이 작품은 대 한 친교에 의해 지원 상훈-. NIH/NCATS (TL1TR001104)에서 웰 치 재단 (I-1827), 부여 고 R01 부여 NIGMS (RGM120502A)에서 Z.W. Z.W. 의료 연구 및 암 예방 연구 연구소의 텍사스 학자 (R1222) 버지니아 머치 슨 Linthicum 학자 이다.

1. 샘플 준비
<ol><li>문화 2 x 106 아 밀 로이드 10 ml의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 페니실린 스-10cm 조직 문화 접시에 HT-29 결 장 암 세포를 생산. 문화 셀 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤.<ol>
<li>세포가 80 %confluency, 성장 후 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL로 세포 세척. 트립 신 솔루션의 3 mL를 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>셀 접시에서 완전히 끊 후, 문화 매체의 10 mL을 추가 하 고 10 mL 피 펫 셀 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 실 온에서 3 분 1000 x g에서 셀 원심 매체를 발음, resuspend 문화 매체의 5 mL에 셀과 셀 카운터를 사용 하 여 셀. 두 10 cm의 각 플레이트 2 x 106 셀.</li>
		<li>준수 하 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 복구를 셀 수 있습니다. 한 접시 20 ng/mL 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α), 100 nM Smac 모방 및 20 µ M 팬 caspase 억제제 Z-VAD-FMK11와 amyloids의 형성을 유도 하에 치료를 적용 됩니다. 조합으로 TSZ 약식 이다. 제어로 차량 다른 요리를 취급 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 길이의 시간 후 보통 6 h 세포 lysate 수확.<ol>
<li>플라스틱 스 크레이 퍼로 접시에서 셀을 다쳤어요 하 고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브로 전송. 1000 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심</li>
		<li>얼음 차가운 PBS의 10 mL에 resuspending 및 4 ° c.에 3 분 1000 x g에서 centrifuging 셀 2 회 세척 PBS 솔루션 발음 참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 셀 펠 릿 액체 질소에서 냉동 고 최대 1 개월 ˗80 ° C에 저장 하 여.</li>
		<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 셀 펠 릿을 전송 하 고 얼음에 30 분에 대 한 세포의 용 해 버퍼의 0.3 mL에서 품 어. 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 전체 세포 lysate 이다입니다. 참고: 프로세스 수 있습니다 수 일시 중지 여기 몇 개월-20 ° C에서 샘플을 저장 하 여.</li>
		<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 Bradford 분석 실험 단백질 농도 측정. 4 x 3 µ g / µ L 샘플의 20 µ L를 준비 하 여 10 분 동안 실내 온도에 품 어 SDD-나이 로딩 버퍼를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 하 고 실행 하는 젤
<ol><li>Agarose의 2 세대 유리 비 커에 녹기는 agarose는 전자 레인지에 열 1 x 트리 아세테이트 버퍼 (태)의 200 mL를 추가 합니다. 0.1 %SDS 최종 농도 20 %SDS 1 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 혼합 소용돌이 친다. SDS 추가 후 거품을 생성할 수 없는 주의.</li>
	<li>15 cm x 14 cm 젤 슬 래 브에 agarose 솔루션을 부 어. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 거품을 제거. 상단에서 한 20-잘 빗을 배치 합니다.</li>
	<li>첫 번째 치수: 피펫으로 60 µ g 전체 세포 lysate 맨 오른쪽 차선에서의. 실행 젤 60 V 약 4 h (염료 앞은 젤을 통해 서 약 ¾) 실행 버퍼 0.1 %SDS 포함 하는 태를 사용 하 여.</li>
	<li>두 번째 치수: 신중 하 게 회전 젤 90도 시계 반대 방향으로 (그림 2A). 60 V 약 4 h에서 젤을 실행 합니다. 참고: 일반 실행 조건은 4 V/cm 젤 길이입니다. 실행 조건에 정확히 같은 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 중요 하다.</li>
</ol>3입니다. 전송
<ol><li>모 세관 전송 메서드를 사용 하 여 (그림 2B) polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송.<ol>
<li>추가 전송 버퍼의 500 mL를 약 20 cm x 20 cm 컨테이너. 종이 수건 컨테이너 옆의 5 cm 높은 스택을 확인 합니다. 스택 맨의 표면적은 젤 크기 보다 커야 합니다.</li>
		<li>전송 버퍼에 14 cm x 15 cm 필터 종이 담근 다 고 종이 수건 스택 맨 위에 배치 합니다. 주름이 나 거품 없이 종이 주의 하십시오. 필터 종이의 또 다른 조각으로 반복 합니다.</li>
		<li>30 대 한 메탄올에 14 cm x 15 cm PVDF 막 활성화 s 다음 롤러를 사용 하 여 모든 거품을 제거 하도록 필터 종이에 레이어. 전송 버퍼와 젤을 씻어 하 고 다시 모든 거품을 압 막 위에 레이어.</li>
		<li>전송 버퍼의 컨테이너를 플라스틱 랩과 함께 가장 가까운 종이 수건의 가장자리를 커버. 그것은 중요 한 다음 단계에서 건설 종이 다리 종이 타월 스택와 직접 접촉으로 오지 않는다입니다.</li>
		<li>전송 버퍼에 15 cm x 35 cm 필터 종이 담근 다 고 그래서 한쪽 젤 상단 커버 하 고 다른 쪽 끝은 전송 버퍼의 컨테이너에 그것을 배치. 다른 다리와 함께 반복 합니다.</li>
		<li>플라스틱 포장을 가진 컨테이너를 커버 하 고 실 온에서 하룻밤 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 서 부 럽 탐지
<ol><li>0.05% 포함 된 PBS의 50 mL와 함께 막 씻어 20 cm × 20 cm 컨테이너에 트윈-20 (PBST). PBST에 5% 우유의 20 mL를 추가 합니다. 차단에 30 분 동안 실내 온도에 바위.</li>
	<li>PBST에 5% 우유의 20 mL에 토끼 안티-MLKL 항 체의 10 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 로커에 품 어</li>
	<li>5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.</li>
	<li>PBST에 5% 우유의 20 ml 안티 rabbit-HRP의 4 µ L 플라스틱을 컨테이너에 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 로커에 품 어.</li>
	<li>5 분 반복 5 번에 대 한 PBST의 20 mL에 멤브레인을 씻어.</li>
	<li>향상 된 화학 기판 (ECL)를 추가 하 고 제조업체의 프로토콜에 따라 x 선 필름에 노출.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

2D SDD-나이의 가장 중요 한 점은 전기 조건 첫 번째 및 두 번째 차원에 대 한 동일 하다는 것. 날카로운 대각선 45 ° (분리 또는 저하 발생 했음을 나타내는) 모두 동안 동일한 방식으로 마이그레이션 하는 섬유에 따라 검색할 수 electrophoreses. 예 전압 또는 실행된 시간을 변경 하는 다른 조건을 사용 하 여 이러한 결과 모호한 것 이다. 또한, 전통적인 1 D에 대 한 경우 처럼 SDD-나이, 샘플을 끓는 피해 ?...

단백질 misfolding로 인해 녹말 체 섬유의 형성이 오래 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 헌팅턴 병1pathologic 상태에 역할을 알려져 있다. 더 최근에, 녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유의 형성 안티 바이러스 타고 난 면역 반응2 와 necroptosis3,4, 동안 포함 한 인간, 그리고 낮은 유기 체 신호 통로의 일부가 될 표시 되었습니다. 효 모5,6등. 따라서, 실험실에서 이러한 섬유를 감지 하는 능력은 중요 합니다. 현재, 아 밀 로이드 및 아 밀 로이드 같은 섬유 감지 하 세 가지 주요 방법이 있다: 염료, EM, SDD-나이의 사용.
콩고 빨강 또는 Thioflavin T 같은 염료를 사용 하 여 신속 하 고 쉽게 현미경 검사 법 또는 분광학7를 사용 하 여 감지 되는 장점을 제공 합니다. 그러나, 현미경 검사 법, 콩고 빨강의 경우에 의해 탐지 아무 특이성을 대 한 단백질 구성 섬유 또는 섬유의 크기를 제공 합니다. 마찬가지로, 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 바인딩 단백질 복합물을 검출 하는 분광학의 사용만 긍정적 이거나 부정적인 결과를 제공 합니다.
그들의 섬유와 섬유 길이 직경8에 대 한 정량적 인 정보 존재의 결정적인 증거를 제공합니다. 그러나,이 방법은 매우 엄격한 정화를 요구 한다. 또한, 그들은 비싼 장비를 사용 하 여 전문된 기술.
SDD-나이 SDS 저항 메가 돌턴 단백질 복합물 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유를 포함 하 여 검색 사용 되었습니다. 그것은 많은 이점을 제공합니다. 첫째, 그것은 섬유의 정화를 요구 하지 않는다 고 수행9쉽습니다. 둘째, 그것은 상대적인 크기와 양의 섬유 heterogenicity 포함 하 여 섬유의 크기에 대 한 질적 정보를 제공 합니다. 마지막으로, 서 부 럽 전기 이동 법 후 수행할 수 있습니다, 때문에 그것은 비록 그 SDD 연령 반 변성 때문에 일부 epitopes 남아 있을 수 있습니다 은폐를 주목 해야 한다는 어떤 단백질의 항 체은 존재를 검출 하기 쉽다 항 체에 의해 감지를 복잡.
최근, 수용 체 상호 작용 단백질 키 니 아 제 1 (RIPK1) 및 3 (RIPK3) 플랫폼 necroptosis, 괴 사3의 프로그램된 형태 중 신호 역할을 양식 녹말 체 섬유에 보고 되었습니다. 이러한 섬유, 공부 하는 동안 우리의 실험실 아 밀 로이드 같은 섬유4을 형성 하는 또 다른 necroptosis 관련 된 단백질, 혼합 계보 니 도메인 같은 (MLKL), 보였다. 그러나, 검사 SDD-나이, MLKL 섬유의 크기 (그림 1) 서로 동일한 등장 RIPK1 및 RIPK3 섬유에서 등장. 그것은 잘 알려진 MLKL necroptosis 신호 복잡 한 necrosome10라는 형태로 RIPK1/RIPK3에 바인딩합니다 때문에 이것은 예상 이었다.
적어도 2 개의 설명이 있다. 먼저, 두 개의 완전히 다른 아 밀 로이드 같은 섬유 necroptosis, 포함 한 RIPK1/RIPK3 및 다른 포함 MLKL 동안 형성할 수 있습니다. 둘째, 아 밀 로이드 같은 섬유 포함 RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis, 하지만 다른 단백질 MLKL의 협회 동안 형성 될 수 있습니다만 한 가지 유형의 SDD 시대 dissociates 충분히 약한입니다.
이 해결 하기 위해 수행 하는 2 차원 (2D) SDD-나이 제안 한다. SDD-나이-안정 아 밀 로이드 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 첫 번째와 두 번째 차원 전기 이동 법 동안 동일한 마이그레이션 패턴을 갖습니다. 이것 막 단백질을 전송 하 고 서쪽 오 점 후 감지 될 것입니다. 안정적인 섬유 날카로운 대각선 패턴을 전시할 것 이다. 이에서 어떤 편차 섬유 SDS 전기 영동으로 변화 받아야 좋을 것.

<table><tbody><tr><td>gel electrophoresis unit</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus for gel running.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>For agarose gel.</td></tr><tr><td>paper tower</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>blocking milk powder</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>for blocking in Western blot</td></tr><tr><td>MLKL antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>rabbit anti-MLKL antibody</td></tr><tr><td>RIPK1 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>mouse anti-RIPK1 antibody</td></tr><tr><td>RIPK3 antibody</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>secondary antibody</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Western chemiluminescent HRP substrate</td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>for Western blot result</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>penicilin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin solution</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>PBS for tissue culture</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>recombinant TNF</td><td>made in our lab</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetic</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; for counting cells</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>for measuring protein concentration in cell lysates</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>to remove cells from dish</td></tr><tr><td>Lysis Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 840 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 10 mL Triton-X100&lt;br/&gt; (protease and phosphates inhibitors as desired)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48.4 g Tris base&lt;br/&gt; 11.42 mL glacial acetic acid&lt;br/&gt; 20 mL 0.5M EDTA pH 8&lt;br/&gt; ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 to 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 4 mL 20% SDS&lt;br/&gt; 0.5 mL 10% bromophenol blue&lt;br/&gt; 31 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TBS Transfer Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 950 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST Wash Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS&lt;br/&gt; 800 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl&lt;br/&gt; 20 g KCl&lt;br/&gt; 144 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 10 L</td></tr></tbody></table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

녹말 체 또는 아 밀 로이드 같은 섬유 많은 인간 질병과 관련 된 되었습니다 그리고 지금 많은 신호 경로 대 한 중요 한 발견 되 고 있습니다. 쉽게 다양 한 실험 조건에서 이러한 섬유의 형성을 감지 하는 능력은 그들의 잠재적인 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 많은 방법이 섬유 검출에 사용 된 있지만 몇 가지 단점이 없이. 예를 들어 전자 현미경 (EM), 또는 콩고 빨강 또는 Thioflavin T 종종 얼룩이 섬유의 정화를 요구 한다. 다른 한편으로, 반 변성 세제 agarose 젤 전기 이동 법 (SDD-나이) 정화 없이 셀 추출 물에 SDS 저항 아 밀 로이드 같은 섬유의 탐지를 허용 한다. 또한, 섬유의 크기 차이의 비교 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 그것은 서쪽 blotting에 의해 섬유 내의 특정 단백질을 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그것은 시간이 덜 소모 되 고 실험실의 넓은 수에 더 쉽게 액세스할 수입니다. SDD-나이 결과 종종 변수 정도의 표시 됩니다. SDS의 전기 이동 법 동안 복잡 한 단백질의 분리에서 결과이 부분의 여부를 문제를 발생 시킵니다. 이러한 이유로, 우리 SDD-연령 인지 확인 하려면 SDD 시대에 본 크기가 진정으로 섬유가 생체 내에서 의 결과 하지 저하 또는 일부 중 단백질의 분리의 결과의 두 번째 차원 고용 전기 이동 법입니다. 이 메서드는 빠른, 질적 확인을 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유는 SDD-나이 과정에서 부분적으로 해리 하지 않을 수 있습니다.

Necroptosis 유도 후 RIPK1 및 RIPK3 거의 동일한 아 밀 로이드 같은 패턴 (2, 4, 그림 1차선)을 보여주었다. 그러나, MLKL 섬유는 더 이질적인 되었고 RIPK1/RIPK3 섬유 (레인 6, 그림 1) 보다 작은 것 같았다. 그는 RIPK1/RIPK3-독립적인 섬유를 형성 하는 MLKL 또는 MLKL 단순히 SDD 시대 큰 RIPK1/RIPK3/MLKL 섬유에서 분리 가능성을 해결 하기 위해 2D SDD-나?...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K 조회수.  UT Southwestern Medical Center. 여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

비디오: Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

연구

신경과학

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

생물학

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

합의 뇌 유래 단백질, 2D-DIGE 미니 2DE 면역 블롯을 모두 사용하여 인간과 쥐과 뇌 프로테옴 연구를 위해 추출 프로토콜

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

SDS-PAGE로 단백질 분리

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

세포 및 분자 생물학의 기본 테크닉

Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct separation methods that have been coupled together: isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). This physically separates compounds across two axes of a gel by their isoelectric points (an electrochemical property) and their molecular weights.
The procedure in this video covers the main concepts of 2DGE and a general procedure for characterizing the composition of a complex protein solution. Three examples of this technique are shown in the applications section, including biomarker detection for disease initiation and progress, monitoring treatment in patients, and the study of proteins following posttranslational modification (PTM).
<div class="chapter_text" id="script_0">
Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let&#39;s go over a typical laboratory procedure.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins&#39; charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed a procedure, let&#39;s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients&#39; response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM&#39;s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
</div>

2차원 젤 전기포레시스

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct ...

화학

생화학

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

뇌 조직 추출물에서 아밀로이드 섬유의 분리

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

Source: Hanna-Addams, S., et al. <a href="https://www.jove.com/v/57498">Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

2차원 반변성 아가로스 겔 전기영동: 크기 이질성에 따라 다형성 아밀로이드 섬유를 분리하는 기술

Source: Hanna-Addams, S., et al. Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or ...

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis: A Separation Technique for Analysis of Proteins in Complex Protein Mixture Based on Charge and Molecular Weight

Source: Zhan, X., et al. <a href="https://www.jove.com/v/56739">Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue Proteome</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate a two-dimensional gel electrophoresis method that separates individual proteins from a complex protein mixture obtained from tumor tissues of human nonfunctional pituitary adenoma (NFPA). The proteins are separated based on their electric charge in the first dimension and further separated based on molecular weights in the second dimension.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

Source: Zhan, X., et al. Two-dimensional Gel Electrophoresis Coupled with Mass Spectrometry Methods for an Analysis of Human Pituitary Adenoma Tissue ...

Two-dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis is a high-resolution protein separation method first introduced by O&#39;&#160;Farrell and Klose in 1975. This method involves protein separation by two dimensions, mass and charge, making it more accurate than one-dimensional gel electrophoresis.
The first dimension separation uses the isoelectric focusing or IEF technique performed on immobilized pH gradient (IPG) strips that separate proteins according to their isoelectric points.
Biological samples, such as&#160; cells and tissues, are first prepared for IEF by treatment with a buffer containing urea, dithiothreitol, detergents, and ampholytes. Here, urea and detergent solubilize and denature the proteins. Dithiothreitol is a reducing agent that cleaves disulfide bonds. Ampholytes used in a suitable concentration solubilize the protein and maintain pH. The buffer also rehydrates the IPG strip that helps it absorb the proteins before their charge-based separation.
Proteins are amphoteric molecules with positive and negative charges. The amphoteric protein molecules migrate on the pH gradient of the IPG strip under the electric current. Once the proteins reach their isoelectric point, they immobilize because, at this point, they have no net charge. IPG strips have a fixed pH gradient; for instance, strips with a smaller pH range (for example, pH 4-7) can detect proteins with higher accuracy than those with a broader range (pH 3-10). Once the proteins separate, the IPG strips are treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer to proceed to the next phase, i.e., mass-based separation using SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). SDS covers the uncharged protein on the IPG strips with a negative charge, and glycerol reduces electroendosmosis which helps the transfer of proteins from the first to the second dimension.
Generally, bands on the gel can be visualized upon staining. Sometimes radiolabelled samples are used to obtain an autoradiographic image. Samples capable of producing fluorescent images can also be used.
Two-dimensional gel electrophoresis has gained importance owing to the precision of the outcome results. However, the method is unsuitable for distinguishing highly hydrophobic proteins,&#160; proteins with high molecular mass, or those present in very low quantities per cell.

2차원 젤 전기영동

Two-dimensional gel electrophoresis is a high-resolution protein separation method first introduced by O&#39;&#160;Farrell and Klose in 1975. This method ...