מחקר זה היה, בחלקו או במלואו, נתמך על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31472187 ו- 31672550), אגרונומיה ו תוכנית חדשנות טכנולוגית של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות.

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של מכון מחקר וטרינרי שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים חקלאי (מספר היתר: SHVRIAU-14-0101).
1. תרבות במבחנה של Schistosomes
הערה: Schistosomes מייצגים של חומרים מסוכנים. העובדים יש ללבוש כפפות גומי בכלל פעמים כאשר טיפול תולעים, המתלים schistosomal או אחרים הקשורים חומרים ביולוגיים. ניו זילנד ארנבים נדבקו בנגיף ~ 2,000 cercariae באמצעות חשיפה בטן. Schistosomes בשלב הכבד היו שנאספו ארנבים נגוע japonicum S. cercariae ב- 28 ימים לאחר הפגיעה על ידי זלוף של הכבד וורידים מצע המעי העליון. ההליכים של תולעת אוסף צריכה להפנות אליהם בפרסומים קודמים דיווח על מחקרים עכברים18.
<ol><li>לאסוף טפילים בתוך 500-mL. רוחצים אותם ביסודיות את x 3 בעדינות עם 200 מ של טרופה (37 מעלות צלזיוס) PBS (pH 7.4).</li>
	<li>הפרד ~ 200 זוגות תולעת על כל צלחת פטרי 90 מ מ. לאחר מכן לשטוף ביסודיות הטפילים, בעדינות 2 x עם 50 מ של טרופה (37 ° C) RPMI-1640 תרבות בינוני המכיל 100 U של פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין.</li>
	<li>לשמור על טפילים ב- 40 מ של טרופה RPMI-1640 תרבות בינונית ללא אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 -צפיפות של תולעת ~ 5 זוגות /mL עבור 2 h ב- 90 מ מ פטרי צלחת. הערות: המדיום RPMI 1640 אינו אמור להכיל סרום, אחרת יהיה הציג אקסוגני שלפוחית חוץ-תאית.</li>
</ol>2. מראש שטופלו תנאי מדיה
<ol><li>לאסוף את המדיום תרבות, ואז centrifuge המדיום ב 4 ° C ב g × 2,000 למשך 30 דקות להסיר את ביצי התולעת הטגמנטום פסולת.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים ולסנן ואז הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>לאסוף את פתרון מסונן בשקית dialyzed (משקל מולקולרי ניתוק: 3.5kD), ואז dialyze את הפתרון באמצעות פתרון 8% PEG8000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערות: השלב זה חשוב להעשיר את SjEVs להגדלת התשואה של בידוד SjEVs.</li>
</ol>3. בידוד של SjEVs
<ol><li>להעביר את הפתרון dialyzed צינור חדש ולאחר מכן להוסיף 0.5 נפחי הכימית בידוד מוחלט exosome.</li>
	<li>מערבבים את הפתרון על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח ההומוגניות של הפתרון.</li>
	<li>דגירה התערובת ב 2 מעלות צלזיוס 8 מעלות למשך הלילה.</li>
	<li>Centrifuge את התערובת ב g × 15,000 עבור h 1-2 ° C עד 8 ° C.</li>
	<li>האחות וזורקים את תגובת שיקוע. הערות: EVs הכלולים בגדר בחלק התחתון של הצינור (לא גלוי ברוב המקרים).</li>
	<li>Resuspend בגדר EVs ב 2 מ של PBS ולאחר מכן אחסן את הפתרון EVs ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.</li>
</ol>4. אפיון של EVs מאת סופג המערבי
<ol><li>לקבוע ריכוז חלבון הדגימה SjEVs, למשל, על ידי BCA וזמינותו.</li>
	<li>הכינו 10-20 µg של EVs במאגר ריפה 22.5 µL. לאחר מכן להוסיף 7.5 µL של 4 x טעינת מאגר וחום במשך 5 דקות ב 95 ° C.</li>
	<li>להפריד חלבונים SjEVs על ידי ג'ל מרחביות-דף 12%.</li>
	<li>להעביר את החלבונים PVDF ממברנה, ואז בדיקה עם נוגדנים anti-CD63 (1:1, 000 דילול), ואחריו חיטוט עם הארנב אנטי איג-HRP (1:5, 000 דילול).</li>
	<li>השתמש ריאגנט לזיהוי ECL לפיתוח ממברנה, לזהות את הסימנים chemiluminescence מערכת הדמיה.</li>
</ol>5. אפיון של EVs מאת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
<ol><li>להוסיף 2 µL של SjEVs מבודדים רשתות מצופים formvar ל- 200 עם רשת שינוי, אז לאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כתם עם 2% חומצה Phosphotungstic עבור 1 דקות, ואז לאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לטעון את הרשתות אל בעל מדגם של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, נחשפים בקרן אלקטרון kV 80 עבור לכידת תמונה.</li>
</ol>6. SjEVs תווית עם PKH67 ואת וזמינותו ספיגת תא
הערות: כל השלבים הבאים בוצעו בטמפרטורת החדר (20-25 ° C), אלא אם צוין אחרת.
<ol><li>העברת µg 5 SjEVs פתרון לתוך צינור פוליפרופילן התחתון חרוט ולכוונן את העוצמה 12 מ על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני.</li>
	<li>Centrifuge את SjEVs ב g × 110,000 במשך 90 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה SjEVs.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, תשאף היטב את תגובת שיקוע. הערה: לצבוע ethanolic PKH67 צריכים לא להתווסף ישירות בגדר SjEV, כמו זה יביא מכתים הטרוגנית ואת הכדאיות תא מופחת.</li>
	<li>להכין פתרון ההשעיה EV 2 x על-ידי הוספת 1 מ"ל של Diluent C בגדר SjEV; כדי להבטיח פיזור מלאה, resuspend עם pipetting עדין.</li>
	<li>לפני צביעת בדו Diluent, הכן טרי 2 x צבע פתרון על ידי הוספת 2 µL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 1 מ"ל של Diluent C בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן ולערבב היטב כדי לפזר.</li>
	<li>להוסיף במהירות של 1 מ"ל של x 2 EV ההשעיה (שלב 6.4) עד 1 מ"ל של 2 x צבע פתרון (שלב 6.5) ומיד מערבבים המדגם על-ידי pipetting.</li>
	<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות.</li>
	<li>הפסק ההכתמה על-ידי הוספת 4 מיליליטר FBS ולאחר מכן תקופת דגירה של 1 דקות.</li>
	<li>הוסף RPMI1640 בינוני לכוונן את עוצמת הקול מ ל 12 ולאחר מכן צנטריפוגה ב g × 110,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע והוסף בינוני RPMI1640 resuspend את PKH67 הנקרא SjEV כדורי.</li>
	<li>צנטריפוגה ב g × 110,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות לשטוף פעם אחת ולאחר מכן להוסיף PBS כדי resuspend את כדורי SjEVs.</li>
</ol>7. תא SjEVs ספיגה Assay
<ol><li>תאים בתרבית של זרע כמו NCTC לשבט 1469 תאים או HEK293T תאים ב- 6-ובכן צלחות (2 × 105 תאים לכל טוב), התרבות התאים בן לילה.</li>
	<li>מוסיפים 5 µg SjEVs מתויג PKH67, ואז התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 h.</li>
	<li>לאחר דגירה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים.</li>
	<li>לתקן את התאים עם 4% פתרון פורמלדהיד למשך 15 דקות, לשטוף פעמיים יותר עם PBS.</li>
	<li>כתם תא גרעינים עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).</li>
	<li>לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ זריחה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Extracellular+Vesicles:+Biogenesis,+RNA+Cargo+Selection,+Content,+Release,+and+Uptake.">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+of+helminths:+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development.">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).</li><li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+cancer:+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression.">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes:+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis.">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li><li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases.">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).</li><li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen,+Fasciola+hepatica:+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis.">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li><li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+secreted+by+nematode+parasites+transfer+small+RNAs+to+mammalian+cells+and+modulate+innate+immunity.">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488 (2014).</li><li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates.">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li><li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni.">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage.">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li><li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography.">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li><li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases.">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li><li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum.">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions.">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885 (2016).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).</li><li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+roles+in+cancer+diagnosis,+prognosis+and+therapy.">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מחקרים שנעשו לאחרונה על EVs הוכיחו את schistosome ש-evs לשחק תפקיד חשוב בפתוגן-פונדקאי אינטראקציות3,9,12,16. כתובת נוספת פונקציות התקינה שלהם, זה חיוני כדי לבודד EVs מן schistosomes. כאן, אנו מתארים שיטה חלופית עבור בידוד SjEV. שיטה זו מניבה ב...

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם אוכלוסיה של קטן מאוגד-קרום שלפוחית אנקפסולציה עם חלבונים, ליפידים ו חומצות גרעין שונות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EVs לשחק תפקיד מכריע תקשורת, מעורבים בוויסות תהליכים פיזיולוגיים רבים, לרבות פיתוח תא, ויסות מערכת החיסון, אנגיוגנזה תא העברה2, 3,4,5. לצבירת ראיות מציין כי EVs, במחזור exosomes, ואת המטען שלהם miRNA מייצג פוטנציאל סמנים ביולוגיים של מחלות מסוימות6.
מספר חד-תאיים כגון Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, לישמניה spp-, הוכחו להיות מסוגל להפריש EVs; helminths בנוסף נמצאו להפריש EVs לתוך החיים המארח7. EVs טפיליות הוכחו להיות מעורב קיומו של זיהום, פתוגניות8ו חסין תקנה9. מחקרים אחרונים שהיו בשימוש schistosomes 10,שני mansoni עלקת הבילהרציה (S. mansoni)11 ו ס japonicum12 הראו, למבוגרים schistosomes מפרישים exosome דמויי שלפוחית שעשויים להיות מעורב בהוראות פונקציונלי של תהליכים ביולוגיים ספציפיים.
עד כה, היו בשימוש מספר שיטות כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית, כגון ultracentrifugation, אולטראפילטרציה13, השימוש של ריאגנטים מבוסס פולימר, גודל-הדרה, ו- immunoaffinity בידוד. אלה שיטות שונות בעלי משלהם-יתרונות ומגבלות14. באופן כללי, ultracentrifugation נחשב לשיטת תקן הזהב שלפוחית בידוד. עם זאת, שיטה זו סובל המגבלה של EV פוטנציאליות צבירה14.
ב- schistosomes, כמה שיטות דווחו לבידוד EV: אלה כוללים את השימוש המסחרי EV בידוד ערכת16 עבור מספר שלבים (ביצים16,12,11,ultracentrifugation10 schistosomula11,12,10,schistosomes בוגרים17). בהתחשב בעובדה. שלפוחיות זעירות הן של מגוון רחב של גודל בין ננומטרים מאות אלפי ננומטר, פיתחנו שיטה חלופית המשלבת עם השימוש של ספסל צנטריפוגה אולטראפילטרציה, ערכת בידוד EV מסחרית כדי לבודד את EVs מ עלקת הבילהרציה japonicumלמבוגרים. EVs מבודד בדרך כלל בעל קוטר של 100-400 ננומטר, הופנמו בהצלחה על ידי תאים הנמען.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>For isolating S. japonicum extracellular vesicles</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>For labeling Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>For parasite culture</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;m syringe filter</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&amp;trade; Immobilon&amp;trade; Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 antibodies</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC clone 1469 cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; CCL-9.1&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE chemoluminescance imaging system</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם עלי הלוואי קרומיים שלפוחית שפורסמו על ידי מגוון רחב של תאים לתוך microenvironment חוץ-תאית. EVs לייצג אוכלוסייה של שלפוחית הטרוגנית, אשר גודל נע בין 40 ו- 1,000 ננומטר. ראיות המצטבר ציינו כי EVs תפקיד חשוב רגולטוריות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. הבנה עמוקה של schistosome EVs צריך לספק תובנות לגבי המנגנונים אינטראקציות schistosome-מארח, המאפשר פיתוח של אסטרטגיות הרומן נגד בילהרציה. כאן, אנו שואפים המשך מחקר EVs פונקציות ב- schistosomes על-ידי הצגת פרוטוקול להצפנה בידוד ואפיון של EVs מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum (S. japonicum). EVs הם בודדו אותנו מהמתרחש in vitro לקשרי תרבות בינוני באמצעות צנטריפוגה בשילוב עם ערכת בידוד exosome מסחרי. מבודדים japonicum ס EVs (SjEVs) בדרך כלל בעלי קוטר של 100-400 ננומטר, מאופיינים על ידי שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית החיוורים ומכתים המערבי. השימוש PKH67 צבע התווית על-ידי SjEVs הוכיחה כי SjEVs הם לנחלתו של התאים הנמען. בסך הכל, פרוטוקול שלנו מספק שיטה חלופית עבור בידוד EVs מ schistosomes למבוגרים; SjEVs מבודדים עשוי להיות מתאים אנליזה פונקציונלית.

כדי לכמת את התשואה של SjEVs מבודדים באמצעות פרוטוקול המתואר, השתמשנו BCA חלבון assay כדי לגשת ריכוז חלבון SjEVs מבודדים schistosomes למבוגרים 28 יום. כפי שמוצג בטבלה 1, ריכוז חלבון SjEV נע בין 208 µg אל µg 250 לכל 100 מ של מדיום (טבלה 1). גודל החלקיקים, כפי שנקבע על ידי ניתוח nanoparticle ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור חוץ-תאית שלפוחית (EVs) בידוד במבחנה בינוני בתרבית מ למבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum.

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

7.8K Views.  Ministry of Agriculture. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור חוץ-תאית שלפוחית (EVs) בידוד במבחנה בינוני בתרבית מ למבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum.

Video: Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Developmental Biology

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's interstitial space. The efficient enrichment of these sEVs is an important prerequisite to the study of their biological function and a key to the development of clinical detection techniques and therapeutic carrier technology. It is difficult to isolate sEVs from tissue because they are usually heavily contaminated. This study provides a method for the rapid enrichment of high-quality sEVs from liver cancer tissue. The method involves a four-step process: the incubation of digestive enzymes (collagenase D and DNase &#921;) with tissue, filtration through a 70 &#181;m cell strainer, differential ultracentrifugation, and filtration through a 0.22 &#181;m membrane filter. Owing to the optimization of the differential ultracentrifugation step and the addition of a filtration step, the purity of the sEVs obtained by this method is higher than that achieved by classic differential ultracentrifugation. It provides an important methodology and supporting data for the study of tissue-derived sEVs.

Here we describe the enrichment of small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue through an optimized differential ultracentrifugation method.

שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Cancer Research

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain proteins, nucleic acids, and lipids that are reflective of the parent cell from which they are derived. Proper separation of EVs from other components in a sample allows for characterization of their associated cargo and lends insight into their potential as intercellular communicators and non-invasive biomarkers for numerous diseases. In the current study, oligodendrocyte derived EVs were isolated from cell culture media using a combination of state-of-the-art techniques, including ultrafiltration and size exclusion chromatography (SEC) to separate EVs from other extracellular proteins and protein complexes. Using commercially available SEC columns, EVs were separated from extracellular proteins released from human oligodendroglioma cells under both control and endoplasmic reticulum (ER) stress conditions. The canonical EV markers CD9, CD63, and CD81 were observed in fractions 1-4, but not in fractions 5-8. GM130, a protein of the Golgi apparatus, and calnexin, an integral protein of the ER, were used as negative EV markers, and were not observed in any fraction. Further, when pooling and concentrating fractions 1-4 as the EV fraction, and fractions 5-8 as the protein fraction, expression of CD63, CD81, and CD9 in the EV fraction was observed. The expression of GM130 or calnexin was not observed in either of the fraction types. The pooled fractions from both control and ER stress conditions were visualized with transmission electron microscopy and vesicles were observed in the EV fractions, but not in the protein fractions. Particles in the EV and protein fractions from both conditions were also quantified with nanoparticle tracking analysis. Together, these data demonstrate that SEC is an effective method for separating EVs from conditioned cell culture media.

The protocol here demonstrates that extracellular vesicles can be adequately separated from conditioned cell culture media using size exclusion chromatography.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Neuroscience

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>טכניקות זיקוק לבידוד אקסוזום המופק מטחול מורין

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed that Exo derived from humoral or cell-supernatant are promising targets for novel diagnostic or prognostic biomarkers, underscoring their significant role in disease pathogenesis. Tissue-derived Exo (Ti-Exo) have attracted increasing attention due to its ability to accurately reflect tissue specificity and the microenvironment. Ti-Exo, present in interstitial space, play crucial roles in intercellular communication and cross-organ signaling. Despite their recognized value in elucidating disease mechanisms, isolating Ti-Exo remains challenging due to the complexity of tissue matrices and variability in extraction methods. In this study, we developed a practical protocol for isolating exosomes from mice spleen tissue, providing a reproducible technique for subsequent identification analysis and functional studies. We used Type I collagenase digestion combined with differential ultracentrifugation to isolate spleen-derived Exo. The characteristics of isolated Exo were determined through electron microscopy, the nano-flow cytometer, and the western blot. The isolated spleen-derived Exo displayed the typical morphology of lipid bilayer vesicles, with particle sizes ranging from 30 nm to 150 nm. In addition, the expression profile of exosome markers confirmed the presence and purity of exosomes. Taken together, we successfully established a practical protocol for isolating spleen-derived Exo in mice.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

Here, we present a protocol to isolate mouse spleen-derived exosomes using a combination of digestion with collagenase type I and ultracentrifugation.

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

שימוש ביצים מ

בידוד המוני וטיפוח במבחנה Intramolluscan שלבי מקרי דם אנושי Mansoni עלקת הבילהרציה

שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל להפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות ממדיית תרבית תאים מותנית

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר