ありがとうヤコブ ベールを脱いだ彼の有用なコメントや提案。また、アン de Jong はバイオインフォマティクス解析に彼の助けに感謝我々。Yanglei 李 Zhibo Li によって中国奨学金委員会 (CSC) をサポートしています。私たちは NWO TTW Perspectief プログラム Back2Roots に感謝 (TKI-AF-15510) OPK を金融支援。

1. 滅菌条件でジャガイモの発芽
<ol><li>滅菌水とジャガイモの表面を洗い流してください。ジャガイモの 70% のエタノールで、3% ナトリウム次亜塩素酸、5 分間の入浴します。あらゆる残りのナトリウム次亜塩素酸を削除する滅菌水でもう一度すすぎます。</li>
	<li>種子の発芽と成長するジャガイモ塊茎; に必要な材料を準備します。プラスチックの鉢は、生着バスケット、バーミキュ ライトを殺菌し、20 分 121 ° C のオートクレーブによる水します。 注: は、オートクレーブを使用されるすべての材料にされますを確認します。そうでなければ、他の殺菌方法を使用します。</li>
	<li>生着バスケットに表面殺菌したジャガイモを入れて、湿バーミキュ ライトを入れたオートクレーブ ポットでこれを置きます。</li>
	<li>3 週間気候室 24 の ° c のポットを維持します。16 h (120 µmol m-2の-1) 光と闇の 8 h の周期に設定します。微生物汚染を避けるためには、するのにには、鍋をカバーするのに大きいガラス繊維のボックスを使用します。</li>
</ol>2. ジャガイモ根分泌物の収集
<ol><li>ジャガイモの塊茎が水の表面や根のすぐ上に配置が水に沈めて芽スプラウト、転送滅菌ビーカーに全体のポテトのバスケットのオートクレーブ脱イオン水 150 mL でいっぱいになる、(図 1参照)。気候室で苗し同じ設定を前に [24 ° C; 光 (120 µmol m-2の-1)、闇の 8 h の 16 h のサイクル] を使用します。</li>
	<li>2 日目から、分泌物を含む水を収集し、無菌純水でビーカーを補充します。サンプリングを実行毎日苗を転送した後 7 日目まで。</li>
	<li>4 ° C で個別に各サンプルを保存します。各サンプルの広がるルリア ベルターニカミラに 100 μ L (LB; 1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、0.5 %nacl) 寒天培地微生物汚染をチェックします。汚染されたサンプルを破棄します。</li>
	<li>1 つの苗の収集のサンプルを組み合わせて、-40 ° C ~ 150 mL の最終巻でそれらを凍結乾燥によってそれらを集中します。</li>
</ol>3. 成長する細菌
<ol><li>LB 寒天培地プレート、-80 ° C のグリセロール ストックからB. mycoidesひずみを連勝し、30 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>板から単一コロニーの LB 液体培地に接種し、30 ° C で一晩 200 rpm で揺れのインキュベーターで培養を成長</li>
</ol>4. 治療と細菌のサンプリング
<ol><li>ネガティブ コントロールに根分泌物と扱われる細菌の成長曲線を比較するには、LB 液体培地 50 mL 含むフラスコのシリーズを準備します。すべてのフラスコに一晩培養 0.5 mL を追加し、0%、5%、10%、15% (v/v) 根滲出液または滅菌脱イオン水を媒体にそれぞれ追加します。</li>
	<li>コントロールとして、根分泌物ではなく脱イオン水でカルチャを使用します。600 の光学濃度を測定 nm (外径600) ごとの 1 時間後。外径600値対時間をプロットして成長曲線を生成します。 注: 根分泌物の 10% がB. mycoidesの成長に影響を及ぼさないとしました (図 2を参照)。この比率は、RNA シーケンス実験に使われました。</li>
	<li>90 mL の初期外径600に予め温めておいた LB 培地で一晩B. mycoides文化を希薄化 〜 0.05 300 mL のフラスコの中。文化に根分泌物の 10 mL を追加し、30 ° c 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 mL の脱イオン水を無菌治療をコントロールとして使用します。文化から 4 ° C で 2 分間 9,000 × g で遠心分離によって細胞を収集します。、上澄みを廃棄し、すぐにペレットを液体窒素で凍結、使用するまで-80 ° C で保存します。</li>
</ol>5. RNA の隔離
メモ: 分離を開始する前に準備ワークベンチ、ラック、ピペット、RNase 除染液でそれらを洗浄によって (材料の表を参照してください)。すべての時間の手袋を着用し、すべての管、ヒント、およびソリューションは、RNase フリーかどうかを確認します。常に氷が可能なサンプルを保ちます。
<ol><li>純水 (100 μ L の DEPC あたり 100 mL の溶液) にピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) の 0.1% (v/v) を追加、それを混ぜるし、室温で一晩を維持します。オートクレーブ一晩治療後、DEPC を不活性化する混合物。この DEPC 処理した純水を使用して TE バッファーを準備 [10 mM トリス-HCl (pH = 8) 1 mm EDTA] と 10 %sds (w/v) ソリューション。</li>
	<li>氷の上細胞ペレットを解凍し、各テ (DEPC) バッファーの 400 μ L を中断します。2 mL スクリュー キャップ チューブに懸濁液を転送します。</li>
	<li>プレミックス 300 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1 v/v) とフェノール (フェノール酸、RNA 勾配) 300 μ L、5 分のために立つ混合物を許可します。再懸濁細胞に加える有機上部段階の 500 μ L を取る。チューブに 50 μ L の 10 %sds とガラスビーズ (0.5 μ m) の 0.5 g を加えます。</li>
	<li>キャップをしっかりと閉めて、ビーズミル ホモジナイザーにチューブを配置 (材料の表を参照してください)。氷で 1 分間隔で 3 × 45 のパルス均質化を実行します。</li>
	<li>11,000 x g (4 ° C) で 10 分間のサンプルを遠心し、新しい管へ転送の上部の段階。</li>
	<li>ステップ 5.5 から上部の段階にクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1) 500 μ L を追加し、11,000 x g (4 ° C) で 5 分間混合物を遠心分離機します。 注: 次の手順は、商業ガラス繊維フィルターを用いた RNA の隔離のメーカーの説明書から変更されたキット (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>新鮮な管に上部の段階の 500 μ L を転送換/結合バッファーの 2 つの容積 (1 mL) を追加し、上下にピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>フィルターおよびコレクション チューブ (からの RNA 抽出用キット) を組み合わせて、ピペットのフィルター チューブに 5.7 のステップからの混合物。15 のチューブを遠心分離機 x g と流れを破棄 8,000 で s。</li>
	<li>DNase バッファー、DNase の 10 μ L の 100 μ L で遠心チューブ 1.5 mL を準備・ RNase 阻害剤の 5 μ L (材料の表を参照してください)。フィルター チューブのフィルター上に調製した溶液のミックスを追加し、15-25 ° C で 20-30 分間インキュベート</li>
	<li>製造元の指示に従って洗濯の手順に従います。50 μ L の溶出バッファーを使用して、RNA を溶出します。</li>
	<li>-80 ° C で溶離された RNA を保存し、その周りにプラスチック パラフィン フィルムを置きます。同時に品質チェックを実行する 1.5 mL 遠心チューブにサンプルの数マイクロリットルを転送します。</li>
</ol>6. RNA の品質チェック ・ シーケンス
<ol><li>微量分光光度計に RNA を確認してください。 注: 260/280 吸光度比は 1.8、上はず、少なくとも 1.8、2.0 以上できれば上記 260/230 で比をはずです。</li>
	<li>実行お勧めします RNA 解析を用いた自動電気泳動装置で浄化された RNA キット (材料の表を参照してください)。RNA の整合性数 (鈴) は、続行する 7 の上以上でなければなりません。</li>
	<li>ライブラリにある、RNA シーケンスの準備とライブラリを生成する RNA のサンプルあたり 3 μ g の合計量を使用 (材料の表を参照) をキット製造元の推奨事項に従います。 注: ライブラリの準備された高スループット シーケンス プラットフォームでシーケンス処理し、ペアエンド リードが生成されました。</li>
</ol>7. データによる Web ベースのパイプラインの T-レックス
<ol><li>FASTX ツールキット バージョン 0.0.13 を使用してフィルタ リング品質を実行 (> 20 の Phred 品質スコア)。Trimmomatic ツール アダプター系列から生の RNA シーケンス読み取りをトリムします。 注: すべての下流解析は、高品質できれいなデータに基づいていた。</li>
	<li>B. mycoides ATCC 6462 NCBI ゲノム データベースをダウンロード (NCBI 加盟号: CP009692.1) と Bowtie2/2.2.3 を使用してきれいな読み取りをマッピングするための参照ゲノムとして使用します。</li>
	<li>使用 HTSeq v0.6.1 読み取り数字をカウントするのには各遺伝子にマップされ、この遺伝子に遺伝子と読み取りカウントの長さに基づいて百万マップされたリード (RPKM) の各遺伝子の転写産物のプラスミドあたりの読み取り数。</li>
	<li>T レックスのパイプラインによってデータの分析、3 つの説明的なファイルと同様に、入力として RPKM テーブルを使用: (i) 実験要因 (ii) 遺伝子発現要因を比較する対照ファイルを記述する要素ファイル、および (iii) 興味のある遺伝子のグループを記述するためのクラス ファイル。 注: 説明のファイル、in.txt 形式です。例は、T-レックス (http://genome2d.molgenrug.nl/) の web ページで見つけることができます。T-レックスを用いたデータ解析の詳細な指示された de Jongら前の文書14。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haichar, F. e. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure.">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li><li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+root+exudates.">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li><li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+exudation:+the+ecological+driver+of+hydrocarbon+rhizoremediation.">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).</li><li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions.">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li><li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates.">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).</li><li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+(Zea+mays+L.)+root+exudates+and+their+impact+on+14C-pyrene+mineralization.">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li><li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs.">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li><li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+organic+acid+exudates+and+properties+of+rhizosphere+soils+of+white+spruce+(Picea+glauca)+and+subalpine+fir+(Abies+lasiocarpa).">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li><li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizosphere+carbon+flow+in+trees,+in+comparison+with+annual+plants:+the+importance+of+root+exudation+and+its+impact+on+microbial+activity+and+nutrient+availability.">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li><li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+root+exudates.">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li><li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+systemic+resistance+in+sugar+beet+elicited+by+a+non-pathogenic,+phyllosphere-colonizing+Bacillus+mycoides,+biological+control+agent.">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li><li>Peng, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+cucumber+Pythium+damping-off+pathogen+with+zoosporicidal+biosurfactants+produced+by+Bacillus+mycoides.">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li><li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazotrophic+bacilli+isolated+from+the+sunflower+rhizosphere+and+the+potential+of+Bacillus+mycoides+B38V+as+biofertiliser.">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li><li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-REx:+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data.">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).</li><li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates.">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).</li><li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNASwift:+a+rapid,+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform.">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li><li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-samtools:+Ruby+bindings+for+SAMtools,+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments.">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li><li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGS-trex:+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer.">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).</li></ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

植物・微生物相互作用は、細菌と植物と細かく調整された平衡によって決定されるという仮説があります。このような相互作用は非常に複雑な勉強は難しい自然システムで構成されたコンソーシアムとして潜在的機能、多様な微生物種。本稿では、制御された条件下での根の分泌物に細菌の応答を研究する簡略化されたプロトコルについて説明します。根分泌物への露出に、根圏細菌のトラ?...

植物は根圏1,すなわち, 根に近い土の狭いゾーンに根を通して光合成中固定炭素の 20% まで滲出液を可能性があります。高い栄養アベイラビリティのため根は植物成長促進菌を含む、多様な微生物の適した生息地です。根の分泌物には、イオン、無機酸、酸素、水などの無機化合物の範囲が含まれています。ただし、根分泌物の大半は、低分子化合物と高分子量化合物に分けることができる有機材料によって形成されます。低分子量化合物には、アミノ酸、有機酸、糖、フェノール、脂肪酸、二次代謝産物の配列が含まれます。高分子量化合物は粘液と蛋白質の2,の3から成っています。根圏微生物は、成長と開発のため、エネルギー源としてこれらの化合物のいくつかを使用できます。根分泌物分泌物の製造工場化合物根関連細菌の挙動に影響を与える特定の遺伝子の発現に影響を与えるので rhizobacterial コミュニティの形成に重要な役割を再生します。
根分泌物に細菌の応答を理解することは、植物と微生物の相互作用メカニズムを解読の重要なステップです。植物・微生物相互作用への細菌の応答は差動遺伝子発現の製品、トランスクリプトーム解析によって学ぶことができます。このメソッドを使用して、以前の研究は、植物微生物相互作用に関与するいくつかの重要な遺伝子を特定しました。緑膿菌、新陳代謝、走化性、およびタイプ II の分泌に関与する遺伝子はテンサイ根分泌物4に対応する示されていた。ファンら。5はトウモロコシ根分泌物に対して用いて B FZB42 のトランスクリプトームのプロファイル.その結果を示すこと、強く根分泌物によって誘導される遺伝子のいくつかのグループ栄養使用率、走化性、運動性、および非リボソーム合成抗菌ペプチドとポリケチドに関連する代謝経路に関与しています。
これらの研究の精度は、根分泌物のコレクションに依存します。ただし、いくつかの方法は、異なる目的のため根分泌物のコレクションを説明した、洗練された楽器を要求または制御された条件6,7,8で実行されていません。また、根を阻害する微生物に影響を与えるルート滲出液組成植物細胞膜の透過性に影響を与える微生物9のコンソーシアムの場合は特に、根組織の損傷と。根分泌物に微生物の応答を調査するとき他の微生物10によって化合物の変質を避けるために明確に定義された条件を使用することが重要です。さらに、高品質の RNA が RNA シーケンス ベースのトランスクリプトーム研究必要です。しかし、非モデル細菌株を扱う場合、標準プロトコルまたは商業キット通常ある未知の要因または特別な成長プロパティによる低効率
ここで説明されているプロトコルは、Firmicute 門のグラム陽性、胞子形成菌であるB. mycoidesを用いて検証しました。様々 な植物の根圏におけるユビキタスです。いくつか植物成長促進プロパティは、テンサイ11、枯病菌Pythiumキュウリ12として窒素の抑制の組織的な抵抗 (ISR) の誘導を含め、この種の報告されています。ヒマワリ根13で固定。しかし、宿主植物との相互作用の分子メカニズムはよく研究されていません。
ここで示した実験の目的は、ジャガイモ根分泌物への免震 endosphere B. mycoidesのトランスクリプトーム応答を研究することです。一言で言えば、プロトコルは次の手順で構成されています: 最初に、無菌条件下でジャガイモ根分泌物を収集します。その後、根分泌物細菌細胞から高品質の RNA を抽出します。最後の手順は、web ベースの T-レックス パイプライン14を使用してデータ分析です。このプロトコルは、根分泌物との接触時に発現レベルにシフトして表示し、したがって植物微生物相互作用に重要な役割を果たす可能性があります* mycoides遺伝子を識別するために使用されました。

<table><tbody><tr><td>sodium hypochlorite</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;CAS: 7681-52-9&amp;nbsp;</td><td>10-15%&amp;nbsp; active chlorine</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubater</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beads</td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>2.0 ml tube with screw cap</td><td></td><td></td><td>RNase free</td></tr><tr><td>1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube</td><td></td><td></td><td>RNase free</td></tr><tr><td>Bead mill homogenizer</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&amp;nbsp;</td><td>10% solution prepared with DEPC treated MQ water</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>phenol</td><td>Sigma</td><td></td><td>RNA grade</td></tr><tr><td>chloroform-isoamyl alcohol&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature</td></tr><tr><td>High pure RNA isolation kit</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>RNase Decontamination Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap</td></tr><tr><td>Automated electrophoresis instrument</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Microvolume spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>RNA quality analysis kit</td><td>Agilent</td><td>RNA 6000 Nano kit&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Directional RNA library Prep kit</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>For Illumina</td></tr></tbody></table>

plant-microbe interaction: transcriptional response of bacillus mycoides to potato root exudates

プラント関連の有益な細菌は、成長を促進し、植物の病気を防止する重要な役割を果たします。生物肥料や防除剤として植物生育促進根圏細菌 (PGPR) のアプリケーションは従来の肥料の使用に効果的な代替となって、低コストで作物の生産性を高めることができます。植物・微生物相互作用はホスト植物分泌シグナルとここに至ってその関連細菌反応に依存します。しかし、どのように有益な細菌の分子機構は信号が完全に理解されていない、関連付けられている植物由来に応答します。根分泌物に細菌のトランスクリプトームの応答を評価する、細菌の遺伝子発現と根の条件の下で規制を決定する強力なアプローチです。そのような知識は、植物と微生物の相互作用に関与する基になるメカニズムを理解する必要です。本稿では、 B. mycoides EC18、ジャガイモの endosphere から分離されたジャガイモ根分泌物系統のトランスクリプトーム応答の研究に詳しいプロトコルについて説明します。最近の高スループット シーケンス技術の助けを借りて、いくつかの数週間、生産大規模なデータセットでこのプロトコルを実行できます。まず、 B. mycoides文化にその後追加された無菌条件下での根の分泌物を収集します。これらの文化からの RNA は、市販のキットと組み合わせるし、自動電気泳動装置による品質管理を受けるフェノール/クロロホルム メソッドを使用して分離されます。シーケンス処理の後 web ベースの T-レックス パイプラインでデータ解析が行われる、特異的発現遺伝子のグループが識別されます。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する細菌の遺伝子に新たな発見を容易にする便利なツールです。

プラント関連の微生物は、植物の成長と健康に積極的に影響します。しかし、植物と微生物の共生の間の複雑な相互作用のメカニズムは完全には理解されていません。根分泌物は rhizobacterial 活動と行動の調節に重要な役割を再生し、根分泌物に微生物の魅力と根の微生物のコロニー形成が開始されることを一般に仮定します。この作業の目的は、ジャガイモ根分泌物...

Watch this Scientific Journal Video about Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates at JoVE.com

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌 mycoidesのトランスクリプトーム応答を勉強することです。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する重要な細菌の遺伝子の識別を容易にしは、原則として他のエンドファイトと植物で、細かな調整に適用されます。

植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

12.5K ビュー.  University of Groningen. ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌 mycoidesのトランスクリプトーム応答を勉強することです。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する重要な細菌の遺伝子の識別を容易にしは、原則として他のエンドファイトと植物で、細かな調整に適用されます。

ビデオ: Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

環境学

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has been developed and applied for various plant species including Nicotiana benthamiana, tomato, Arabidopsis, cotton, and monocot plants such as wheat and maize. Here, we describe a detailed protocol using PVX-based VbMS vectors to silence endogenous miRNAs in potato. To knock down the expression of a specific miRNA, target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are designed, integrated into plant virus vectors, and expressed in potato by Agrobacterium infiltration to bind directly to the endogenous miRNA of interest and block its function.

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

We present a detailed protocol for potato virus X (PVX)-based microRNA silencing (VbMS) system to functionally characterize endogenous microRNAs (miRNAs) in potato. Target mimic (TM) molecules of miRNA of interest are integrated into the PVX vector and transiently expressed in potato to silence the target miRNA or miRNA family.

ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

植物の根に土壌媒介微生物を感染させる接種戦略

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

シロイヌナズナにおける根圏細菌コロニー形成の検出

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

著者スポットライト:微生物肥料効率を改善するための植物根の根茎形成の強化

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ<em&gt;シロイヌナズナシュードモナスシリン</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

免疫・感染学

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

生物工学

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

生物学

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。

植物の根に土壌媒介微生物を感染させる接種戦略

水耕栽培状態におけるシロイヌナズナの根の細菌コロニー形成の測定

水耕栽培状態におけるシロイヌナズナの根の細菌コロニー形成の測定

水耕栽培状態におけるシロイヌナズナの根の細菌コロニー形成の測定

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

要約

さらに動画を探す

この動画の章

アグロバクテリウムとサツマイモネコブセンチュウ-ジャガイモの変換を介したと GUS 染色によってスベリン遺伝子のプロモーター活性

ポテトウイルスXベースマイクロRNAサイレンシング(VbMS)ポテト中。

植物の根に土壌媒介微生物を感染させる接種戦略

水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

水耕栽培状態における シロイヌナズ ナの根の細菌コロニー形成の測定

使用した植物防御応答のファインキャラクタリゼーションのための細菌の葉浸潤アッセイ

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

水耕栽培状態におけるシロイヌナズナの根の細菌コロニー形成の測定

水耕栽培状態におけるシロイヌナズナの根の細菌コロニー形成の測定

水耕栽培状態におけるシロイヌナズナの根の細菌コロニー形成の測定