אנו מודים חן סל פרופסור דוקטור יואה ג'אנג, Kendy הואנג לקבלת עזרה בהתקנת מערכת אלקטרופורציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן סנטה קרוז סרטן לטובת קבוצה NIH Z.A.W.

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו בהתאם הנחיות והתקנות מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז.
1. פלסמיד והכנת כלים
<ol><li>עבור כל שלפוחית השתן transfect, להכין µL לפחות עשרים של הדנ א פלסמיד (µg 1/µL).</li>
	<li>להוסיף 1 µL של Trypan Blue µL 20 של פתרון פלסמיד צינור microcentrifuge 1.5 mL. פיפטה לערבב היטב.</li>
	<li>אוטוקלב כירורגי כל כלים ולחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. לרסס סטריליים, כפפות עם אתנול 70% בתדירות גבוהה או להשתמש מעקר חרוז זכוכית בעת ביצוע השלבים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים.</li>
</ol>2. anaesthetizing בעלי חיים
<ol><li>השתמש מערכת הרדמה בראש הטבלה כדי עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין. להפעיל את הטנק2 O ולהתאים את זרימה חמצן כדי 1 ליטר/דקה.</li>
	<li>המקום העכבר C57BL/6J הנשי למבוגרים בבית הבליעה אינדוקציה. הפעל והתאם את מאדה איזופלוריין 3% עבור אינדוקציה. העכבר צריך להיות בהרדמה תוך 2 דק מנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously על ההסרה של העכבר מן החדר אינדוקציה על שיכוך כאבים מונעת. הערה: פרוטוקול זה, נקבה עכברים משמשים, כפי שהם יותר קל לעבוד עם במהלך צנתור השופכה. הפרוטוקול פועל גם על עכברים זכר, אך נדרש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע שלב 3.</li>
	<li>משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים של החיה למניעת יובש. הנח את העכבר anaesthetized פונה כלפי מעלה על משטח חימום עם האף שלה בקונוס האף. תלחץ על המתג מעגל אוויר כדי לאפשר איזופלוריין לעבור את חרוט האף.</li>
	<li>לרסן את הראש והחרוט האף עם דבק. התאם את מאדה איזופלוריין ל-2% לצורך תחזוקה.</li>
	<li>לרסן את הגפיים עם דבק. לבצע הבוהן-קמצוץ בדיקות כדי לוודא החיה בהרדמה עמוקה, ואז מגלחים את אזור הבטן.</li>
</ol>3. שתן דלדול ושטיפה שלפוחית השתן
<ol><li>חלות סיכה הקטטר (G 24, אורך של 2.11 ס"מ, הקוטר החיצוני של ס"מ 0.045) ולהבטיח כי השטח החיצוני שלה מכוסה.</li>
	<li>הכנס את הצנתר לתוך הפתח השופכה, לאט לדחוף אותו עד שהוא מגיע שלפוחית השתן, ובו בזמן השתן צריך לזרום החוצה דרך הקטטר. לחץ בעדינות את הבטן כדי לסייע דלדול שתן.<ol>
<li>בדוק אם הצנתר הוכנס לתוך שלפוחית השתן על ידי התבוננות שתן אוטומטיים יותר זורם. להימנע פירסינג הקיר שופכה ושלפוחית ולהחיל סיכה מספר פעמים במידת הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחוק את השתן עם פיפטה לתוך גביע פסולת.</li>
	<li>פיפטה µL 80 תמיסת פוספט buffered (PBS) אל הקצה החיצוני של הקטטר, בקצהו השני עדיין בשלפוחית. בזהירות לצרף מזרק 1 מ"ל הצנתר. דחף בעדינות את המזרק כדי להזריק את החינוכית לתוך שלפוחית השתן. להשאיר קצת PBS הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.</li>
	<li>הסר את המזרק. המתן PBS לנקז החוצה שלפוחית השתן. לחץ בעדינות את הבטן לפנות PBS.</li>
	<li>למחוק את PBS הקטטר עם פיפטה לתוך כשהספל פסולת.</li>
	<li>חזור על PBS שטיפה (שלבים 3.4-3.6) עוד פעמיים. הערה: זה חיוני כדי לעבוד בעדינות במהלך השלבים כביסה. דם קטטר או כשל אוטומטי מחוץ זרימה של נוזל בדרך כלל מצביע על השופכה היא חדרה מבעד. חשוב גם להימנע היכרות עם בועות אוויר, כפי שהם יקטין את היעילות אלקטרופורציה.</li>
</ol>4. פלסמיד משלוח
<ol><li>להחיל 70% אתנול בבטן בעכבר ולהשתמש אזמל לעשות חתך אנכי של 1 ס מ כדי לפתוח את העור בבטן מעל שלפוחית השתן.</li>
	<li>פיפטה µL לפחות עשרים של פלסמיד בתוספת Trypan Blue פתרון אל הקצה החיצוני של הקטטר, ולצרף את המזרק.</li>
	<li>להזריק את הפתרון פלסמיד לתוך שלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופך לכחול, הזריקה הוא מוצלח. יוצאים נוזל הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.</li>
	<li>. תפוס את פתח השופכה חיצוני באמצעות פינצטה ולאחר מכן הסר את הקטטר ואת המזרק. להשתמש במחרוזת כדי להדק את פתח השופכה חיצוניים. להפוך את שתי לולאות עם המחרוזת, ואז לקשור עם שני קשרים. הערה: הידוק של השופכה חשוב למניעת זרם אחורי של נוזל פלסמיד.</li>
	<li>להפעיל את הגנרטור אלקטרופורציה עם הפרמטרים הבאים: 33V, 50 מילישניות זמן עבודה, ו- 950 ms מרווח הזמן.</li>
	<li>להחזיק את השלפוחית עם פינצטה וצבטתי את השלפוחית עם שתי אלקטרודות. ללחוץ על דוושת רגל כדי לבצע את אלקטרופורציה. הערה: פולסים חשמליים מוגדרים יכולה להופיע 5 פעמים עם מרווחי זמן קצר לאחר כל דחיפה פדלים. העכבר עשוי להתעוות בתהליך זה. לוחץ על דוושת רגל יותר מפעם אחת יכול להגביר את היעילות המסירה, אך פולסים חשמליים רבים מדי עלולה לגרום נזק על urothelium שלמות רקמות.<ol>
<li>הימנע מכל מגע בין את הפינצטה האלקטרודות, כמו פעולה זו תיצור ניצוץ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. השבת
<ol><li>תפר פתיחת בטן, עור עם תפירה סטריליים, אטבים. החל יוד לתוך הפצע.</li>
	<li>הסר את החיה המערכת איזופלוריין. לנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously כדי להקל על הכאב לאחר ניתוח.</li>
	<li>לשמור את החיה על כרית חימום ולהחזיר אותה לכלוב הביתה לאחר החלמה מלאה. בדוק את החיה לפחות פעם ביום לניידות נורמלי, השתייה והאכלת התנהגויות, אין סימנים לזיהום עד החתך נרפאה ולאחר מכן הסר את הקליפים. לנהל זריקות עוקבות של הבופרנורפין שיכוך כאב אם החיה מציגה סימפטום כאב כגון מופחתת לטפח, גדל תוקפנות, והניקוד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver.">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li><li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing.">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li><li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis.">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium.">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li><li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier.">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer.">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li><li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents.">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים שום עניין מתחרות.

אלקטרופורציה משפר את חדירות קרום התא, טכנולוגיה רבת עוצמה עבור ג'ין electrotransfer16. המסירה הגן לתוך החיים מכרסמים מאת אלקטרופורציה שימש לעתים קרובות נוירוביולוגיה שדות17,18,19,20,21. שלה יישומים א?...

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יש משחק תפקיד חיוני בהרחבת הידע שלנו על בעלי חיים, ג'ין פונקציות ויווופיתוח מנגנוני המחלה התקדמות1,2. Germline GEMMs מפותחים באופן מסורתי בשתי דרכים. הראשונה היא היצירה של העכברים הטרנסגניים בזריקה pronuclear של הדנ א פלסמיד ואחריו את השתלת של מופרות לתוך נקבות pseudopregnant. השני הוא הדור של עכברים טוק-אאוט/טוק-in על-ידי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים לבין התפתחות כימרות. נוקאאוט מותנה של גנים ספציפיים ברקמות או תא סוג עניין כרוך הרבייה של אללים מהונדסים עם Cre ואתרים flox דורות מרובים. כל התהליך יכול להיות יקר ולא זמן רב, במיוחד אם המטרה היא היעד גנים מרובים רקמות-במיוחד. לאחרונה, עריכת ג'ין טכנולוגיות כגון באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) הוחלו על מספר איברים של העכברים לזירוז רקמות ספציפיות שינויים גנטיים לסרטן autochthonous מידול3, 4,5,6,7 או מוטציות המחלה הנכונה בחיי עיר8,9. במחקרים אלה, המסירה של הווקטורים gRNA הושג בדרך כלל דרך זיהום adenoviral או lentiviral של האיבר או הזרקת וריד הזנב hydrodynamic. הקלות היחסית משלוח של הרכיבים CRISPR ריאות ולכבד השתפרה במידה את הנוחות והיעילות של סרטן מידול באיברים אלה לעומת הדגמים העכבר Cre-לקס המבוסס מסורתית.
Urothelium שלפוחית השתן היא איפה שמקורן רוב גידולים בשלפוחית השתן. המשלוח של ה-DNA וקטורים שלפוחית השתן urothelium לטיפול דוגמנות או ג'ין סרטן היא הקשו על ידי שכבה גליקוזאמינוגליקן על פני השטח urothelial הפסגה, אשר משמש כמחסום ב"זכות של הווירוסים זיהומיות10,11. מספר סוכנים pretreatment כגון Syn3 ו- dodecyl-β-d-maltoside שימשו כדי לשבש את מחסום זה ולשפר אדנו זיהום יעילות12,13,14. אם adeno-הקשורים וירוסים (AAVs) יכול להדביק ביעילות שלפוחית השתן לא דווחה. בסך הכל, שיטת משלוח מבוסס נגיפי יהיה רצוי. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדה למסירה יעיל דנ א פלסמיד urothelium העכבר דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. כי הגישה שלנו אינו כרוך רעלני כימי של השכבה גליקוזאמינוגליקן או וירוס הייצור, שזה משמעותי מפשט את המסירה של ה-DNA פלסמידים לתוך urothelium שלפוחית השתן העכבר, צריך להקל על מחקרים שונים אין ויוו מחלות שלפוחית השתן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD 1mL TB Syringe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>148232E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9275-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-841-21</td>
			<td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Vet one</td>
			<td>501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K&#38;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Cover the heat mat with paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0849514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH7.4</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet tips 200 &#181;L</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-0206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &#181;L</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02707438(CS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN NEO P2</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPETMAN NEO P200N</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid CAG-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>16664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum tweezertrode 5 mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450489</td>
			<td>5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instr</td>
			<td>RS-5880</td>
			<td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>String cord</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape, Scotch</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19047257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td>
			<td>PBS animal health</td>
			<td>353-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-1 Table top system anesthesia</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl violet suture 18&#34; FS-2 cutting 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0578475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td>
			<td>Walgreens</td>
			<td>953982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>018045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>01804</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יקרים מאוד בגילוי הרומן ביולוגי תובנות החניכה, התקדמות מנגנוני מחלות אנושיות כגון סרטן. העכברים הטרנסגניים, מותנה נוקאאוט שימשו לעיתים קרובות ביטוי גנים או אבלציה רקמות ספציפיות או תא סוגי בתוך vivo. עם זאת, יצירת מודלים העכבר germline יכול להיות זמן רב ויקרות. הפיתוחים האחרונים בתחום הגן עריכה טכנולוגיות ואת הכדאיות של אספקת פלסמידים DNA על ידי זיהום ויראלי אפשרו דור מהירה של הלא-germline autochthonous העכבר סרטן מודלים עבור מספר איברים. שלפוחית השתן הוא איבר זה היה קשה עבור וקטורים ויראלית לגשת, בשל נוכחותם של שכבה גליקוזאמינוגליקן המכסים את urothelium. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדת לאספקה יעילה של ה-DNA פלסמידים לתוך העכבר שלפוחית השתן urothelium vivo בתוך. דרך intravesical החדרה של pCAG-GFP דנ א פלסמיד אלקטרופורציה השלפוחית בניתוח חשוף, אנו מראים כי פלסמיד דנ א יכולה להיות מועברת במיוחד לתוך התאים urothelial שלפוחית השתן לביטוי ארעית. השיטה שלנו מספק דרך נוחה ומהירה ביטוי נוקאאוט של גנים בשלפוחית עכבר, ניתן להחיל על בניין GEMMs של סרטן שלפוחית השתן ומחלות אורולוגיים אחרים.

כדי להדגים את ההצלחה של המסירה הגן לתוך urothelium שלפוחית השתן, השתמשנו על פלסמיד15 pCAG-GFP עבור אלקטרופורציה. 20 µL של פלסמיד Trypan Blue פתרון הוזרק דרך השופכה, נוהלו 5 פולסים חשמליים. לאחר 48 שעות, אנחנו גזור העכבר שלפוחית השתן ולא נצפתה כתמים של קרינה פלואורסצנטית GFP תחת מ...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation at JoVE.com

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

novel-method-plasmid-dna-delivery-to-mouse-bladder-urothelium

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  University of California, Santa Cruz. אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

Video: Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial ...

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high purity DNA. Based on multi-well filtration for bacterial lysate clearance and DNA purification, this method creates a streamlined process for plasmid preparation. Filter plates containing silica-based media can easily be processed by vacuum filtration or centrifuge to yield appreciable quantities of plasmid DNA. Quantitative analyses determine the purified plasmid DNA is consistently of high quality with average OD260/280 ratios of 1.97. Overall, plasmid yields offer more pure DNA for downstream applications, such as sequencing and cloning. This streamlined method of using AcroPrep Advance Filter Plates allows for manual, semi-automated or fully-automated processing.

This protocol is a cost effective alternative for efficient parallel clarification and plasmid DNA purification from E. coli cultures. The AcroPrep Advance process starts with an optimized lysate clarification filter plate followed by purification on a high binding capacity DNA binding filter plate.

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

We describe the complete process of AcroPrep Advance Filter Plates for 96 plasmid preparations, starting from prokaryotic culture and ending with high ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

גדיל DNA עקירת עיר רשתות תגובת השרשת כימית המופק מפלסמיד

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

טיהור פלסמיד דנ"א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit