ありがとうヤコブ ベールを脱いだ彼の有用なコメントや提案。また、アン de Jong はバイオインフォマティクス解析に彼の助けに感謝我々。Yanglei 李 Zhibo Li によって中国奨学金委員会 (CSC) をサポートしています。私たちは NWO TTW Perspectief プログラム Back2Roots に感謝 (TKI-AF-15510) OPK を金融支援。

1. 滅菌条件でジャガイモの発芽
<ol><li>滅菌水とジャガイモの表面を洗い流してください。ジャガイモの 70% のエタノールで、3% ナトリウム次亜塩素酸、5 分間の入浴します。あらゆる残りのナトリウム次亜塩素酸を削除する滅菌水でもう一度すすぎます。</li>
	<li>種子の発芽と成長するジャガイモ塊茎; に必要な材料を準備します。プラスチックの鉢は、生着バスケット、バーミキュ ライトを殺菌し、20 分 121 ° C のオートクレーブによる水します。 注: は、オートクレーブを使用されるすべての材料にされますを確認します。そうでなければ、他の殺菌方法を使用します。</li>
	<li>生着バスケットに表面殺菌したジャガイモを入れて、湿バーミキュ ライトを入れたオートクレーブ ポットでこれを置きます。</li>
	<li>3 週間気候室 24 の ° c のポットを維持します。16 h (120 µmol m-2の-1) 光と闇の 8 h の周期に設定します。微生物汚染を避けるためには、するのにには、鍋をカバーするのに大きいガラス繊維のボックスを使用します。</li>
</ol>2. ジャガイモ根分泌物の収集
<ol><li>ジャガイモの塊茎が水の表面や根のすぐ上に配置が水に沈めて芽スプラウト、転送滅菌ビーカーに全体のポテトのバスケットのオートクレーブ脱イオン水 150 mL でいっぱいになる、(図 1参照)。気候室で苗し同じ設定を前に [24 ° C; 光 (120 µmol m-2の-1)、闇の 8 h の 16 h のサイクル] を使用します。</li>
	<li>2 日目から、分泌物を含む水を収集し、無菌純水でビーカーを補充します。サンプリングを実行毎日苗を転送した後 7 日目まで。</li>
	<li>4 ° C で個別に各サンプルを保存します。各サンプルの広がるルリア ベルターニカミラに 100 μ L (LB; 1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、0.5 %nacl) 寒天培地微生物汚染をチェックします。汚染されたサンプルを破棄します。</li>
	<li>1 つの苗の収集のサンプルを組み合わせて、-40 ° C ~ 150 mL の最終巻でそれらを凍結乾燥によってそれらを集中します。</li>
</ol>3. 成長する細菌
<ol><li>LB 寒天培地プレート、-80 ° C のグリセロール ストックからB. mycoidesひずみを連勝し、30 ° C でプレートを一晩インキュベートします。</li>
	<li>板から単一コロニーの LB 液体培地に接種し、30 ° C で一晩 200 rpm で揺れのインキュベーターで培養を成長</li>
</ol>4. 治療と細菌のサンプリング
<ol><li>ネガティブ コントロールに根分泌物と扱われる細菌の成長曲線を比較するには、LB 液体培地 50 mL 含むフラスコのシリーズを準備します。すべてのフラスコに一晩培養 0.5 mL を追加し、0%、5%、10%、15% (v/v) 根滲出液または滅菌脱イオン水を媒体にそれぞれ追加します。</li>
	<li>コントロールとして、根分泌物ではなく脱イオン水でカルチャを使用します。600 の光学濃度を測定 nm (外径600) ごとの 1 時間後。外径600値対時間をプロットして成長曲線を生成します。 注: 根分泌物の 10% がB. mycoidesの成長に影響を及ぼさないとしました (図 2を参照)。この比率は、RNA シーケンス実験に使われました。</li>
	<li>90 mL の初期外径600に予め温めておいた LB 培地で一晩B. mycoides文化を希薄化 〜 0.05 300 mL のフラスコの中。文化に根分泌物の 10 mL を追加し、30 ° c 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 mL の脱イオン水を無菌治療をコントロールとして使用します。文化から 4 ° C で 2 分間 9,000 × g で遠心分離によって細胞を収集します。、上澄みを廃棄し、すぐにペレットを液体窒素で凍結、使用するまで-80 ° C で保存します。</li>
</ol>5. RNA の隔離
メモ: 分離を開始する前に準備ワークベンチ、ラック、ピペット、RNase 除染液でそれらを洗浄によって (材料の表を参照してください)。すべての時間の手袋を着用し、すべての管、ヒント、およびソリューションは、RNase フリーかどうかを確認します。常に氷が可能なサンプルを保ちます。
<ol><li>純水 (100 μ L の DEPC あたり 100 mL の溶液) にピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) の 0.1% (v/v) を追加、それを混ぜるし、室温で一晩を維持します。オートクレーブ一晩治療後、DEPC を不活性化する混合物。この DEPC 処理した純水を使用して TE バッファーを準備 [10 mM トリス-HCl (pH = 8) 1 mm EDTA] と 10 %sds (w/v) ソリューション。</li>
	<li>氷の上細胞ペレットを解凍し、各テ (DEPC) バッファーの 400 μ L を中断します。2 mL スクリュー キャップ チューブに懸濁液を転送します。</li>
	<li>プレミックス 300 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1 v/v) とフェノール (フェノール酸、RNA 勾配) 300 μ L、5 分のために立つ混合物を許可します。再懸濁細胞に加える有機上部段階の 500 μ L を取る。チューブに 50 μ L の 10 %sds とガラスビーズ (0.5 μ m) の 0.5 g を加えます。</li>
	<li>キャップをしっかりと閉めて、ビーズミル ホモジナイザーにチューブを配置 (材料の表を参照してください)。氷で 1 分間隔で 3 × 45 のパルス均質化を実行します。</li>
	<li>11,000 x g (4 ° C) で 10 分間のサンプルを遠心し、新しい管へ転送の上部の段階。</li>
	<li>ステップ 5.5 から上部の段階にクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1) 500 μ L を追加し、11,000 x g (4 ° C) で 5 分間混合物を遠心分離機します。 注: 次の手順は、商業ガラス繊維フィルターを用いた RNA の隔離のメーカーの説明書から変更されたキット (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>新鮮な管に上部の段階の 500 μ L を転送換/結合バッファーの 2 つの容積 (1 mL) を追加し、上下にピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>フィルターおよびコレクション チューブ (からの RNA 抽出用キット) を組み合わせて、ピペットのフィルター チューブに 5.7 のステップからの混合物。15 のチューブを遠心分離機 x g と流れを破棄 8,000 で s。</li>
	<li>DNase バッファー、DNase の 10 μ L の 100 μ L で遠心チューブ 1.5 mL を準備・ RNase 阻害剤の 5 μ L (材料の表を参照してください)。フィルター チューブのフィルター上に調製した溶液のミックスを追加し、15-25 ° C で 20-30 分間インキュベート</li>
	<li>製造元の指示に従って洗濯の手順に従います。50 μ L の溶出バッファーを使用して、RNA を溶出します。</li>
	<li>-80 ° C で溶離された RNA を保存し、その周りにプラスチック パラフィン フィルムを置きます。同時に品質チェックを実行する 1.5 mL 遠心チューブにサンプルの数マイクロリットルを転送します。</li>
</ol>6. RNA の品質チェック ・ シーケンス
<ol><li>微量分光光度計に RNA を確認してください。 注: 260/280 吸光度比は 1.8、上はず、少なくとも 1.8、2.0 以上できれば上記 260/230 で比をはずです。</li>
	<li>実行お勧めします RNA 解析を用いた自動電気泳動装置で浄化された RNA キット (材料の表を参照してください)。RNA の整合性数 (鈴) は、続行する 7 の上以上でなければなりません。</li>
	<li>ライブラリにある、RNA シーケンスの準備とライブラリを生成する RNA のサンプルあたり 3 μ g の合計量を使用 (材料の表を参照) をキット製造元の推奨事項に従います。 注: ライブラリの準備された高スループット シーケンス プラットフォームでシーケンス処理し、ペアエンド リードが生成されました。</li>
</ol>7. データによる Web ベースのパイプラインの T-レックス
<ol><li>FASTX ツールキット バージョン 0.0.13 を使用してフィルタ リング品質を実行 (> 20 の Phred 品質スコア)。Trimmomatic ツール アダプター系列から生の RNA シーケンス読み取りをトリムします。 注: すべての下流解析は、高品質できれいなデータに基づいていた。</li>
	<li>B. mycoides ATCC 6462 NCBI ゲノム データベースをダウンロード (NCBI 加盟号: CP009692.1) と Bowtie2/2.2.3 を使用してきれいな読み取りをマッピングするための参照ゲノムとして使用します。</li>
	<li>使用 HTSeq v0.6.1 読み取り数字をカウントするのには各遺伝子にマップされ、この遺伝子に遺伝子と読み取りカウントの長さに基づいて百万マップされたリード (RPKM) の各遺伝子の転写産物のプラスミドあたりの読み取り数。</li>
	<li>T レックスのパイプラインによってデータの分析、3 つの説明的なファイルと同様に、入力として RPKM テーブルを使用: (i) 実験要因 (ii) 遺伝子発現要因を比較する対照ファイルを記述する要素ファイル、および (iii) 興味のある遺伝子のグループを記述するためのクラス ファイル。 注: 説明のファイル、in.txt 形式です。例は、T-レックス (http://genome2d.molgenrug.nl/) の web ページで見つけることができます。T-レックスを用いたデータ解析の詳細な指示された de Jongら前の文書14。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haichar, F. e. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure.">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li><li>Badri, D. V., Vivanco, J. 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著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

植物・微生物相互作用は、細菌と植物と細かく調整された平衡によって決定されるという仮説があります。このような相互作用は非常に複雑な勉強は難しい自然システムで構成されたコンソーシアムとして潜在的機能、多様な微生物種。本稿では、制御された条件下での根の分泌物に細菌の応答を研究する簡略化されたプロトコルについて説明します。根分泌物への露出に、根圏細菌のトラ?...

植物は根圏1,すなわち, 根に近い土の狭いゾーンに根を通して光合成中固定炭素の 20% まで滲出液を可能性があります。高い栄養アベイラビリティのため根は植物成長促進菌を含む、多様な微生物の適した生息地です。根の分泌物には、イオン、無機酸、酸素、水などの無機化合物の範囲が含まれています。ただし、根分泌物の大半は、低分子化合物と高分子量化合物に分けることができる有機材料によって形成されます。低分子量化合物には、アミノ酸、有機酸、糖、フェノール、脂肪酸、二次代謝産物の配列が含まれます。高分子量化合物は粘液と蛋白質の2,の3から成っています。根圏微生物は、成長と開発のため、エネルギー源としてこれらの化合物のいくつかを使用できます。根分泌物分泌物の製造工場化合物根関連細菌の挙動に影響を与える特定の遺伝子の発現に影響を与えるので rhizobacterial コミュニティの形成に重要な役割を再生します。
根分泌物に細菌の応答を理解することは、植物と微生物の相互作用メカニズムを解読の重要なステップです。植物・微生物相互作用への細菌の応答は差動遺伝子発現の製品、トランスクリプトーム解析によって学ぶことができます。このメソッドを使用して、以前の研究は、植物微生物相互作用に関与するいくつかの重要な遺伝子を特定しました。緑膿菌、新陳代謝、走化性、およびタイプ II の分泌に関与する遺伝子はテンサイ根分泌物4に対応する示されていた。ファンら。5はトウモロコシ根分泌物に対して用いて B FZB42 のトランスクリプトームのプロファイル.その結果を示すこと、強く根分泌物によって誘導される遺伝子のいくつかのグループ栄養使用率、走化性、運動性、および非リボソーム合成抗菌ペプチドとポリケチドに関連する代謝経路に関与しています。
これらの研究の精度は、根分泌物のコレクションに依存します。ただし、いくつかの方法は、異なる目的のため根分泌物のコレクションを説明した、洗練された楽器を要求または制御された条件6,7,8で実行されていません。また、根を阻害する微生物に影響を与えるルート滲出液組成植物細胞膜の透過性に影響を与える微生物9のコンソーシアムの場合は特に、根組織の損傷と。根分泌物に微生物の応答を調査するとき他の微生物10によって化合物の変質を避けるために明確に定義された条件を使用することが重要です。さらに、高品質の RNA が RNA シーケンス ベースのトランスクリプトーム研究必要です。しかし、非モデル細菌株を扱う場合、標準プロトコルまたは商業キット通常ある未知の要因または特別な成長プロパティによる低効率
ここで説明されているプロトコルは、Firmicute 門のグラム陽性、胞子形成菌であるB. mycoidesを用いて検証しました。様々 な植物の根圏におけるユビキタスです。いくつか植物成長促進プロパティは、テンサイ11、枯病菌Pythiumキュウリ12として窒素の抑制の組織的な抵抗 (ISR) の誘導を含め、この種の報告されています。ヒマワリ根13で固定。しかし、宿主植物との相互作用の分子メカニズムはよく研究されていません。
ここで示した実験の目的は、ジャガイモ根分泌物への免震 endosphere B. mycoidesのトランスクリプトーム応答を研究することです。一言で言えば、プロトコルは次の手順で構成されています: 最初に、無菌条件下でジャガイモ根分泌物を収集します。その後、根分泌物細菌細胞から高品質の RNA を抽出します。最後の手順は、web ベースの T-レックス パイプライン14を使用してデータ分析です。このプロトコルは、根分泌物との接触時に発現レベルにシフトして表示し、したがって植物微生物相互作用に重要な役割を果たす可能性があります* mycoides遺伝子を識別するために使用されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">&#160;CAS: 7681-52-9&#160;</td>
			<td style="width:339px;">10-15%&#160; active chlorine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">incubater</td>
			<td style="width:236px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Innova 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Genesys 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">liquid nitrogen</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">glass beads</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">G8893</td>
			<td>0.5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">2.0 ml tube with screw cap</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead mill homogenizer</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td style="width:152px;">607</td>
			<td>Mini_beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">centrifuge</td>
			<td style="width:236px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:152px;">5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 151-21-3&#160;</td>
			<td>10% solution prepared with DEPC treated MQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">TE buffer</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">chloroform-isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High pure RNA isolation kit</td>
			<td style="width:236px;">Roche</td>
			<td style="width:152px;">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:236px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">AM9780</td>
			<td>RNase-Zap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Automated electrophoresis instrument</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">2100</td>
			<td>Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNA quality analysis kit</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">RNA 6000 Nano kit&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase inhibitor</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">RiboLock</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Directional RNA library Prep kit</td>
			<td style="width:236px;">NEB</td>
			<td style="width:152px;">Ultra</td>
			<td style="width:339px;">For Illumina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant-microbe interaction: transcriptional response of bacillus mycoides to potato root exudates

プラント関連の有益な細菌は、成長を促進し、植物の病気を防止する重要な役割を果たします。生物肥料や防除剤として植物生育促進根圏細菌 (PGPR) のアプリケーションは従来の肥料の使用に効果的な代替となって、低コストで作物の生産性を高めることができます。植物・微生物相互作用はホスト植物分泌シグナルとここに至ってその関連細菌反応に依存します。しかし、どのように有益な細菌の分子機構は信号が完全に理解されていない、関連付けられている植物由来に応答します。根分泌物に細菌のトランスクリプトームの応答を評価する、細菌の遺伝子発現と根の条件の下で規制を決定する強力なアプローチです。そのような知識は、植物と微生物の相互作用に関与する基になるメカニズムを理解する必要です。本稿では、 B. mycoides EC18、ジャガイモの endosphere から分離されたジャガイモ根分泌物系統のトランスクリプトーム応答の研究に詳しいプロトコルについて説明します。最近の高スループット シーケンス技術の助けを借りて、いくつかの数週間、生産大規模なデータセットでこのプロトコルを実行できます。まず、 B. mycoides文化にその後追加された無菌条件下での根の分泌物を収集します。これらの文化からの RNA は、市販のキットと組み合わせるし、自動電気泳動装置による品質管理を受けるフェノール/クロロホルム メソッドを使用して分離されます。シーケンス処理の後 web ベースの T-レックス パイプラインでデータ解析が行われる、特異的発現遺伝子のグループが識別されます。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する細菌の遺伝子に新たな発見を容易にする便利なツールです。

プラント関連の微生物は、植物の成長と健康に積極的に影響します。しかし、植物と微生物の共生の間の複雑な相互作用のメカニズムは完全には理解されていません。根分泌物は rhizobacterial 活動と行動の調節に重要な役割を再生し、根分泌物に微生物の魅力と根の微生物のコロニー形成が開始されることを一般に仮定します。この作業の目的は、ジャガイモ根分泌物...

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Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌 mycoidesのトランスクリプトーム応答を勉強することです。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する重要な細菌の遺伝子の識別を容易にしは、原則として他のエンドファイトと植物で、細かな調整に適用されます。

植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

12.4K ビュー.  University of Groningen. ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌 mycoidesのトランスクリプトーム応答を勉強することです。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する重要な細菌の遺伝子の識別を容易にしは、原則として他のエンドファイトと植物で、細かな調整に適用されます。

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

生物学

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

イメージングのミスマッチ修復とのDNA損傷に対する細胞応答枯草菌</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

ジャガイモとニコティアナベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーションとPVXアグロパネクチ

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はEDTA-促進法を用いた滲出

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

代替プロモーターの使用およびマウスBcrp1の転写調節を発見する方法

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. Arabidopsis thaliana-Agrobacterium tumefaciens provides an excellent model system to study bacterial pathogenesis and plant interactions. Previous studies of plant-Agrobacterium interactions have largely relied on plant cell suspension cultures, the artificial wounding of plants, or the artificial induction of microbial virulence factors or plant defenses by synthetic chemicals. However, these methods are distinct from the natural signaling in planta, where plants and microbes recognize and respond in spatial and temporal manners. This work presents a hydroponic cocultivation system where intact plants are supported by metal mesh screens and cocultivated with Agrobacterium. In this cocultivation system, no synthetic phytohormone or chemical that induces microbial virulence or plant defense is supplemented. The hydroponic cocultivation system closely resembles natural plant-microbe interactions and signaling homeostasis in planta. Plant roots can be separated from the medium containing Agrobacterium, and the signaling and responses of both the plant hosts and the interacting microbes can be investigated simultaneously and systematically. At any given timepoint/interval, plant tissues or bacteria can be harvested separately for various &#34;omics&#34; analyses, demonstrating the power and efficacy of this system. The hydroponic cocultivation system can be easily adapted to study: 1) the reciprocal signaling of diverse plant-microbe systems, 2) signaling between a plant host and multiple microbial species (i.e.&#160;microbial consortia or microbiomes), 3) how nutrients and chemicals are implicated in plant-microbe signaling, and 4) how microbes interact with plant hosts and contribute to plant tolerance to biotic or abiotic stresses.

The described hydroponic cocultivation system supports intact plants with metal mesh screens and cocultivates them with bacteria. Plant tissue, bacteria, and secreted molecules can then be separately harvested for downstream analyses, simultaneously allowing for the molecular responses of both plant hosts and interacting microbes or microbiomes to be investigated.

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...