (EDL), ön arka bacak kasları üzerinde onların SCs boyama ayirt gerçekleştirmek için bir örnek olarak istihdam edildi. Tüm belgili tanımlık merdiven fareler ve kas doku gruptakiler hayvan bakım ve kullanım Komitesi (ACUC), NIAMS/NIH tarafından onaylanmış.
1. fare Hind Lime TA/Edi kas incelemek
<ol><li>Fareyi NIH ACUC kurallar altında bir CO2 dolu ötenazi odasında ötenazi. Servikal yerinden çıkması gerekiyorsa gerçekleştirin.</li>
	<li>Fare yukarı bir diseksiyon üzerinde (sırtüstü) koymak. % 70 etanol karın derisi üzerine sprey. Bir 1-2 cm yatay olarak fare göbek Cilt Merkezi üzerinde açma kesebilir ve sonra fareyi fare ayakları doğru açılış çekerek deskin. Fare hind bacak bir tarafı ortaya çıkarmak.</li>
	<li>İki keskin forseps kullanın: ayak bileği için TA/Edi eklemek tendonlar tutmak için kullanın ve break ve TA/Edi kapsayan fasya yamultmak için diğerini kullanın. Fasya soyulmuş sonra forseps keskin ucu ucunu TA/Edi kas altında çalıştırarak TA/Edi tibia kemikten ayırmak için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Ayak bileği tendon hala onları Forseps ile tutarak makasla kesme. Forseps ile TA/Edi ayak bileği taraftan kaldırma sırasında diz için TA/Edi ayak bileği dan uzunlamasına çizgi boyunca makasla kas kırpın. Bütün TA/Edi tibia dan ayırmak için diz tarafı tendonlar kesilmiş.</li>
</ol>2. Cryo-gömme TA/Edi kas
<ol><li>Bir kap içinde örneğinbir sıvı azot Banyosu hazırlamak., sıvı nitrojen Dewar flask. Methylbutane yarısı dolu için küçük plastik kabı (yaklaşık 20 mL) içine dökün. Sonra kabı dondur için sıvı azot banyoda koymak. Birkaç dakika sonra methylbutane donuk olduğunu denetleyin. Not: Sıvı azot kuru buz bir kova tarafından değiştirilebilir, ancak daha yavaş dondurma zamanı.</li>
	<li>Küçük plastik enjektör pompası düz yüzeyine disseke TA/Edi yatıyordu. Tam olarak TA/Edi ile birkaç damla, en uygun kesme sıcaklık (O.C.T.) bileşik (dondurucu orta) kapsar.</li>
	<li>Sıvı azot banyosu dışında methylbutane kabı alın ve sıcak bir nesne ile yüzey çözülme (örn., makas tanıtıcısı). Hızlı bir şekilde DIP O.C.T. TA/Edi pistonu üzerinde ek-doku dondurmak için erimiş methylbutane kapalı.</li>
	<li>Forseps ile pistonu katıştırılmış dokusundan ayırmak ve 1.5 mL microcentrifuge tüp içine koy. Daha fazla örnekleri işlerken depolamak için sıvı azot tüpü yerleştirin. Not: Katıştırılmış doku-80 ° C-20 ° C veya uzun vadeli (2 yıl) için kısa vadeli (6 ay) saklanır.</li>
</ol>3. cryostat kesit
<ol><li>O.C.T. bir cryostat numune sahibinin Merkezi bileşik bir damla ekleyin. O.C.T. bileşik neredeyse katılaşmış kadar bekleyin. Hızlı bir şekilde katıştırılmış TA/Edi O.C.T. karışımla, ayak bileği tarafı dik için sopa aşağı ve diz tarafı yukarı.</li>
	<li>Numune tutucu bir cryostat üzerine monte, doku 10 µm Aralık kesme ve cryo-bölümleri ile kaplı frost slaytlarda ilgili toplamak bir slayt bölümlerde 4-8.</li>
	<li>Bölümler için en az 3 saat gece oda sıcaklığında kuru. Not: dondurucu gece veya daha uzun bölümlerde kurutma kabul edilebilir olsa da, bu kaçınılmaz autofluorescence artıracaktır. En iyi sonuçlar için Kuru bölümleri için 0,5 h, sonra devam edin fiksasyon ve boyama adımları ile hemen.</li>
	<li>Slaytları bir slayt kutusunda toplamak ve bunları hemen kullanmak veya slaytları-80 ° C veya daha sonra kullanmak için-20 ° C, depolama.</li>
</ol>4. ayirt boyama için hazırlanması reaktifler
<ol><li>
Arabellekleri hazırlayın:
	<ol>
<li>2 L 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 10 x PBS hazırlayın.</li>
		<li>1 x PBS % 16 dan % 4 paraformaldehyde (PFA) 40 mL hazırlayın PFA.</li>
		<li>PBST 2 L hazırlamak: 1 x PBS ile % 0,1 Triton-100.</li>
		<li>PBST-B: PBST 50 mL % 2 sığır serum albumin (BSA) ile hazırlayın.</li>
		<li>10 mL PBST-B-G: PBST % 2 BSA ve % 5 Normal keçi Serum ile hazırlayın.</li>
		<li>1 mL engelleme çözeltisi hazırlamak. Seyreltik AffiniPure Fab parçası keçi Anti-fare IgG (H + L) (1:10) PBST-d.</li>
		<li>200 mL 1 x sitrat arabelleği hazırlayın. Not: Yukarıdaki çözümleri hacimleri en az 5 slayt için yeterlidir. Birimleri istediğiniz slayt sayısını ve slayt konteyner boyutunu göre ayarlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antikor lekeleri hazırlayın:
	<ol>
<li>Birincil antikorlar (çalışma konsantrasyonu): birincil antikor Mix 1.2 mL Pax7 fare Monoklonal antikor (Igg1) sulandrarak hazırlamak (1-5 µg/mL) + Laminin tavşan poliklonal antikor (0,5-2 µg/mL) + MF20 fare Monoklonal antikor (Igg2b) (0,5-2,5 µg / mL) içinde PBST-B-G. Not: MF20 fare Monoklonal antikor (Igg2b) isteğe bağlıdır.</li>
		<li>İkincil antikorlar (çalışma konsantrasyonu): ikincil antikor Mix 1.2 mL keçi Anti-fare Igg1 çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor 488 sulandrarak hazırlamak (0,5-2 µg/mL) + keçi Anti-tavşan IgG (H + L) son derece çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor artı 555 (0,5-2 µg/mL) + keçi Anti-fare Igg2b çapraz adsorbe ikincil antikor, Alexa Fluor 647 (0,5-2 µg/mL) içinde PBST-B-G. Not: Alexa Fluor 647 seçime bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ayirt boyama adımları
<ol><li>
Suyla temasa ve cryo-bölümler PFA ile düzeltin.
	<ol>
<li>Birkaç TA/Edi cryo-bölümü slaytları slayt kutusundan kaldırın. Slaytları bir slayt tutma tepsi oda sıcaklığında ısıtın.</li>
		<li>Bir sıvı engelleyici kalem (PAP kalem) tüm cryo-bölümleri slayt içeren bir çizmek için kullanın. Bu daire çözümleri slaytın dışına akan önlemek.</li>
		<li>Tepsiyi laboratuvar duman kukuIeta götür. 300-500 µL % 4'lük eklemek PFA daire içinde alanı içinde slayda 10 dk. dışarı PFA 1 x PBS ile yıkama için oda sıcaklığında bölümleri düzeltmek için en az 3 x 5 dk bir slayt kap içinde. Dikkat: PFA zehirli ve tehlikeli atık olduğunu; özenle işletilen ve tehlikeli atık konteyner içine atılması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antijen alma
	<ol>
<li>Başka bir slayt konteyner sitrat arabellek 200 mL ile doldurulması.</li>
		<li>Slaytları konteyner içine aktarın. Slaytları yüksek basınç modunda 10 dk pişirmek bir düdüklü tencere kapsayıcı slaytlar ile aktarın.</li>
		<li>PBST (200 mL) ile yeni bir kapsayıcı tüm slaytlara 10 dk. Transfer için su boşaltma ile konteyner sakin, PBST ile slaytlar için en az 3 x 5 dakika yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Engelleme
	<ol>
<li>Kimwipes suya batırılmış slaytları slayt kurutma önlemek için nemli bir ortam oluşturmak için tutan tepsisi.</li>
		<li>Slaytlar geri tepsiye hareket ve çözüm her slayda engelleme 200 µL ekleyin. Tepsiyi bir kap ile kapak ve geliştirmek için 30 dk engelleme izin. Not: yüksek arka plan oluşturan fare IgG fare Kas dokularında belirsiz bağlama yani fare Monoklonal antikor Pax7 antikor var. AffiniPure Fab parçası keçi Anti-fare IgG (H + L) kullanarak fare fare belirsiz bağlama engeller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Birincil antikorlar uygulanır.
	<ol>
<li>Slaytlar slayt kapsayıcısında bir kez PBST ile yıkayın. Ardından slaytları yeniden boyama tepsi taşıyın.</li>
		<li>Birincil antikor Mix 200 µL her slayta uygulamak, tepsiyi bir kap ile kapak ve 1 h için oda sıcaklığında veya gece kalmak için 4 ° C'de geliştirmek tepki izin. Not: oda sıcaklığında reaksiyon gelişen tatmin edici sonuçlar verir, ancak en iyi sonucu 4 ° C'de gecede tepki verir. Myosin MF20 antikor karışımı bir üçlü (Pax7, Laminin, MF20) etiketleme gerçekleştirmek için eklenebilir. MF20 lekeleri kas lifleri farklı. Bu adımı da ikincil antikorlar (keçi antikorlar) aşağıdaki adımda potansiyel belirsiz bağlama azaltmak için PBST-B-G ile başka bir engelleme adım olarak hizmet vermektedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İkincil antikorlar uygulanır.
	<ol>
<li>Oda sıcaklığında PBST ile antikor birincil dışarı yıkama en az 3 x 5 dak.</li>
		<li>İkincil antikor Mix 200 µL her slayta eklemek ve oda sıcaklığında en az 1 h için geliştirmek tepki sağlar. Not: Pax7 + Laminin, keçi Anti-fare Igg1 Alexa 488 ve keçi Anti-tavşan Alexa 555 kullanın. Pax7 + Laminin + MF20 için keçi Anti-fare Igg2b Alexa 647 karışımı ekleyin.</li>
		<li>PBST ile ikincil antikorlar dışarı yıkama en az 3 x 5 dak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) Counter leke ve montaj
	<ol>
<li>DAPI (1:20, 000) PBST slayt kapsayıcısında, örneğin, DAPI 10 µL PBST 200 ml seyreltik.</li>
		<li>3 dk. DAPI kapsayıcısı içindeki slaytları leke.</li>
		<li>PBST ile DAPI dışarı en az 5 x 5 dakika yıkayın.</li>
		<li>Montaj orta slaytlarla bağlayın. Coverslips ile slaytlar kapağı. Dikkat: Zehirli ve tehlikeli DAPI; dikkatli ve tehlikeli atık şişe bertaraf gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. floresan mikroskobu
Not: yukarıda bildirilen immünfloresan boyama protokolü ile bir geniş alanlı floresan veya confocal mikroskop SCs görselleştirme izin verir. SCs tanımlamak için başlangıçta zor olabilir. Burada yardımcı olabilir birkaç önerilen adımlar vardır.
<ol><li>DAPI kanal ve düşük büyütme hedefleri slaytlardaki bölümler görselleştirmek için kullanın.</li>
	<li>Düşük-yüksek boyuta geçiş. SCs gözlemlemek için en az bir 20 X amaç gereklidir).</li>
	<li>İkili filtre küp 488 (FITC) için kullanmak / 555 (rodamine) Pax7 ve Laminin gözlemlemek için SCs tanımlamak için aynı anda sinyalleri. Bu ayarı altında arka plan gürültü daha iyi bir kontrast Pax7 boyama sinyal var.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde FITC kanala doğru SCs tanımlamak için DAPI alternatif. Tüm SCs Pax7/DAPI-pozitif olmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity.">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li><li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+the+engines+of+muscle+repair.">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li><li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration:+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes.">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation.">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li><li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li><li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yukarıdaki Protokolü Pax7/MF20 Zebra balığı iskelet kas12tarihinde boyama yöntemi dayanıyordu. Kullanılan ve adımları engelleme çözümleri aynı veya benzer. Kullanılan antikor aynıdır. Ayarlanan adımları fare kas dokusu ve SCs özelliklerini temel. İlk olarak, Laminin antikor görselleştirmek ve SCs konumunu doğrulamak için mix eklendi. SCs mikroskop altında 488/555 çift filtre küp kullanırken saymak için özellikle yararlı; Bu büyük ölçüde gürültülü autofluore...

Kas iskelet multinucleated kas hücreleri oluşur, myotubes denilen, kuvvet ve daralma ile hareketleri oluşturmak myofibers düzenlenmektedir. En iskelet kasları kraniyofasiyal bazı kasları dışında bir somite1adında bir geçici embriyonik yapısından türetilir. Myogenic öncül hücreleri epitel somite myoblasts olmak için delaminate. Myoblasts daha da çok çekirdekli myofibers oluşturmak için myotubes olmak için sigorta miyositler ayırt etmek. Yukarıdaki işlem myogenesis denir ve gen ekspresyonu tarafından geçici düzenlenir kontrolünü ile karakterizedir. Myogenic Kara filmin tarih öncesi Pax3 ve Pax7, oysa myoblasts Tanrım hızlı ve/veya2,3myogenin ve myosins Myf5 ve miyositler hızlı hızlı. Kas büyüme hangi myofibers daha fazla myonuclei varolan lifleri (Hiperplazi) birleşmeyle ve kas lif boyutu (hipertrofisi)4bir artış daha büyük olmak bir süreçtir. Kas büyüme sırasında onlar ayırt etmek ve kendi kendini yenilemek kök hücre özelliklerine sahip myogenic hücre sürdürülebilir bir kaynağıdır. Bu hücreler uydu fiziksel konumlarını sarcolemma (myofiber, hücre zarı) ve Bazal lamina5arasındaki temel hücre denir. SCs şiddetle Juvenil aşamasında (doğum sonrası fareler ilk 2-3 hafta) kas büyümesine katkıda bulunmak, ama yetişkin kas6dinlenme sakin ol. Dikkat çekici, onlar-ebilmek var olmak yanıt kas olarak yeniden Aktif kişi yaralandı ve hasarlı kas7onarmak için yeni kas hücreleri ayırt etmek.
Kök hücre özellikleri SCs çalışmanın ilgili temel kas Biyoloji ve terapileri kas hastalıkları8için yapmak. Sonuç olarak, son yıllarda yoğun araştırma çalışmaları bir alan olmuştur. Bir muazzam genetik ve epigenetik SCs9,10dissekan ilerlemeler kaydedilmiştir. SCs in situ tespit ve yalıtma de tekniklerin geliştirilmiş olup yol11en iyi duruma getirilmiş. İmmünfloresan boyama SCs tanımlaması için Pax7 da dahil olmak üzere belirli antikor kullanımı sağlar. Ancak, kıtlık ve bir güçlü auto-floresan ile yetişkin iskelet kas dokusunun kombine SCs küçük boyutlu görselleştirme zorlu render. Burada, biz fare kas dokusu için Pax7 için optimize edilmiş ve Zebra balığı kas12için varolan bir yöntemine dayalı bir immünfloresan boyama iletişim kuralı tanımlamak. Buna ek olarak, farklı bir fluorophore ile etiketli bir Laminin antikor Bazal lamina altında SCs yer almaktadır belirlemek için istihdam edilmektedir. Bu iletişim kuralı sürekli Pax7 pozitif SCs ve tüm test fizyolojik şartlarda ve gelişim aşamalarında altında myogenic öncüleri görselleştirme sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62550-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco, Themo Fisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>0 1-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Citrate Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1860 cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart electronic pressure cooker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

Ayirt doku bölümlerinde farklı hücre tipleri tanımlamak için yardımcı olan etkili bir yöntemdir. İstenen hücre nüfus çalışma için antikorlar belirli hücre işaretçileri için doku bölümlerde uygulanır. Yetişkin iskelet kas, uydu (SCs) kas onarım ve rejenerasyon katkıda kök hücre hücrelerdir. Bu nedenle, görselleştirmek ve uydu hücre nüfus farklı fizyolojik koşullar altında izlemek önemlidir. İskelet kas istirahat, SCs Bazal lamina ve myofiber plazma zarı arasında yer alır. Myofibers veya hücre kültürü SCs tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici Pax7 Eşli kutu proteindir. Bu makalede, en iyi duruma getirilmiş bir Pax7 ayirt protokol kas iskelet bölümleri üzerinde non-spesifik boyama ve arka plan en aza indiren sunulur. Bir protein (laminin) Bazal lamina tanır başka bir antikor SCs. benzer protokoller tanımlamanıza yardımcı olması için de Pax7 ve ilgi ek proteinler için antikorlar ile ikili veya üçlü etiketleme gerçekleştirmek için kullanılabilir da eklendi.

Belgili tanımlık yukarıda merdiven SCs floresan mikroskop (şekil 1) altında yetişkin dinlenme kas bölümlerde başarıyla görüntülenmeyecektir. Yetişkin kas dokusu lifleri belirli tür güçlü auto-floresan olsa da, parlak Alexa serisi boyalar arka plan gürültü üstesinden gelebilir ve sinyal öne çıkmaktadır (şekil 1A, B; ok uçları). İki fotonlu confocal mikroskobu nispeten temiz görüntü...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies at JoVE.com

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.

Kas iskelet uydu hücreleri tarafından Pax7 ve Laminin antikorlar ile ayirt tanımlaması

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

identification-skeletal-muscle-satellite-cells-immunofluorescence

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

20.8K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Uydu hücreleri hassas tanımlaması işlevlerini çeşitli fizyolojik ve patolojik koşullarda çalışmak için esastır. Bu makale ayirt tabanlı boyama tarafından uydu hücreleri yetişkin iskelet kas bölümlerinde tanımlamak için bir protokol sunar.

Video: Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

Sıçan Başkanı Branchiomeric Kaslar gelen İzolasyon ve Uydu Hücrelerinin Karakterizasyonu

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin Enjeksiyonu ile Akut İskelet Kası Regeneration indüksiyon

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Yetişkin ve Yaşlı İnsanların İskelet Kası miyojenik Öncü Hücreler / İlköğretim miyoblastların hazırlanması ve Kültür

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Contractile fare faaliyet kaynaklı kas iskelet fenotipik uyarlamalar çalışmaya kronik stimulasyon uygulanması

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...