هذه الدراسة كانت، جزئيا أو كلياً، تدعمها الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة الصين (31472187 و 31672550) والعلوم الزراعية والتكنولوجيا برنامج الابتكار من الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية.

جميع التجارب على الحيوانات كانت وافقت لجنة الأخلاقيات المحلية التابعة لمعهد شانغهاي لبحوث الطب البيطري، الأكاديمية الصينية "العلوم الزراعية" (تصريح رقم: شفرياو-14-0101).
1-الثقافة في المختبر المنشقات
ملاحظة: المنشقات تمثل الإخطار البيولوجية. يجب ارتداء العمال قفازات مطاط في جميع الأوقات عند معالجة الديدان، والمعلقات شيستوسومال، أو أخرى ذات الصلة بالمواد البيولوجية. كانوا مصابين بأرانب نيوزيلندا سيركاريا ~ 2,000 التعرض عن طريق البطن. وجمعت المنشقات في مرحلة الكبد من الأرانب المصابين سيركاريا بالبلەارسيات س في الإصابة بعد 28 يوما قبل التروية الكبد والاوردة المساريقي العلوي. تمت الإشارة إليها إجراءات جمع دودة في المنشورات السابقة الإبلاغ عن الدراسات في الفئران18.
<ol><li>جمع الطفيليات في كوب 500 مل. غسلها جيدا ويسخن برفق 3 x مع 200 مل من (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4).</li>
	<li>فصل أزواج دودة ~ 200 لكل طبق بيتري 90 ملم. ثم غسل الطفيليات جيدا ويسخن برفق 2 x مع 50 مل من (37 درجة مئوية) RPMI 1640 الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 100 يو للبنسلين و 100 مغ/مل من والستربتوميسين.</li>
	<li>الحفاظ على الطفيليات في 40 مل من RPMI 1640 مسخن الثقافة المتوسطة دون المضادات الحيوية في 37 درجة مئوية تحت 5% طبق CO2 في كثافة دودة ~ 5 أزواج/mL ل 2 ح في 90 ملم بيتري. ملاحظات: لا ينبغي أن تتضمن المتوسط RPMI 1640 المصل، وإلا سيتم عرض خارجية حويصلة خارج الخلية.</li>
</ol>2-ما قبل المعالجة شرط وسائل الإعلام
<ol><li>جمع المتوسطة الثقافة وثم الطرد المركزي المتوسطة في 4 درجات مئوية في 2,000 ز × مدة 30 دقيقة إزالة البيض والدودة tegmental الحطام.</li>
	<li>نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وقم بتصفية الحل باستخدام عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر.</li>
	<li>جمع الحل التي تمت تصفيتها في كيس دياليزيد (وقف الوزن الجزيئي: 3.5kD) وبعد ذلك دياليزي الحل باستخدام محلول 8% PEG8000 في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ملاحظات: تعد هذه الخطوة مهمة لإثراء سجيفس لزيادة عائد العزلة سجيفس.</li>
</ol>3-عزل سجيفس
<ol><li>نقل الحل دياليزيد إلى أنبوب جديد ثم قم بإضافة 0.5 حجم الكاشف العزل التام اكسوسومي.</li>
	<li>مزيج الحل جيدا من قبل فورتيكسينج أو بيبيتينج صعودا وهبوطاً لضمان التجانس للحل.</li>
	<li>احتضان هذا الخليط عند درجة مئوية 2 إلى 8 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>الطرد المركزي الخليط في 15,000 ز × ح 1 عند 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية.</li>
	<li>نضح وتجاهل المادة طافية. ملاحظات: وترد المركبات الكهربائية في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب (غير مرئي في معظم الحالات).</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه المركبات الكهربائية في 2 مل من برنامج تلفزيوني ومن ثم تخزين حل المركبات الكهربائية في-80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.</li>
</ol>4-توصيف المركبات الكهربائية من النشاف الغربية
<ol><li>تحديد تركيز العينة سجيفس، مثلاً، باتفاق التعاون الأساسي مقايسة البروتين.</li>
	<li>إعداد 10-20 ميكروغرام من المركبات الكهربائية في ميليلتر 22.5 ريبا المخزن المؤقت. قم بإضافة ميليلتر 7.5 من 4 × تحميل المخزن المؤقت والحرارة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.</li>
	<li>فصل البروتينات سجيفس بهلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 12%.</li>
	<li>نقل البروتينات إلى غشاء PVDF والتحقيق ثم مع الأجسام المضادة-CD63 (1:1، 000 تمييع)، متبوعاً بالتحقيق مع أرنب المضادة مفتش-برنامج الصحة الإنجابية (1:5، وتمييع 000).</li>
	<li>استخدام كاشف كشف مسافنة للتنمية الغشاء والكشف عن الإشارات التي تشيميلومينيسسينسي نظام التصوير.</li>
</ol>5-توصيف المركبات الكهربائية مجهر إلكتروني
<ol><li>إضافة 2 ميليلتر من سجيفس معزولة إلى 200 شبكة الشبكات المغلفة فورمفار وثم السماح له جاف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>وصمة عار مع 2% حمض فوسفوتونجستيك لمدة 1 دقيقة وثم السماح له جاف في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تحميل الشبكات على صاحب العينة المجهر الإلكتروني انتقال ويتعرضون لشعاع إلكترون كيلوفولت 80 لالتقاط الصور.</li>
</ol>6-سجيفس التسمية مع PKH67 ومقايسة الامتصاص الخلية
ملاحظات: وأجريت كل الخطوات اللاحقة في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية)، ما لم يبين خلاف ذلك.
<ol><li>نقل 5 ميكروغرام الحل سجيفس في أنبوب البولي بروبلين قاع مخروطي وضبط مستوى الصوت إلى 12 مل بإضافة المتوسط RPMI 1640.</li>
	<li>الطرد المركزي في سجيفس في 110,000 × ز لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه سجيفس.</li>
	<li>بعد الطرد المركزي، بعناية نضح المادة طافية. ملاحظة: صبغ اثانوليك PKH67 أن لا تضاف مباشرة إلى بيليه سيف، كهذا سيؤدي في تلطيخ غير متجانسة واستمرارية انخفاض الخلية.</li>
	<li>إعداد حل تعليق EV 2 x بإضافة 1 مل من "مادة ج" بيليه سيف؛ للتأكد من تشتت كاملة، ريسوسبيند مع بيبيتينج لطيف.</li>
	<li>قبل تلوين في "مادة ج"، إعداد 2 جديدة × صبغ الحل بإضافة 2 ميليلتر من الحل صبغ اثانوليك PKH67 إلى 1 مل من "مادة سي" في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين وخلط جيدا لتفريق.</li>
	<li>سرعة إضافة 1 مل x 2 تعليق EV (6.4 خطوة) إلى 1 مل 2 × "صبغ الحل" (الخطوة 6، 5) وعلى الفور خلط العينة بيبيتينج.</li>
	<li>احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق.</li>
	<li>إيقاف تلطيخ بإضافة 4 مل FBS ومن ثم احتضانها لمدة 1 دقيقة.</li>
	<li>إضافة RPMI1640 المتوسطة ضبط حجم الصوت إلى 12 مل وثم الطرد المركزي في 110,000 ز × عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.</li>
	<li>إزالة المادة طافية وإضافة المتوسطة RPMI1640 ريسوسبيند PKH67 المسمى الكريات سيف.</li>
	<li>الطرد المركزي في 110,000 ز × عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة يغسل مرة واحدة ثم قم بإضافة برنامج تلفزيوني الكريات سجيفس ريسوسبيند.</li>
</ol>7-مقايسة الامتصاص الخلية سجيفس
<ol><li>خلايا الثدييات البذور مثل NCTC استنساخ 1469 الخلايا أو الخلايا HEK293T في البئر 6 لوحات (2 × 105 خلايا، كل بئر) والثقافة الخلايا بين عشية وضحاها.</li>
	<li>إضافة 5 ميكروغرام المسمى PKH67 سجيفس والثقافة ثم الخلايا في 37 درجة مئوية ح 2-4.</li>
	<li>بعد الحضانة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين.</li>
	<li>إصلاح الخلايا مع 4% فورمالدهايد الحل لمدة 15 دقيقة وغسلها مرتين أكثر مع برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>وصمة عار نواة الخلية مع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI).</li>
	<li>مراقبة الخلايا باستخدام مجهر الأسفار.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Extracellular+Vesicles:+Biogenesis,+RNA+Cargo+Selection,+Content,+Release,+and+Uptake.">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+of+helminths:+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development.">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).</li><li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+cancer:+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression.">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes:+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis.">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li><li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases.">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).</li><li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen,+Fasciola+hepatica:+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis.">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li><li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+secreted+by+nematode+parasites+transfer+small+RNAs+to+mammalian+cells+and+modulate+innate+immunity.">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488 (2014).</li><li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates.">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li><li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni.">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage.">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li><li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography.">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li><li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases.">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li><li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum.">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions.">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885 (2016).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).</li><li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+roles+in+cancer+diagnosis,+prognosis+and+therapy.">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وقد أثبتت الدراسات الأخيرة على المركبات الكهربائية المنشقات تلك المركبات دوراً هاما في المضيف الممرض التفاعلات3،9،،من1216. مواصلة التصدي لمهامها التنظيمية، من الضروري عزل المركبات الكهربائية من المنشقات. هنا، يمكننا و...

حويصلات خارج الخلية (EVs) عدد سكان صغير الحويصلات الغشاء زمنياً مغلفة بمختلف البروتينات والدهون والأحماض النووية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المركبات الكهربائية تلعب دوراً حاسما في خلية خلية الاتصال، ويشاركون في تنظيم العديد من العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك التنمية الخلية والتنظيم المناعي والأوعية وخلية الهجرة2، 3،،من45. تتراكم الأدلة تشير إلى أن المركبات الكهربائية، تعميم اكسوسوميس، وحمولتها ميرنا تمثل المؤشرات الحيوية المحتملة لبعض الأمراض6.
البروتوزوا عدة مثل المشعرة المهبليةو مثقبيه الكروزية ليشمانيا spp.، أظهرت أن تكون قادرة على إفراز المركبات الكهربائية؛ بالإضافة إلى ذلك تم العثور على الديدان لإفراز المركبات الكهربائية في المعيشة وتستضيف7. أظهرت المركبات الكهربائية الطفيلية إلى المشاركة في الحفاظ على الإصابة والقدرة الإمراضية8التنظيم المناعي9. الدراسات الأخيرة في المنشقات كل 10، المنسونيه بلهارسيه (س. المنسونيه)11 و بالبلەارسيات س.12 قد أشارت إلى أن تفرز المنشقات الكبار حويصلات مثل اكسوسومي التي قد تكون وتشارك في اللوائح الفنية لعمليات بيولوجية معينة.
وحتى الآن، استخدمت عدة طرق لعزل حويصلات خارج الخلية، مثل تنبيذ فائق، أولترافيلتريشن13، واستخدام الكواشف المستندة إلى البوليمر، وحجم الاستبعاد اللوني والعزلة إيمونوافينيتي. هذه الأساليب المختلفة تمتلك14المزايا والقيود الخاصة بها. وبوجه عام، يعتبر تنبيذ فائق الأسلوب المعيار الذهبي لعزل حويصلة. ومع ذلك، يعاني هذا الأسلوب من الحد من التراكم EV المحتملة14.
في المنشقات، أبلغ عن اثنين من الأساليب لعزل EV: وتشمل هذه تنبيذ فائق11،،من1210 واستخدام التجاري EV العزلة طقم16 لعدة مراحل (16من البيض، شيستوسومولا11المنشقات البالغين10،،من1217). نظراً لأن ميكروفيسيكليس هم من طائفة واسعة من حجم نانومتر مئات عدة من آلاف نانومتر، قمنا بتطوير أسلوب بديل يجمع بين استخدام الطرد المركزي مقاعد البدلاء، أولترافيلتريشن، ومجموعة EV عزلة تجارية لعزل المركبات من بلهارسيه بالبلەارسياتمن الكبار. المركبات الكهربائية المعزولة عادة ما يمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر وتم استيعابه بنجاح بالخلايا المتلقية.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>For isolating S. japonicum extracellular vesicles</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>For labeling Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>For parasite culture</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;m syringe filter</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&amp;trade; Immobilon&amp;trade; Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 antibodies</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC clone 1469 cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; CCL-9.1&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE chemoluminescance imaging system</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum

حويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات الغشائية التي صدر عن مجموعة متنوعة من الخلايا إلى المكروية خارج الخلية. المركبات الكهربائية تمثل أن حويصلات غير المتجانسة، التي حجم يتراوح بين 40 و 000 1 نانومتر. وأشارت الأدلة المتراكمة إلى أن المركبات الكهربائية تلعب أدواراً تنظيمية هامة في التفاعلات المضيف الممرض. وينبغي التبصير على فهم عميق للمركبات الكهربائية المنشقات الآليات الأساسية للتفاعلات المنشقات-المضيف، مما يتيح وضع استراتيجيات جديدة ضد مرض البلهارسيا. هنا، ونحن نهدف إلى مواصلة دراسة وظائف المركبات الكهربائية في المنشقات بتقديم بروتوكول لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات (بالبلەارسيات S.). وكانت المركبات الكهربائية معزولة من المتوسطة الثقافة في المختبر باستخدام الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع مجموعة مواد عزل اكسوسومي تجارية. معزولة بالبلەارسيات س. المركبات الكهربائية (سجيفس) عادة ما تمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر، وتتميز مجهر إلكتروني والنشاف الغربية. وأثبتت استخدام الصبغة المسماة سجيفس PKH67 أن سجيفس يتم استيعابه بالخلايا المتلقية. إجمالاً، لدينا بروتوكول يوفر طريقة بديلة لعزل المركبات الكهربائية من المنشقات الكبار؛ سجيفس معزولة قد تكون مناسبة للتحليل الوظيفي.

لتحديد مقدار عائد سجيفس معزولة باستخدام بروتوكول وصف، استخدمنا مقايسة البروتين اتفاق التعاون الأساسي للوصول إلى تركيز البروتين سجيفس المعزولة من المنشقات الكبار 28 يوما. كما هو مبين في الجدول 1، وتركيز البروتين سيف تراوحت ميكروغرام 208 إلى 250 ميكروغرام في 100 مل مت...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

نقدم هنا، بروتوكولا لوصف العزلة حويصلات خارج الخلية (EVs) المتوسط في المختبر ومثقف من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات.

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

7.8K Views.  Ministry of Agriculture. نقدم هنا، بروتوكولا لوصف العزلة حويصلات خارج الخلية (EVs) المتوسط في المختبر ومثقف من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات.

Video: Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

باستخدام بويضات من<em&gt; البلهارسيا المنسونية</em&gt; ك<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نموذج من التهاب الرئة الناجم عن الديدان الطفيلية

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Developmental Biology

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's interstitial space. The efficient enrichment of these sEVs is an important prerequisite to the study of their biological function and a key to the development of clinical detection techniques and therapeutic carrier technology. It is difficult to isolate sEVs from tissue because they are usually heavily contaminated. This study provides a method for the rapid enrichment of high-quality sEVs from liver cancer tissue. The method involves a four-step process: the incubation of digestive enzymes (collagenase D and DNase &#921;) with tissue, filtration through a 70 &#181;m cell strainer, differential ultracentrifugation, and filtration through a 0.22 &#181;m membrane filter. Owing to the optimization of the differential ultracentrifugation step and the addition of a filtration step, the purity of the sEVs obtained by this method is higher than that achieved by classic differential ultracentrifugation. It provides an important methodology and supporting data for the study of tissue-derived sEVs.

Here we describe the enrichment of small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue through an optimized differential ultracentrifugation method.

طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Cancer Research

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain proteins, nucleic acids, and lipids that are reflective of the parent cell from which they are derived. Proper separation of EVs from other components in a sample allows for characterization of their associated cargo and lends insight into their potential as intercellular communicators and non-invasive biomarkers for numerous diseases. In the current study, oligodendrocyte derived EVs were isolated from cell culture media using a combination of state-of-the-art techniques, including ultrafiltration and size exclusion chromatography (SEC) to separate EVs from other extracellular proteins and protein complexes. Using commercially available SEC columns, EVs were separated from extracellular proteins released from human oligodendroglioma cells under both control and endoplasmic reticulum (ER) stress conditions. The canonical EV markers CD9, CD63, and CD81 were observed in fractions 1-4, but not in fractions 5-8. GM130, a protein of the Golgi apparatus, and calnexin, an integral protein of the ER, were used as negative EV markers, and were not observed in any fraction. Further, when pooling and concentrating fractions 1-4 as the EV fraction, and fractions 5-8 as the protein fraction, expression of CD63, CD81, and CD9 in the EV fraction was observed. The expression of GM130 or calnexin was not observed in either of the fraction types. The pooled fractions from both control and ER stress conditions were visualized with transmission electron microscopy and vesicles were observed in the EV fractions, but not in the protein fractions. Particles in the EV and protein fractions from both conditions were also quantified with nanoparticle tracking analysis. Together, these data demonstrate that SEC is an effective method for separating EVs from conditioned cell culture media.

The protocol here demonstrates that extracellular vesicles can be adequately separated from conditioned cell culture media using size exclusion chromatography.

كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات خارج الخلية عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Neuroscience

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>تقنيات التكرير لعزل الإكسوسوم المشتق من طحال الفئران

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed that Exo derived from humoral or cell-supernatant are promising targets for novel diagnostic or prognostic biomarkers, underscoring their significant role in disease pathogenesis. Tissue-derived Exo (Ti-Exo) have attracted increasing attention due to its ability to accurately reflect tissue specificity and the microenvironment. Ti-Exo, present in interstitial space, play crucial roles in intercellular communication and cross-organ signaling. Despite their recognized value in elucidating disease mechanisms, isolating Ti-Exo remains challenging due to the complexity of tissue matrices and variability in extraction methods. In this study, we developed a practical protocol for isolating exosomes from mice spleen tissue, providing a reproducible technique for subsequent identification analysis and functional studies. We used Type I collagenase digestion combined with differential ultracentrifugation to isolate spleen-derived Exo. The characteristics of isolated Exo were determined through electron microscopy, the nano-flow cytometer, and the western blot. The isolated spleen-derived Exo displayed the typical morphology of lipid bilayer vesicles, with particle sizes ranging from 30 nm to 150 nm. In addition, the expression profile of exosome markers confirmed the presence and purity of exosomes. Taken together, we successfully established a practical protocol for isolating spleen-derived Exo in mice.

<meta charset="utf8"></head><body>عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

Here, we present a protocol to isolate mouse spleen-derived exosomes using a combination of digestion with collagenase type I and ultracentrifugation.

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

بالمذنبات والتحول في المختبر زراعة البلهارسيا المنسونية Schistosomules

باستخدام بويضات من

العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه

طريقة إثراء للحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من أنسجة سرطان الكبد

كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لفصل الحويصلات خارج الخلية عن وسائط زراعة الخلايا المشروطة

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر