עבודה זו נתמכת על ידי התחברות עבור תרגום-א מ- NIH/NCATS (TL1TR001104), קרן Welch הענק (I-1827), מענק R01 של NIGMS (RGM120502A) ל ז. ו. ז. ו. המלומד קמפ ספרינגס מורצ'יסון וירג'יניה מחקר רפואי, מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס מלומד (R1222).

1. מכינים דגימות
<ol><li>תרבות 2 x 106 עמילואיד לייצר תאים סרטניים של המעי הגס HT-29 בקערה תרביות רקמה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור בעובר ו פניצילין-סטרפטומיצין. התרבות התאים לינה חממה 37 ° C עם 5% CO2.<ol>
<li>לאחר התאים גדלים כדי 80% confluency, לשטוף את התאים עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 3 מ"ל של פתרון טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.</li>
		<li>לאחר התאים הם לגמרי dissociated מתוך קערה, להוסיף 10 מ של תרבות בינוני ולא להעביר את התאים עם פיפטה 10-mL צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף המדיום, resuspend את התאים ב 5 מ של תרבות בינוני, ולספור את התאים באמצעות מונה תא. צלחת 2 x 106 תאים של שני ס מ-10 מנות כל אחת.</li>
		<li>לאפשר את התאים לדבוק ולשחזר ללון בחממה 37 ° C עם 5% CO2. טיפול חלות על צלחת אחת כדי לגרום להיווצרות amyloids עם 20 ng/mL הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNF-α), 100 ננומטר Smac-מימטי ולאחר 20 מיקרומטר פאן-קספאז מעכב Z-VAD-FMK11. השילוב הוא באופן מקוצר כ- TSZ. פנקו את המנה אחרים עם רכב כפקד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר משך הזמן המתאים, בדרך כלל 6-אייץ ', לקצור את התא lysate.<ol>
<li>לגרד את התאים מהצלחת עם במגרדת פלסטיק ולהשתמש פיפטה של 10-mL להעביר לתוך צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף את התאים פי 2 על ידי resuspending ב- 10 מ"ל של PBS קר קרח צריך שתוציאו ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס. האחות הפתרון PBS. הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על ידי קופאת בגדר תא חנקן נוזלי ואחסון ב ˗80 ° C עד כחודש.</li>
		<li>בגדר תא להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge, דגירה ב mL 0.3 פירוק מאגר במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. תגובת שיקוע הוא lysate את כל התא. הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון הדגימה ב-20 ° C עבור אפילו מספר חודשים.</li>
		<li>למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד על-פי הפרוטוקול של היצרן. להוסיף 4 x המפגין-גיל מאגר טעינה כדי להכין 20 µL מדגם µg/µL 3, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מכינים ולהפעיל ג'לים
<ol><li>להוסיף 2 גר' agarose 200 מ של 1 x טריס-אצטט (טה) של מאגר כוס זכוכית ומחממים במיקרוגל כדי להמיס את agarose. להוסיף 1 מ"ל של 20% מרחביות על ריכוז סופי של 0.1% מרחביות. מערבולת בזהירות לערבב. לטפל לא כדי לייצר בועות לאחר התוספת מרחביות.</li>
	<li>שופכים את הפתרון agarose לתוך לוח ג'ל 15 ס מ x 14 ס מ. להשתמש על פיפטה 1-mL כדי לחסל בועות. מקום אחד מסרק 20-ובכן בחלק העליון.</li>
	<li>תחילה ממד: פיפטה 60 µg של כל תא lysate בנתיב ימני-קיצוני. להפעיל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות (עד החזית צבע היא כ ¾ דרך הג'ל) באמצעות את הגטים המכיל מרחביות 0.1% כמו המאגר המצטבר.</li>
	<li>שנית ממד: לסובב בזהירות את הג'ל 90° נגד כיוון השעון (איור 2א). הפעל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות. הערה: הפעלה כללית היא 4 V/ג'ל ס"מ. חשוב כי התנאים פועל הן בדיוק זהה עבור הממדים הראשון והשני.</li>
</ol>3. העברה
<ol><li>השתמש בשיטת העברה נימי כדי להעביר את החלבונים קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene (איור 2B).<ol>
<li>להוסיף 500 מ"ל של מאגר העברה כ 20 ס"מ על 20 ס"מ מיכל. להפוך ערימה גבוהה 5-ס מ של מגבות נייר ליד המכל. שטח הפנים העליון של הערימה חייב להיות גדול יותר מהמימדים ג'ל.</li>
		<li>להשרות נייר סינון של 14 ס"מ על 15 ס"מ מאגר העברה ומניחים על גבי נייר מגבת המחסנית. לטפל כדי למקם על הנייר ללא קמטים או בועות. חוזר עם עוד פיסת נייר סינון.</li>
		<li>להפעיל את קרום PVDF 14 ס"מ על 15 ס"מ ב מתנול עבור 30 s ואז להחליק אותו על נייר הסינון מקפיד להשתמש מכבש כדי להסיר את כל הבועות. לשטוף את הג'ל עם מאגר העברה, להחליק אותו על גבי הקרום, מגלגלים שוב בועות.</li>
		<li>לכסות על קצה מגבות הנייר הקרוב ביותר הגורם המכיל מאגר העברה בניילון נצמד. חשוב כי הגשר נייר נבנה בשלב הבא לא בא במגע ישיר עם הערימה מגבת נייר.</li>
		<li>לטבול פיסת נייר סינון 15 ס"מ x 35 ס"מ מאגר העברה ולמקם אותו כך קצה אחד מכסה את החלק העליון של הג'ל, והקצה השני נמצא בתוך המיכל מאגר העברה. חזור עם גשר נוסף.</li>
		<li>מכסה המכולה בניילון נצמד ומשאירים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ווסטרן סופג זיהוי
<ol><li>לשטוף את הקרום עם 50 מ של PBS המכילה 0.05% Tween-20 (PBST) בתוך מיכל 20 ס"מ × 20 ס"מ. הוסף 20 מ"ל חלב 5% PBST. רוק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לחסום.</li>
	<li>פיפטה 10 µL של הארנב נוגדן anti-MLKL לתוך 20 מ ל חלב 5% PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.</li>
	<li>פיפטה µL 4 של אנטי-rabbit-HRP 20 מ ל חלב 5% ב- PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.</li>
	<li>לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.</li>
	<li>להוסיף chemiluminescence משופרת המצע (ECL) ולחשוף לסרטי רנטגן לפי הפרוטוקול של היצרן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

הפן הקריטי ביותר של המפגין 2D-הגיל הוא כי התנאים אלקטרופורזה זהים עבור הממד הראשון והשני. היכולת לזהות קו אלכסוני חדה ב- 45 מעלות (המציין שהתרחשה אין דיסוציאציה או השפלה) תלוי הסיבים מעביר בצורה זהה במהלך שני electrophoreses. שימוש בתנאים שונים, לדוגמה שינוי המתח או את משך זמן ריצה, מטשטש את התוצאות ה...

היווצרות של סיבי עמילואיד עקב חלבון misfolding יש כבר זמן רב ידוע לשחק תפקיד פיפטות מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון1. לאחרונה, היווצרות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי הוכח להיות חלק איתות המסלולים בבני אדם, לרבות במהלך התגובה החיסונית מולדת אנטי ויראלית2 ו- necroptosis3,4, ואת היצורים התחתון כגון שמרים5,6. לכן, היכולת לזהות סיבים אלו במעבדה הוא חשוב. כיום, ישנן שלוש דרכים הראשי כדי לזהות עמילואיד ו סיבי עמילואיד כמו: השימוש של צבעי EM, המפגין-גיל.
השימוש של צבעים, כגון קונגו האדום או Thioflavin T, מציעה את היתרון של להיות מהירה בקלות לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ או ספקטרוסקופיה7. עם זאת, זיהוי על ידי מיקרוסקופ, במקרה של קונגו אדום, מספק אין ירידה לפרטים אודותיו חלבונים המרכיבים את הסיבים, או הגודל של הסיבים. בדומה לכך, השימוש של ספקטרוסקופיה לאתר קשירה קונגו אדום או Thioflavin T מתחמי חלבון מספק רק תוצאה חיובית או שלילית.
EM מספקת ראיה חלוטה הנוכחות של סיבים וגם מידע כמותי אודות סיבי האורך ואת קוטר8. עם זאת, שיטה זו דורשת טיהור מחמירים מאוד. בנוסף, EM היא טכניקה מיוחדת אשר משתמשת ציוד יקר.
המפגין-גיל שימש כדי לזהות עמידים מרחביות מגה דלטון חלבון מתחמי לרבות סיבי עמילואיד או דמוי עמילואיד. הוא מציע יתרונות רבים. ראשית, הוא אינו דורש הטיהור של סיבי, הוא קל לעיתים9. שנית, הוא מספק מידע איכותי על הגודל של הסיבים, כולל גודלו היחסי וכמות סיבים heterogenicity. לבסוף, מאחר סופג המערבי יכול להתבצע לאחר אלקטרופורזה, קל לזהות הנוכחות של כל חלבון אשר יש נוגדן, למרות יודגש כי מכיוון המפגין-גיל denaturing למחצה, epitopes מסוימים עשויים להישאר נסתרים אשר מסבך זיהוי על ידי נוגדנים.
לאחרונה, קולטן שמעצבת קינאז 1 (RIPK1) ו- 3 (RIPK3) דווחו על סיבי עמילואיד טופס כדי לשמש איתות פלטפורמות במהלך necroptosis, צורה מתוכנתים של נמק3. תוך כדי לימוד סיבים אלו, המעבדה שלנו הראה כי חלבון אחר הקשורים necroptosis, מעורב שושלת היוחסין קינאז כמו תחום (MLKL), נוצר גם סיבי עמילואיד דמוי4. עם זאת, לאחר בדיקה עם המפגין-גיל, גודל הסיבים MLKL הופיע נבדל הסיבים RIPK1 ו RIPK3, אשר הופיע זהים אחד לשני (איור 1). זה היה לא צפוי כי זה ידוע כי MLKL נקשר RIPK1/RIPK3 כדי ליצור necroptosis באיתות מורכבים שנקרא necrosome10.
ישנם לפחות שני הסברים. ראשית, שני סיבי עמילואיד דמוי שונים לגמרי עלולה להיווצר במהלך necroptosis, אחד המכיל RIPK1/RIPK3, את MLKL המכיל אחרים. שנית, רק סוג אחד של סיבי עמילואיד דמוי שהמכיל RIPK1/RIPK3/MLKL עשוי להיווצר במהלך necroptosis, אבל השיוך של MLKL חלבונים אחרים הוא חלש מספיק. כי זה dissociates במהלך המפגין-גיל.
כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציעים מבצע דו מימדי (2D) המפגין-עידן. המפגין-גיל-יציבה עמילואיד או סיבי עמילואיד דמוי יהיה אותו דפוס ההעברה במהלך אלקטרופורזה הממד הראשון והשני. זה יהיה לזיהוי לאחר העברת החלבונים קרום, בביצוע של תספיג חלבון. סיבי יציב תערוכת דפוס אלכסוני חדה. כל סטייה ממנו הייתי מציע כי הסיבים עוברים שינויים עקב מרחביות-אלקטרופורזה.

<table><tbody><tr><td>gel electrophoresis unit</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus for gel running.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>For agarose gel.</td></tr><tr><td>paper tower</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>blocking milk powder</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>for blocking in Western blot</td></tr><tr><td>MLKL antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>rabbit anti-MLKL antibody</td></tr><tr><td>RIPK1 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>mouse anti-RIPK1 antibody</td></tr><tr><td>RIPK3 antibody</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>secondary antibody</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Western chemiluminescent HRP substrate</td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>for Western blot result</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>penicilin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin solution</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>PBS for tissue culture</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>recombinant TNF</td><td>made in our lab</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetic</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; for counting cells</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>for measuring protein concentration in cell lysates</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>to remove cells from dish</td></tr><tr><td>Lysis Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 840 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 10 mL Triton-X100&lt;br/&gt; (protease and phosphates inhibitors as desired)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48.4 g Tris base&lt;br/&gt; 11.42 mL glacial acetic acid&lt;br/&gt; 20 mL 0.5M EDTA pH 8&lt;br/&gt; ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 to 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 4 mL 20% SDS&lt;br/&gt; 0.5 mL 10% bromophenol blue&lt;br/&gt; 31 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TBS Transfer Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 950 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST Wash Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS&lt;br/&gt; 800 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl&lt;br/&gt; 20 g KCl&lt;br/&gt; 144 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 10 L</td></tr></tbody></table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי קושרו עם מחלות רבות, עכשיו מתגלים להיות חשובה עבור רבים איתות המסלולים. היכולת לזהות בקלות היווצרות של סיבים אלה בתנאים שונים נסיוני חיוני להבנת פונקציית הפוטנציאל שלהם. שיטות רבות השתמשו כדי לזהות את הסיבים, אבל לא בלי מספר חסרונות. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או צביעת קונגו האדום או Thioflavin T לעיתים קרובות דורשת טיהור של הסיבים. מצד שני, agarose דטרגנט למחצה denaturing בג'ל (SDD-גיל) מאפשרת זיהוי של סיבי עמילואיד דמוי עמידים מרחביות תמציות תא ללא טיהור. בנוסף, הוא מאפשר השוואת ההבדל בגודל של הסיבים. ויותר חשוב, זה יכול לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בתוך הסיבים מאת סופג המערבי. זה פחות זמן רב ונגיש בקלות רבה יותר על מספר רחב של מעבדות. המפגין-גיל התוצאות מציגות לעיתים קרובות משתנה מידת הטרוגניות. זה מעלה את השאלה אם חלק הטרוגניות נובעת הדיסוציאציה של החלבונים במהלך אלקטרופורזה בנוכחות מרחביות. מסיבה זו, יש לנו עובדים ממד השנייה של המפגין-גיל כדי לקבוע אם הטרוגניות גודל ראיתי בעידן-המפגין הוא באמת תוצאה של סיבים הטרוגניות ויוו , לא תוצאה של השפלה או דיסוציאציה של חלק החלבונים במהלך אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת אישור מהיר, איכותי כי סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי לא בריא באופן חלקי במהלך תהליך המפגין-גיל.

לאחר אינדוקציה necroptosis, RIPK1 ו- RIPK3 הראו כמעט זהה עמילואיד דוגמאות (נתיבים 2 ו- 4, איור 1). עם זאת, סיבי MLKL היו הטרוגנית יותר ודומה להיות קטן יותר סיבים RIPK1/RIPK3 (ליין 6, איור 1). שהביאה אותנו לפתח שיטת המפגין-גיל 2D להתייחס לאפשרות MLKL טפסים סיבי RIPK1/RIPK3-עצ...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K Views.  UT Southwestern Medical Center. כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

Video: Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Neuroscience

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Biology

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

הפרדת חלבון עם SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct separation methods that have been coupled together: isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). This physically separates compounds across two axes of a gel by their isoelectric points (an electrochemical property) and their molecular weights.
The procedure in this video covers the main concepts of 2DGE and a general procedure for characterizing the composition of a complex protein solution. Three examples of this technique are shown in the applications section, including biomarker detection for disease initiation and progress, monitoring treatment in patients, and the study of proteins following posttranslational modification (PTM).
<div class="chapter_text" id="script_0">
Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let&#39;s go over a typical laboratory procedure.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins&#39; charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed a procedure, let&#39;s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients&#39; response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM&#39;s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
</div>

אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct ...

Chemistry

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

Source: Hanna-Addams, S., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57498">Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

Source: Hanna-Addams, S., et al. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or ...

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Source: Zhan, X., et al. <a href="https://www.jove.com/v/56739">Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

Source: Zhan, X., et al. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis is a high-resolution protein separation method first introduced by O&#39;&#160;Farrell and Klose in 1975. This method involves protein separation by two dimensions, mass and charge, making it more accurate than one-dimensional gel electrophoresis.
The first dimension separation uses the isoelectric focusing or IEF technique performed on immobilized pH gradient (IPG) strips that separate proteins according to their isoelectric points.
Biological samples, such as&#160; cells and tissues, are first prepared for IEF by treatment with a buffer containing urea, dithiothreitol, detergents, and ampholytes. Here, urea and detergent solubilize and denature the proteins. Dithiothreitol is a reducing agent that cleaves disulfide bonds. Ampholytes used in a suitable concentration solubilize the protein and maintain pH. The buffer also rehydrates the IPG strip that helps it absorb the proteins before their charge-based separation.
Proteins are amphoteric molecules with positive and negative charges. The amphoteric protein molecules migrate on the pH gradient of the IPG strip under the electric current. Once the proteins reach their isoelectric point, they immobilize because, at this point, they have no net charge. IPG strips have a fixed pH gradient; for instance, strips with a smaller pH range (for example, pH 4-7) can detect proteins with higher accuracy than those with a broader range (pH 3-10). Once the proteins separate, the IPG strips are treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer to proceed to the next phase, i.e., mass-based separation using SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). SDS covers the uncharged protein on the IPG strips with a negative charge, and glycerol reduces electroendosmosis which helps the transfer of proteins from the first to the second dimension.
Generally, bands on the gel can be visualized upon staining. Sometimes radiolabelled samples are used to obtain an autoradiographic image. Samples capable of producing fluorescent images can also be used.
Two-dimensional gel electrophoresis has gained importance owing to the precision of the outcome results. However, the method is unsuitable for distinguishing highly hydrophobic proteins,&#160; proteins with high molecular mass, or those present in very low quantities per cell.

Two-dimensional gel electrophoresis is a high-resolution protein separation method first introduced by O&#39;&#160;Farrell and Klose in 1975. This method ...

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

הפרדת חלבון עם SDS-PAGE

אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית

השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

הפרדת חלבון עם SDS-PAGE

אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting