אנו מודים יעקב הרבה על הערות מועילות והצעות שלו. אנו מודים גם אן דה יונג לעזרתו בניתוח ביואינפורמטיקה. Yanglei יי ו- Zhibo Li נתמכים על ידי מועצת מלגות סין (CSC). אנו מודים Back2Roots תכנית בתחרות-TTW Perspectief (TKI-AF-15510) לתמיכה הפיננסית שלהם OPK.

1. הנבטת תפוחי אדמה בתנאים מעוקר
<ol><li>יש לשטוף את פני השטח של תפוחי אדמה עם מים סטריליים. לטבול את תפוחי האדמה ב-70% אתנול, ולאחר מכן ב 3% נתרן תת-כלורי, למשך 5 דקות. לשטוף את זה שוב עם מים סטריליים כדי להסיר כל נתרן הנותרים תת-כלורי.</li>
	<li>להכין את החומרים הדרושים הנבטת וגדל פקעות תפוחי אדמה; לחטא את הסירים פלסטיק, engraftment סלים, ורמיקוליט, ומים על ידי autoclaving אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: ודא כל החומרים המשמשים autoclavable. אחרת, השתמש בשיטות אחרות לחיטוי.</li>
	<li>מכניסים את תפוחי האדמה לעקר השטח הסל engraftment, המקום הזה סיר בלוק המכיל ורמיקוליט רטוב.</li>
	<li>לשמור את הסיר בתוך תא האקלים ב 24 מעלות צלזיוס במשך שלושה שבועות. להגדיר אותו על מחזורים של 16 שעות של אור (120 µmol ז-2s-1) ו- 8 שעות החושך. כדי להימנע מציג מיקרוביאלי, להשתמש בתיבת סיבי זכוכית גדול כדי לכסות את הסיר.</li>
</ol>2. איסוף תפוחי אדמה שחורה Exudates
<ol><li>כאשר נצרי נבט, העברת הסל עם תפוחי אדמה שלם לתוך גביע סטיריליים מלא 150 מ ל מים יונים בלוק, עם תפוחי אדמה פקעות ממוקמים מעל פני המים ואת השורשים שקוע במים (ראה איור 1). לשמור שתיל בתא האקלים, להשתמש באותן הגדרות כמו קודם [24 ° C; מחזורי h 16 אור (120 µmol ז-2s-1), 8 שעות החושך].</li>
	<li>ביום השני על, איסוף של מים המכילים את exudates, למלא את. הספל עם מים יונים סטרילי. לבצע הדגימה כל יום עד יום השביעי לאחר העברת שתיל.</li>
	<li>לאחסן כל מדגם בנפרד ב 4 º C. עבור כל דגימה, להפיץ µL 100-לוריא-Bertani (ליברות; 1% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 0.5% NaCl) צלחת אגר כדי לבדוק אם מציג מיקרוביאלי. למחוק את הדגימות מזוהמים.</li>
	<li>לשלב את הדגימות שנאספו של שתיל אחד, לרכז אותם על ידי ליופיליזציה אותם ב-40 ° C עד נפח סופי של 150 מ.</li>
</ol>3. גידול חיידקים
<ol><li>פסים זן mycoides דרב מ-80 מעלות צלזיוס גליצרול מניה על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה את הצלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לחסן בינוני נוזלי ליברות עם מושבה בודדת מהצלחת ולהגדיל את התרבות ב חממה חזק ב rpm 200 בן לילה ב 30 º C.</li>
</ol>4. טיפול ודגימה של חיידקים
<ol><li>כדי להשוות בין עקומת גידול של חיידקים שטופלו exudates שורש לפקד שלילי, מכינים סדרת מבחנות המכילות 50 מ של המדיום הנוזלי ליברות. להוסיף 0.5 מ"ל של התרבות חיידקי לילה כל צלוחיות, ולהוסיף או 0%, 5%, 10%, 15% (v/v) שורש תפליט או במים סטריליים יונים המדיום, בהתאמה.</li>
	<li>להשתמש תרבות עם מים יונים במקום exudates שורש פקד. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) כל h 1 לאחר מכן. יוצרות עקומת גדילה ידי הערכים600 OD נגד הזמן. הערה: ראינו כי 10% exudates הבסיס לא השפיע על צמיחת mycoides דרב (ראה איור 2); יחס זה שימש לניסויים RNA-seq.</li>
	<li>לדלל תרבות mycoides דרב לילה עם 90 מיליליטר מראש ומחוממת LB בינוניים עד ה OD הראשונית600 של ~ 0.05 בבקבוקון 300 מ ל. להוסיף 10 מ של exudates הבסיס לתרבות, דגירה זה ב 30 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>להשתמש טיפול במים סטריליים יונים 10 מ"ל פקד. איסוף תאים מתרבות על ידי צנטריפוגה ב g x 9,000 למשך 2 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, מיד להקפיא בגדר של חנקן נוזלי ואז לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>5. RNA בידוד
הערה: לפני שמתחילים את הבידוד, להכין עבודה, שעליו מונחים, ארונות תקשורת, פיפטות על-ידי ניקוי אותם עם פתרון טיהור RNase (ראה טבלה של חומרים). ללבוש כפפות בכל עת, ודא כי כל צינורות, עצות ופתרונות הם נטולי RNase. תמיד לשמור את הדוגמאות על קרח במידת האפשר.
<ol><li>להוסיף מים הנדסה גנטית (100 µL של DEPC לכל פתרון 100 מ ל) מ- 0.1% (v/v) diethyl pyrocarbonate (DEPC), מערבבים אותו היטב, ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אוטוקלב התערובת כדי להשבית את DEPC לאחר טיפול לילה. שימוש זה שטופלו DEPC מים הנדסה גנטית כדי להכין המאגר טה [10 מ מ טריס-HCl (pH = 8); 1 מ"מ EDTA] ו 10% הפתרון מרחביות (w/v).</li>
	<li>להפשיר את כדורי תא על הקרח, להשעות את כל µL 400 מאגר TE (DEPC). להעביר את המתלים לתוך צינורות פקקי בורג 2 מ"ל.</li>
	<li>Premix µL 300 באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1 v/v) ו- 300 µL של פנול (חומצה פנול, כיתה ה-RNA), ולאפשר את התערובת לעמוד במשך 5 דקות. קח µL 500 השלב העליון אורגני כדי להוסיף התאים resuspended. לאחר מכן להוסיף 50 µL למען חברה דמוקרטית 10% וכ -0.5 גר' חרוזי זכוכית (0.5 מיקרומטר) לתוך הצינור.</li>
	<li>לסגור את הפקק בחוזקה ולמקם את הצינורית מהמגן חרוז-מיל (ראה טבלה של חומרים). ביצוע של s 3 × 45 הדופק המגון עם מרווח 1 דקות על קרח.</li>
	<li>Centrifuge את הדגימות 10 דקות ב 11,000 x g (4 ° C), ולהעביר את השלב העליון צינור חדש.</li>
	<li>להוסיף 500 µL באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1) השלב העליון מ שלב 5.5, centrifuge את התערובת למשך 5 דקות ב x 11,000 g (4 ° C). הערה: השלבים הבאים ששונו של הוראת היצרן מסחרי זכוכית סיבים מבוסס מסנן ה-RNA בידוד קיט (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>µL 500 השלב העליון להעביר צינור טריים, להוסיף 2 כרכים (1 מ"ל) של מאגר פירוק/איגוד ולערבב אותו על-ידי pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>לשלב את הצינורות מסנן ואוסף (מתוך ערכת בידוד ה-RNA), pipette את התערובת מהשלב 5.7 הצינור מסנן. Centrifuge צינורות 15 s ב- 8,000-g ולהשליך הזרימה דרך.</li>
	<li>להכין 1.5 mL microcentrifuge צינורות עם µL 100 DNase מאגר, 10 µL של DNase ואני µL 5 של מעכב RNase (ראה טבלה של חומרים). הוסף את התמהיל פתרון מוכן מסנן של הצינור מסנן, דגירה זה למשך 20-30 דקות ב- 15-25 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בצע את השלבים כביסה לפי הוראות היצרן. השתמש µL 50 של מאגר • תנאי כדי elute את הרנ א.</li>
	<li>להציל את הרנ א eluted ב-80 מעלות צלזיוס, לשים סרט פרפין פלסטיק מסביבו. במקביל, להעביר כמה microliters של המדגם צינור microcentrifuge 1.5 mL לבצע בדיקת איכות '.</li>
</ol>6. בדיקת האיכות RNA ורצף
<ol><li>בררו את הרנ א ספקטרופוטומטרים microvolume. הערה: ספיגת יחס-260/280 צריך להיות מעל 1.8, יחסי-260/230 צריך להיות מעל 1.8 לפחות, רצוי מעל 2.0.</li>
	<li>הפעל הרנ א מטוהרים בכלי נגינה אלקטרופורזה אוטומטית באמצעות הניתוח RNA להמליץ קיט (ראה טבלה של חומרים); המספר שלמות RNA (RIN) חייב להיות לפחות מעל 7 כדי להמשיך.</li>
	<li>שימוש בסכום כולל של µg 3 של RNA לדגימה ליצירת ספריות עם הכנה ספריה RNA-Seq קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות ההמלצות של היצרן. הערה: ההכנות הספרייה היו וסודרו על פלטפורמה רצף תפוקה גבוהה, קריאות לזווג-end נוצרו.</li>
</ol>7. נתוני ניתוח באמצעות צינור מבוסס-אינטרנט של T-REx
<ol><li>ביצוע איכות סינון באמצעות FASTX-ערכת הכלים גירסה 0.0.13 (Phred איכות עשרות > 20). חתוך את קריאות RNA-Seq raw של הרצפים מתאם עם הכלי Trimmomatic. הערה: כל הבדיקות במורד הזרם התבססו על נתונים נקי עם איכות גבוהה.</li>
	<li>הורדת הנתונים הגנום של בקרת האוויר 6462 NCBI mycoides דרב (ההצטרפות NCBI מס: CP009692.1) ולהשתמש בו בתור גנום הפניה למיפוי את קריאות נקי באמצעות Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>שימוש v0.6.1 HTSeq לספור את המספרים קריאות למפות כל הגן, הקריאות לכל kilobase של התעתיק לפי קריאות ממופה מיליון (RPKM) של כל הגנים המבוססת על האורך של הרוזן ג'ין וקורא שמופו אל הגן הזה.</li>
	<li>לניתוח של הנתונים על-ידי הצבר. טי-רקס, היעזר בטבלה RPKM קלט, וכן שלושה קבצים תיאורי: (i) קובץ גורמים כדי לתאר את הניסוי גורמים, (ii) קובץ ניגודים להגדיר אילו גורמים יושוו על ביטוי גנים דיפרנציאלית , וכן (iii) קובץ בכיתה לתיאור קבוצות של גנים של עניין. הערה: קבצי תיאורית נמצאים בתבנית in.txt. דוגמאות ניתן למצוא באתר האינטרנט של טי-רקס (http://genome2d.molgenrug.nl/). הוראה מפורטת לניתוח נתונים באמצעות T-REx ניתן למצוא בפרסום הקודם על ידי דה יונג. et al. 14.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haichar, F. e. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure.">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li><li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+root+exudates.">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li><li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+exudation:+the+ecological+driver+of+hydrocarbon+rhizoremediation.">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).</li><li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions.">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li><li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates.">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).</li><li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+(Zea+mays+L.)+root+exudates+and+their+impact+on+14C-pyrene+mineralization.">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li><li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs.">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li><li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+organic+acid+exudates+and+properties+of+rhizosphere+soils+of+white+spruce+(Picea+glauca)+and+subalpine+fir+(Abies+lasiocarpa).">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li><li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizosphere+carbon+flow+in+trees,+in+comparison+with+annual+plants:+the+importance+of+root+exudation+and+its+impact+on+microbial+activity+and+nutrient+availability.">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li><li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+root+exudates.">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li><li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+systemic+resistance+in+sugar+beet+elicited+by+a+non-pathogenic,+phyllosphere-colonizing+Bacillus+mycoides,+biological+control+agent.">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li><li>Peng, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+cucumber+Pythium+damping-off+pathogen+with+zoosporicidal+biosurfactants+produced+by+Bacillus+mycoides.">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li><li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazotrophic+bacilli+isolated+from+the+sunflower+rhizosphere+and+the+potential+of+Bacillus+mycoides+B38V+as+biofertiliser.">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li><li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-REx:+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data.">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).</li><li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates.">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).</li><li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNASwift:+a+rapid,+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform.">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li><li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-samtools:+Ruby+bindings+for+SAMtools,+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments.">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li><li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGS-trex:+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer.">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

