우리 감사 NIAMS 빛 이미징 섹션 현미경 및 기술 지원을 제공 합니다. MF20 및 Pax7 항 체 개발 연구 Hybridoma 은행은 NICHD의 후원 하에 개발 하 고 유지 관리 학과 생물 과학, 아이오의 대학, 아이오와 시티에서 얻은 했다. 이 작품은 국립 보건원의 NIAMS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.

이 프로토콜에서 성인 쥐 (2-6 개월), tibialis 앞쪽 (TA) 및 신 근 digitorum longus (EDL)의 앞쪽 뒷 다리 근육 그들의 SCs에 얼룩 면역 형광 검사를 수행 하려면 예제로 채택 되었다. 모든 단계 마우스 및 근육 조직 해 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIAMS/NIH에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 뒷 다리에서 따/EDL 근육 해 부
<ol><li>NIH의 ACUC의 지침에 따라 CO2 채워진된 안락사 챔버에 마우스 안락사 필요한 경우 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.</li>
	<li>위에 마우스 얼굴 업 해 부 패드 (부정사). 복 부 피부에 70% 에탄올 스프레이. 마우스 배 스킨의 중앙에 가로로 여 1-2 cm를 잘라 다음 마우스 피트를 향해 개방을 당겨서 마우스를 deskin. 마우스 뒷 다리 사지의 한쪽을 노출 합니다.</li>
	<li>두 개의 날카로운 집게를 사용 하 여: 발목, TA/EDL을 연결 하는 힘 줄을 하나를 사용 하 고 다른 하나를 사용 하 여 휴식을 전단 TA/EDL을 취재 하는 근 막. 일단 근 막 벗는 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 TA/EDL 근육 아래 팁을 실행 하 여 TA/EDL 경골 뼈에서 분리.</li>
	<li>여전히는 집게로 잡고가 위로 발목 힘 줄을 잘라. 집게와 발목 쪽에서 TA/EDL을 해제 하는 동안 근육은 TA/EDL 발목에서 무릎에의 경도 선 따라가 위로 잘라. 전체 TA/EDL 경골에서 분리를 무릎 쪽 힘 줄을 잘라.</li>
</ol>2. Cryo-포함 TA/EDL 근육의
<ol><li>컨테이너, 예를 들어액체 질소 목욕 준비., 액체 질소 Dewar 플라스 크. 작은 플라스틱 비 커에 (약 20 mL) 반 전체에 methylbutane를 붓는 다. 그럼 그것을 동결에 액체 질소 목욕에서 비 커를 넣어. 몇 분 후에 methylbutane 동결 되었음을 확인 합니다. 참고: 액체 질소는 드라이 아이스의 양동이 의해 대체 될 수 있지만 동결 시간 느립니다.</li>
	<li>해 부 TA/EDL 작은 플라스틱 주사기 플런저의 평평한 표면에 놓으십시오. 완전히 조교/EDL 몇 방울의 최적의 절삭 온도 (O.C.T.) 화합물 (냉동 매체)로 커버.</li>
	<li>액체 질소 목욕 중 methylbutane 비 커 고 따뜻한 개체와 표면 해빙 (예.가 위 손잡이). 신속 하 게 딥은 O.C.T. 스냅-동결 조직에 녹 인된 methylbutane로 플런저에 TA/EDL을 커버.</li>
	<li>집게와 플런저에서 포함 된 조직을 분리 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 넣어. 더 많은 샘플을 처리 하는 동안 그것을 저장 하는 장소 액체 질소에 튜브. 참고: 포함 된 조직 저장할 수 있습니다 장기 (2 년) 또는-20 ° C-80 ° C에서 짧은 기간 (6 개월)에 대 한.</li>
</ol>3. cryostat 단면
<ol><li>O.C.T.는 cryostat의 견본 홀더의 중심에 복합의 한 방울을 추가 합니다. O.C.T. 화합물은 거의 확정 될 때까지 기다립니다. 신속 하 게 발목 쪽으로 수직 O.C.T. 화합물에 포함 된 TA/EDL 스틱 다운 및 무릎 쪽까지.</li>
	<li>탑재 한 cryostat에 견본 홀더, 조직 10 µ m 간격 자르고에 대 한 프 로스트 코팅 슬라이드와 cryo-섹션을 수집 한 슬라이드에 4-8 절.</li>
	<li>적어도 3 h 하룻밤 실 온에서 섹션을 건조. 참고: 비록 하룻밤 이상 냉장고에 섹션을 건조 하는 것은 허용, 그것은 필연적으로 증가 합니다 하지는 autofluorescence. 최상의 결과 얻으려면 건조 0.5 h에 대 한 섹션 진행 됩니다 고정과 얼룩 단계 즉시.</li>
	<li>슬라이드 상자에서 슬라이드를 수집, 즉시 그들을 사용 하 여 또는-80 ° C 또는-20 ° C 나중에 사용할 슬라이드를 저장.</li>
</ol>4입니다. 면역 형광 염색 법에 대 한 시 약의 준비
<ol><li>
버퍼를 준비:
	<ol>
<li>10 x PBS에서 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1의 2 리터를 준비 합니다.</li>
		<li>1 x PBS 16%에서 4 %paraformaldehyde (PFA)의 40 mL 준비 PFA.</li>
		<li>PBST의 2 리터를 준비: 0.1% 트리톤-100 1 x PBS.</li>
		<li>2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 PBST-b: PBST의 50 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>2%와 5 %BSA 정상 염소 혈 청으로 PBST-B-g: PBST의 10 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>1 mL 차단 솔루션의 준비. 희석 AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L) (1:10) PBST-b</li>
		<li>1 x 시트르산 버퍼의 200ml를 준비 합니다. 참고: 위의 솔루션의 볼륨은 적어도 5 슬라이드에 대 한 충분 한. 볼륨은 슬라이드의 수와 슬라이드 컨테이너의 크기에 따라 조정 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 체 얼룩을 준비:
	<ol>
<li>1 차 항 체 (작업 농도): Pax7 마우스 단일 클론 항 체 (IgG1) 희석 하 여 1 차적인 항 체 혼합의 1.2 mL를 준비 (1-5 µ g/mL) + Laminin polyclonal 토끼 항 체 (0.5-2 µ g/mL) + MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) (0.5-2.5 µ g / mL) PBST-B-g 참고: MF20 마우스 단일 클론 항 체 (IgG2b) 선택 사항입니다.</li>
		<li>2 차 항 체 (작업 농도): 염소 반대로 마우스 IgG1 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 488 diluting 하 여 1.2 mL 이차 항 체 혼합의 준비 (0.5-2 µ g/mL) + 염소-토끼 IgG (H + L) 높은 간-흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 플러스 555 (0.5-2 µ g/mL) + 염소 반대로 마우스 IgG2b 크로스 흡착 이차 항 체, 알 렉 사 Fluor 647 (0.5-2 µ g/mL) PBST-B-g 참고: 알 렉 사 Fluor 647 선택 사항입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 면역 형광 염색 법 단계
<ol><li>
Rehydrate 하 고 PFA와 cryo-섹션을 수정.
	<ol>
<li>슬라이드 상자에서 TA/EDL cryo-섹션 슬라이드의 몇 가지를 제거 합니다. 따뜻한 실 온에서 슬라이드 잡고 트레이에 슬라이드.</li>
		<li>액체 차단 펜 (PAP 펜)를 사용 하 여 모든 곳을 알아내는-섹션 슬라이드에 포함 된 영역을 그립니다. 이 원형 슬라이드 밖 흐르는 솔루션을 막을 것 이다.</li>
		<li>실험실 연기 후드에는 트레이 가져가 라. 300-500 µ L 4%의 추가 10 분 1 x PBS와 PFA에 밖으로 세척에 대 한 실 온에서 섹션을 해결 하기 위해 원된 영역 내에서 슬라이드에 PFA 슬라이드 컨테이너에서 적어도 3 x 5 분. 주의: PFA는 독성과 유해 폐기물; 그것은 관리와 함께 작동 한다 고 유해 폐기물 용기에 폐기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
항 원 복구
	<ol>
<li>구 연산 염 버퍼의 200 mL와 함께 다른 슬라이드 컨테이너를 작성.</li>
		<li>컨테이너에 슬라이드를 전송 합니다. 압력 밥 솥 요리 10 분에 대 한 높은 압력 모드에서 슬라이드를 슬라이드와 함께 컨테이너를 전송 합니다.</li>
		<li>배수 물 10 분 전송에 대 한 모든 슬라이드 PBST (200 mL)와 새로운 컨테이너와 컨테이너를 쿨, 3 x 5 분 이상에 대 한 PBST와 슬라이드를 씻어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차단
	<ol>
<li>슬라이드의 건조를 피하기 위해 습 한 환경을 만들기 위해 슬라이드를 잡고 트레이를 물에 젖은 kimwipes를 추가 합니다.</li>
		<li>트레이, 다시 슬라이드를 이동 하 고 각 슬라이드에 솔루션 차단의 200 µ L를 추가 합니다. 모자와 함께 트레이 커버 하 고 30 분 동안 개발 차단 하자. 참고: Pax7 항 체는 마우스 단일 클론 항 체 때문에 마우스 IgG 마우스 근육 조직에 높은 백그라운드를 만드는의 불특정 바인딩. AffiniPure 팹 조각 염소 반대로 마우스 IgG (H + L)를 사용 하 여 마우스에 마우스 난다 바인딩을 차단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차 항 체를 적용 합니다.
	<ol>
<li>슬라이드 슬라이드 컨테이너에서 한 번 PBST와 린스. 그런 다음 다시 얼룩 트레이 슬라이드를 이동 합니다.</li>
		<li>각 슬라이드에 1 차적인 항 체 혼합의 200 µ L을 적용 하 고 모자, 트레이 커버 개발 1 시간 실내 온도에 또는 하룻밤에 4 ° C에서 반응 하 게. 참고: 4 ° C에서 하룻밤 반응 비록 만족 스러운 결과 제공 실 온에서 반응 개발 최상의 결과 제공 합니다. Myosin MF20 항 체 트리플 (Pax7, Laminin MF20) 라벨 수행 믹스에 추가할 수 있습니다. MF20 얼룩 분화 근육 섬유. 이 단계는 또한 PBST-B-g을 줄이기 위해 다음 단계에서 2 차 항 체 (염소 항 체)에서 잠재적인 난다 바인딩 다른 차단 단계 역할을 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 차 항 체를 적용 합니다.
	<ol>
<li>실 온에서 PBST와 함께 1 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.</li>
		<li>각 슬라이드에 이차 항 체 혼합의 200 µ L을 추가 하 고 허용 하는 적어도 1 시간에 대 한 실 온에서 개발 하는 반응. 참고: Pax7 + Laminin에 대 한 사용 하 여 염소 반대로 마우스 IgG1 알 렉 사 488와 염소 안티 토끼 알 렉 사 555. Pax7 + Laminin + MF20, 염소 반대로 마우스 IgG2b 알 렉 사 647 믹스에 추가.</li>
		<li>PBST와 2 차 항 체에 밖으로 세척 적어도 3 x 5 분.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 카운터 얼룩 및 장착
	<ol>
<li>PBST 슬라이드 컨테이너, 예를 들어, PBST의 200 mL에 DAPI의 10 µ L에에서 DAPI (1:20, 000)를 희석.</li>
		<li>슬라이드 3 분 DAPI 컨테이너에 얼룩.</li>
		<li>PBST와 DAPI 적어도 5 x 5 분 동안 세척 한다.</li>
		<li>설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 합니다. Coverslips와 함께 슬라이드 커버. 주의: DAPI는 유독 하 고 위험한; 그것은 신중 하 게 처리 해야 한다 고 유해 폐기물 병에서 삭제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 형광 현미경 검사 법
참고: immunofluorescent 얼룩 프로토콜 위에 보고는 넓은 필드 형광 또는 confocal 현미경으로 SCs 시각화를 수 있습니다. 그것은 처음 SCs를 식별 하는 도전 수 있습니다. 도움이 될 수 있는 몇 가지 권장 되는 단계는 여기 있다.
<ol><li>DAPI 채널 및 낮은 배율 목표를 사용 하 여 슬라이드에 대 한 섹션을 시각화.</li>
	<li>높은 낮은 배율을 전환 합니다. 관찰 하기 위해 SCs, 적어도 20 X 목적은 필요)입니다.</li>
	<li>488 (FITC)에 대 한 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 / 555 (Rhodamine) Pax7 Laminin를 모두 관찰 하는 SCs를 식별 하는 동시에 신호. 이 설정에서 Pax7 얼룩의 신호는 배경 잡음을 더 나은 대비.</li>
	<li>신속 하 게 제대로 식별 SCs DAPI FITC에서 채널 대체. 모든 SCs Pax7/DAPI 양성 해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+and+cell+lineages+that+underlie+the+formation+of+skeletal+muscle.">Gene regulatory networks and cell lineages that underlie the formation of skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (23), 5830-5837 (2017).</li><li>Buckingham, M., Relaix, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX3+and+PAX7+as+upstream+regulators+of+myogenesis.">PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis.</a> Semin Cell Dev Biol. 44, 115-125 (2015).</li><li>Relaix, F., Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+insect+eye+to+vertebrate+muscle:+redeployment+of+a+regulatory+network.">From insect eye to vertebrate muscle: redeployment of a regulatory network.</a> Genes Dev. 13 (24), 3171-3178 (1999).</li><li>Chang, N. C., Chevalier, F. P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+in+Muscular+Dystrophy+-+Lost+in+Polarity.">Satellite Cells in Muscular Dystrophy - Lost in Polarity.</a> Trends Mol Med. 22 (6), 479-496 (2016).</li><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).</li><li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential.">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol Med. 14 (2), 82-91 (2008).</li><li>Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+the+engines+of+muscle+repair.">Satellite cells, the engines of muscle repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 127-133 (2011).</li><li>Rinaldi, F., Perlingeiro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+skeletal+muscle+regeneration:+therapeutic+potential+and+roadblocks.">Stem cells for skeletal muscle regeneration: therapeutic potential and roadblocks.</a> Transl Res. 163 (4), 409-417 (2014).</li><li>Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+satellite+cells+and+adult+myogenesis.">Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (6), 628-633 (2007).</li><li>Giordani, L., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+skeletal+muscle+regeneration:+Integrating+genetic+determinants+and+environmental+changes.">Epigenetic control of skeletal muscle regeneration: Integrating genetic determinants and environmental changes.</a> FEBS J. 280 (17), 4014-4025 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Feng, X., Adiarte, E. G., Devoto, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+acts+directly+on+the+zebrafish+dermomyotome+to+promote+myogenic+differentiation.">Hedgehog acts directly on the zebrafish dermomyotome to promote myogenic differentiation.</a> Dev Biol. 300 (2), 736-746 (2006).</li><li>Juan, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+EZH2+controls+self-renewal+and+safeguards+the+transcriptional+identity+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Polycomb EZH2 controls self-renewal and safeguards the transcriptional identity of skeletal muscle stem cells.</a> Genes Dev. 25 (8), 789-794 (2011).</li><li>Jackson, K. A., Snyder, D. S., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber-specific+green+autofluorescence:+potential+for+stem+cell+engraftment+artifacts.">Skeletal muscle fiber-specific green autofluorescence: potential for stem cell engraftment artifacts.</a> Stem Cells. 22 (2), 180-187 (2004).</li><li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements.">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li></ol>

저자는 공개 없다.

위의 프로토콜 Pax7/MF20 zebrafish 골격 근육12얼룩의 방법에 근거 했다. 사용 하 고 단계 차단 솔루션은 동일 하거나 유사한. 사용 하는 항 체는 동일 합니다. 조정된 단계 마우스 근육 조직과 SCs의 기능에 근거 했다. 첫째, 항 체 Laminin 시각화 하 고 SCs의 위치를 확인할 수 있도록 믹스에 추가 되었습니다. 그것은 특히 도움이 488/555;의 듀얼 필터 큐브를 사용 하 여 현미경 SCs의 수를 계?...

골격 근육 multinucleated 근육 세포의 구성, myotubes 이라고, myofibers, 힘 및 수 축을 통해 움직임을 생성 하는 구성. Craniofacial 일부 근육을 제외 하면 대부분 골격 근육 somite1라고 하는 임시 미 발달 구조에서 파생 됩니다. 조직적 전조 세포 상피 somite myoblasts 될에서 delaminate. 더 Myoblasts myocytes 멀티 nucleated myofibers를 myotubes 될 융합으로 구분 합니다. 위의 과정은 myogenesis 이라고 불리고 일시적으로 통제 제어 유전자 발현의 특징 이다. 조직적 선구자 표현할 Pax3 Pax7, 반면 myoblasts 익스프레스 MyoD 또는 Myf5 myocytes 익스프레스 myogenin myosins2,3. 근육 성장 있는 myofibers 될 큰 근육 섬유 크기 (비 대)4증가 기존 섬유 (증식)에 더 많은 myonuclei를 통합 하는 프로세스입니다. 근육 성장, 동안 줄기 세포 속성을 차별화 하 고 자기 갱신 수에 있는 조직적 셀의 지속 가능한 소스가입니다. 이 세포는 위성 세포 sarcolemma는 myofiber의 (세포 막)와 기저 lamina5사이 그들의 물리적 위치에 따라 불린다. SCs는 적극적으로 청소년 단계 (출생 후 쥐의 첫 2-3 주), 근육 성장에 기여 하지만 성인 근육6휴식에서 무부하 될. 놀랍게도, 그들은 근육에 다시 활성화 될 수 있습니다 손상 및 복구 손상 된 근육7새로운 근육 세포로 분화.
줄기 세포 속성 기본 근육 생물학 및 근육 질환8의 치료에 대 한 관련 SCs의 연구를 확인합니다. 결과적으로, 그것은 과거 십 년간에서 강렬한 수 사의 영역 되었습니다. 유전학 그리고 epigenetics SCs9,10의 해 부에 엄청난 진행이 했다. 분리 하 고 제자리에 SCs 식별에 관련 된 기술은 개발 하 고 방법11에 따라 최적화 된 했다. Immunofluorescent 얼룩 Pax7를 포함 하 여 특정 항 체를 사용 하 여 SCs의 식별 수 있습니다. 그러나, 부족 및 강한 자동-형광 성인 골격 근육 조직을 결합 하는 SCs의 작은 크기 렌더링 시각화 도전. 여기, 우리는 immunofluorescent 얼룩 프로토콜 Pax7 마우스 근육 조직에 대 한 최적화 및 zebrafish 근육12는 기존 방법에 따라 설명 합니다. 또한, 뚜렷한 fluorophore 표시 Laminin 항 체 기저 lamina는 SCs는 위치를 식별 하기 위해 채택 된다. 이 프로토콜은 지속적으로 Pax7 긍정적인 SCs와 모든 테스트 생리 적 조건 및 발달 단계에서 조직적 선구자의 시각화 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>methylbutane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62550-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Gibco, Themo Fisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% PFA</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>0 1-6201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td>115-007-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x Citrate Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>00 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin polyclonal rabbit antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant)</td>
			<td>Developmental Study Hybridoma Bank</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-21242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica CM1860 cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMR wide-field fluorescent microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM510 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM780 confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuisinart electronic pressure cooker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of skeletal muscle satellite cells by immunofluorescence with pax7 and laminin antibodies

면역 형광 검사 조직 섹션에 다른 세포 유형을 식별 하는 데 도움이 효과적인 방법입니다. 원하는 셀 인구를 공부 하기 위하여 특정 셀 표식에 대 한 항 체는 조직 섹션에 적용 됩니다. 성인 골격 근육 인공위성 세포 (SCs)는 근육 수리 및 재생에 기여 하는 줄기 세포 이다. 따라서, 그것은 시각화 하 고 다른 생리 적인 조건 하에서 위성 세포 인구를 추적 하는 것이 중요입니다. 골격 근육을 휴식, SCs 기저 lamina 및 myofiber 플라즈마 멤브레인 사이 상주 합니다. SCs는 myofibers 또는 세포 배양에서 식별 하는 데 일반적으로 사용 되 마커 Pax7 짝된 상자 단백질입니다. 이 문서에서는, 골격 근육 부분에 최적화 된 Pax7 면역 형광 검사 프로토콜은 일반적인 얼룩 및 백그라운드를 최소화 하 여. 기저 lamina의 단백질 (laminin)를 인식 하는 또 다른 항 체도 SCs 유사한 프로토콜을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다 또한 더블 또는 트리플 Pax7 및 관심사의 추가적인 단백질을 위한 항 체와 라벨을 수행 하기 위해 추가 되었다.

위의 단계에 따라 SCs 성공적으로 성인 휴식 근육 섹션 형광 현미경 (그림 1)의 밑에 구상 될 수 있다. 비록 성인 근육 조직 섬유의 특정 유형에 서 강한 자동 형광 있다, 밝은 알 렉 사 시리즈 염료 배경 잡음을 극복할 수와 신호 밖으로 서 (그림 1A, B, 화살표 머리). 두 광자 공초점 현미경 넓은 분야 형광 현미경 (<strong...

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Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

위성 세포의 정확한 식별 다양 한 생리 및 병 적인 조건 하에서 그들의 기능을 공부 하는 것이 필수적입니다. 이 문서는 얼룩 면역 형광 기반으로 성인 골격 근육 섹션에 위성 셀을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Cardiotoxin 주입에 의한 급성 골격 근육 재생 유도

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

수축 성 활동 유도 된 쥐 골격 근육 Phenotypic 적응 연구 만성 자극에의 응용

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

골격 근 생검 절차에서 인간 근육 선조 세포의 격리, 배양, 특성화 및 분화

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

면역 결핍 마우스에서 인간 골격 근 이종이식 수행

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...