אינטראקציות צמח-חיידק יש כבר שיערו להיקבע על-ידי שיווי משקל משומנת בין חיידקים וצמחים. אינטראקציות כאלה הם מורכבים מאוד, קשה ללמוד במערכת טבעית, אשר כוללת מגוון מינים מיקרוביאלי, כגורם העלול קונסורציומים. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוטה ללמוד את חיידקי בתגובה שורש exudates בתנאים מבוקרים היטב. הפ...

צמחים מאי תפליט עד 20% של פחמן קבוע בעת ההטמעה דרך השורשים של rhizosphere1, כלומר, אזור צר של אדמה בקרבת השורשים. בשל הזמינות מזין גבוה, rhizosphere הוא גידול מתאימים עבור מיקרואורגניזמים מגוונים, כולל צמחים-צמיחה קידום חיידקים. Exudates שורש להכיל מגוון של חומרים אורגניים נדיפים כמו יונים, חומצות אנאורגניות, חמצן ומים. עם זאת, הרוב המכריע של exudates הבסיס נוצר על ידי חומרים אורגניים, אשר ניתן לחלק תרכובות משקל מולקולרי נמוך, משקל מולקולרי גבוה תרכובות. תרכובות משקל מולקולרי נמוך כולל חומצות אמינו, חומצות אורגניות, סוכרים, תרכובות בעל תאים פנוליים, חומצות שומן, ושורה של מטבוליטים משניים. תרכובות משקל מולקולרי גבוה מורכב2,mucilage, חלבונים3. Rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשתמש בחלק תרכובות אלו כמקור אנרגיה לצמיחה ופיתוח. Exudates שורש תפקיד חשוב בעיצוב הקהילה rhizobacterial מאז המיוצר במפעל תרכובות של exudates יכולים להשפיע על ההתנהגות של חיידקים rhizosphere-הקשורים על ידי המשפיעים על הביטוי של גנים ספציפיים.
הבנת התגובה חיידקי השורש exudates היא צעד המפתח בפענוח מנגנוני אינטראקציה צמח-חיידק. כמו התגובה חיידקי אינטראקציות צמח-חיידק הוא התוצר של ביטוי גנים דיפרנציאלית, זה ניתן יהיה ללמוד על ידי ניתוח transcriptome. באמצעות שיטה זו, מחקרים קודמים זיהו מספר חשוב גנים המעורבים באינטראקציה צמח-חיידק. ב- Pseudomonas aeruginosa, גנים המעורבים חילוף החומרים, כימוטקסיס וסוג II הפרשת הוצגו להגיב exudates שורש סלק סוכר4. מאוורר ואח. 5 חקר את פרופיל transcriptomic של amyloliquefaciens נולד ב- FZB42 בתגובה exudates שורש תירס. התוצאות שלהם מראים כי של גנים חריפה הנגרמת על ידי exudates השורש, מספר קבוצות מעורבים מסלולים מטבוליים הנוגעים ניצול מזין, כימוטקסיס, תנועתיות ו- 30s ריבוזומלי סינתזה של פפטידים מיקרוביאלית ו- polyketides.
הדיוק של מחקרים אלה מסתמך על האוסף של השורש exudates. למרות מספר שיטות תיארו את האוסף של שורש exudates למטרות שונות, הם דורשים מכשירים מתוחכמים או לא יבוצעו ב תנאים מבוקרים היטב-6,-7,-8. יתר על כן, עיכוב rhizosphere מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע על שורש תפליט הרכב על ידי המשפיעים על חדירות קרום התא צמח ופגיעה ברקמות שורש, במיוחד במקרה של קונסורציומים של מיקרואורגניזמים9. כאשר חוקרים התגובה מיקרוביאלי שורש exudates, חשוב להשתמש בתנאים מוגדרים היטב על מנת למנוע שינוי של תרכובות על-ידי מיקרואורגניזמים10. יתר על כן, ה-RNA באיכות גבוהה נדרש עבור ה-RNA-seq המבוסס על מחקרים transcriptome. עם זאת, בעת התמודדות עם זנים שאינם-מודל-בקטריאלי, פרוטוקולים סטנדרטיים או קיטים מסחריים יש בדרך כלל של יעילות נמוכה עקב גורמים לא ידועים או מאפייני צמיחה מיוחד.
הפרוטוקול המתואר כאן אומתה באמצעות mycoides דרב, אשר הוא חיידק גראם חיובי, יוצרי ספורה של שלקרוא Firmicute. . זה נמצא בכל מקום, rhizosphere של מיני צמחים שונים. גידול צמח מספר מאפיינים קידום דווחו על מין זה, לרבות אינדוקציה ההתנגדות שיטתית (ISR) סלק סוכר11, עיכוב של המתלים-off המחלה Pythium מלפפון12, כמו גם חנקן קיבוע חמניות rhizosphere13. עם זאת, המנגנון המולקולרי של ביחסיו עם צמח המארח לא טוב נלמדים.
המטרה של הניסויים המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere דרב mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. בקיצור, הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: ראשית, לאסוף תפוחי אדמה exudates שורש בתנאים סטריליים. לאחר מכן, לחלץ RNA באיכות גבוהה מתאים חיידקיים שטופלו exudates השורש. השלב הסופי הוא ניתוח נתונים תוך שימוש באינטרנט T-REx צינור14. פרוטוקול זה שימש לזיהוי גנים mycoides דרב הצג את משמרת ברמות הביטוי בעת מגע עם שורש-exudates, ובכך עלול לשחק תפקיד חשוב ב אינטראקציות צמח-חיידק.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">&#160;CAS: 7681-52-9&#160;</td>
			<td style="width:339px;">10-15%&#160; active chlorine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">incubater</td>
			<td style="width:236px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Innova 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Genesys 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">liquid nitrogen</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">glass beads</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">G8893</td>
			<td>0.5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">2.0 ml tube with screw cap</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead mill homogenizer</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td style="width:152px;">607</td>
			<td>Mini_beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">centrifuge</td>
			<td style="width:236px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:152px;">5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 151-21-3&#160;</td>
			<td>10% solution prepared with DEPC treated MQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">TE buffer</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">chloroform-isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High pure RNA isolation kit</td>
			<td style="width:236px;">Roche</td>
			<td style="width:152px;">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:236px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">AM9780</td>
			<td>RNase-Zap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Automated electrophoresis instrument</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">2100</td>
			<td>Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNA quality analysis kit</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">RNA 6000 Nano kit&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase inhibitor</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">RiboLock</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Directional RNA library Prep kit</td>
			<td style="width:236px;">NEB</td>
			<td style="width:152px;">Ultra</td>
			<td style="width:339px;">For Illumina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant-microbe interaction: transcriptional response of bacillus mycoides to potato root exudates

הבקטריה צמח-הקשורים לשחק תפקיד חשוב בקידום הצמיחה ולמניעת מחלות בצמחים. היישום של הצמח הצמיחה וקידום rhizobacteria (PGPR) כסוכני biofertilizers או משולבת הפך חלופה יעילה לשימוש בדשנים קונבנציונלי ו יכולים להגביר את הפרודוקטיביות חיתוך במחיר נמוך. אינטראקציות צמח-חיידק תלויים אותות מופרש הצמח הפונדקאי ואת תגובת לכאן בזמן שנסעתי על ידי חיידקים הקשורים שלהם. עם זאת, המנגנון המולקולרי של חיידקים מועילים כיצד להגיב שלהם הקשורים הצמחי אותות אינם מובנים במלואם. הערכת התגובה transcriptomic של חיידקים השורש exudates היא גישה רב-עוצמה כדי לקבוע את ביטוי גנים חיידקיים ורגולציה בתנאים rhizospheric. ידע כזה יש צורך להבין את המנגנונים שבבסיס מעורב אינטראקציות צמח-חיידק. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ללמוד את התגובה transcriptomic של mycoides נולד ב- EC18, זן מבודד את endosphere תפוחי אדמה, כדי exudates שורש תפוח אדמה. בעזרת הטכנולוגיה תפוקה גבוהה רצף האחרונות, פרוטוקול זה יכול להתבצע תוך מספר שבועות, התוצרת datasets מסיבית. ראשית, אנו אוספים את exudates שורש בתנאים סטריליים, לאחר מכן הם מתווספים mycoides דרב תרבויות. הרנ א מהתרביות האלה היא מבודדת באמצעות שיטה פנול/כלורופורם בשילוב עם ערכת מסחרי ונחשפו בקרת איכות על ידי כלי נגינה אוטומטיות אלקטרופורזה. לאחר רצף, ניתוח נתונים מתבצע באמצעות הצינור T-REx מבוססת-אינטרנט, קבוצה של גנים ביטוי באופן שונה מזוהה. שיטה זו היא כלי שימושי כדי להקל על תגליות חדשות על גנים חיידקיים מעורב אינטראקציות צמח-חיידק.

צמח-הקשורים מיקרואורגניזמים יכולים להשפיע באופן חיובי על צימוח ובריאות. עם זאת, המנגנון של אינטראקציות מורכבות בין צמחים שלהם אנחנו חיים איתם בסמביוזה חיידקים הם אינה מובנת במלואה. שורש exudates יש תפקיד חשוב בוויסות פעילות rhizobacterial של התנהגות, זה בדרך כלל הוא שמהווה הקולוני...

Watch this Scientific Journal Video about Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates at JoVE.com

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

12.4K Views.  University of Groningen. המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

Video: Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

CRISPR וקטור בינוי אפיון תפוקה גבוהה של שינויי DNA על ידי דור של שורשי עגבניות שעירים

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...