Wir danken Jakob Viel für seine hilfreichen Kommentare und Vorschläge. Wir danken auch Anne de Jong für seine Hilfe bei der Analyse der Bioinformatik. Yanglei Yi und Zhibo Li werden von der China Scholarship Council (CSC) unterstützt. Wir bedanken uns bei NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) für ihre finanzielle Unterstützung auf OPK.

(1) keimenden Kartoffel unter sterilen Bedingungen
<ol><li>Spülen Sie die Kartoffel-Oberfläche mit sterilem Wasser. Baden Sie die Kartoffel in 70 % igem Ethanol und dann in 3 % Natriumhypochlorit für 5 min. Spülen Sie ihn wieder mit sterilem Wasser, alle übrigen Natriumhypochlorit zu entfernen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Materialien für das Keimen und wachsen Kartoffelknollen benötigt; die Kunststoff-Töpfe, Engraftment Körbe, Vermiculit, sterilisieren und wässern durch Autoklavieren bei 121 ° C für 20 Minuten. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Materialien autoklavierbar sind. Andernfalls verwenden Sie andere Sterilisation Methoden.</li>
	<li>Setzen Sie die Oberfläche sterilisiert Kartoffel in den Engraftment Korb, und platzieren Sie diese in einem Autoklaven Pot mit nassen Vermiculit.</li>
	<li>Halten Sie den Topf in einer Klimakammer bei 24 ° C für drei Wochen. Setzen Sie ihn auf Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1) und 8 Stunden der Dunkelheit. Um mikrobielle Kontaminationen zu vermeiden, verwenden Sie ein großes Glasfaser Feld um den Pot zu decken.</li>
</ol>2. Sammeln von Kartoffel Wurzelausscheidungen
<ol><li>Wenn die Triebe sprießen, Transfer der Korb mit die ganze Kartoffel in einen sterilen Becher mit 150 mL autoklaviert deionisiertes Wasser gefüllt, mit der Kartoffel Knollen platziert oberhalb der Wasseroberfläche und die Wurzeln in das Wasser getaucht (siehe Abbildung 1). Halten Sie den Keimling in der Klimakammer, und verwenden Sie dieselben Einstellungen wie zuvor [24 ° C; Zyklen von 16 h Licht (120 µmol m-2s-1), 8 h der Finsternis].</li>
	<li>Ab dem zweiten Tag auf sammeln Sie das Wasser mit den Ausscheidungen und Nachfüllen Sie den Becher mit sterilem deionisiertes Wasser. Führen Sie die Probenahme jeden Tag bis zum siebten Tag nach der Übertragung des Keimlings.</li>
	<li>Jede Probe separat bei 4 ° c Lagern Für jede Probe verteilt 100 µL auf ein Luria-Bertani (LB; 1 % Tryptone, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCl) nährbodenplatte für mikrobielle Kontaminationen zu überprüfen. Entsorgen Sie die kontaminierten Proben.</li>
	<li>Kombinieren Sie die gesammelten Proben von einem Sämling, und durch Gefriertrocknung sie bei-40 ° C zu einem Endvolumen von 150 mL zu konzentrieren.</li>
</ol>(3) wachsenden Bakterien
<ol><li>Streifen Sie eine B. Mycoides Belastung aus einem-80 ° C Glycerin bestand auf eine LB-Agar-Platte, und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C über Nacht.</li>
	<li>Impfen Sie eine LB-Flüssigmedium mit eine einzige Kolonie von der Platte zu, und wachsen Sie die Kultur in einem schütteln Inkubator bei 200 u/min über Nacht bei 30 ° C.</li>
</ol>4. Behandlung und Beprobung von Bakterien
<ol><li>Um die Wachstumskurve der Bakterien mit Wurzelausscheidungen behandelt, um eine Negativkontrolle zu vergleichen, bereiten Sie eine Reihe von Flaschen mit 50 mL LB-Flüssigmedium. Alle Flaschen 0,5 mL die Übernachtung Bakterienkultur hinzu, und fügen Sie 0 %, 5 %, 10 % oder 15 % (V/V) Wurzel Exsudat oder sterilen deionisiertes Wasser bzw. auf das Medium.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Kultur mit entionisiertem Wasser anstelle von Wurzelausscheidungen als Kontrolle. Messung die optische Dichte bei 600 nm (OD600) jeweils 1 h danach. Generieren einer Wachstumskurs von Plotten die OD600 Werte im Vergleich zur Zeit. Hinweis: Wir haben gesehen, dass 10 % der die Wurzelausscheidungen keinen Einfluss auf das Wachstum von B. Mycoides (siehe Abbildung 2). Dieses Verhältnis wurde für RNA-Seq Experimente verwendet.</li>
	<li>Verdünnen Sie eine Übernachtung B. Mycoides -Kultur mit 90 mL vorgewärmten LB-Medium auf die anfängliche OD600 von ~ 0,05 in eine 300 mL Flasche. Die Kultur 10 mL Wurzelausscheidungen hinzu und bei 30 ° C für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 10 mL sterilem deionisiertes Wasserbehandlung als Kontrolle. Sammeln Sie Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei 9.000 x g für 2 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und sofort das Pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren, dann bis zur Verwendung bei-80 ° C lagern.</li>
</ol>(5) RNA-Isolation
Hinweis: Bevor Sie beginnen die Isolation, bereiten Sie die Werkbank, Racks und Pipetten mit einer RNase Dekontaminationslösung reinigt (siehe Tabelle der Materialien). Tragen Sie Handschuhe bei aller Zeiten, und sicherstellen, dass alle Rohre, Tipps und Lösungen sind RNase-freie. Halten Sie die Proben auf Eis wenn möglich.
<ol><li>Reinstwasser (100 µL DEPC pro 100 mL Lösung) 0,1 % (V/V) von Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC) hinzufügen, gut vermischen und über Nacht bei Zimmertemperatur aufbewahren. Autoklaven die Mischung, die DEPC nach Behandlung über Nacht zu inaktivieren. Diese DEPC-behandeltem Reinstwasser zur Vorbereitung der TE-Puffer verwenden [10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] und einer 10 % igen SDS (w/V) Lösung.</li>
	<li>Die Zelle-Pellets auf dem Eis Auftauen und jeweils in 400 µL TE (DEPC) Puffer auszusetzen. Übertragen Sie die Suspensionen in 2 mL Schraubverschluss Rohre.</li>
	<li>Premix 300 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1 V/V) und 300 µL Phenol (saure Phenol, RNA-Klasse), und die Mischung für 5 min stehen lassen. Nehmen Sie 500 µL der oberen organischen Phase die resuspendierte Zellen hinzu. Dann fügen Sie 50 µL 10 % SDS und 0,5 g Glasperlen (0,5 µm) in die Röhre.</li>
	<li>Schließen Sie den Deckel fest und legen Sie das Rohr in eine Rührwerksmühle Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien). Führen Sie eine 3 × 45 s Puls Homogenisierung mit einem Intervall von 1 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 11.000 x g (4 ° C) und übertragen Sie die obere Phase auf einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Die obere Phase ab Schritt 5.5 500 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1) hinzu und Zentrifugieren Sie die Mischung für 5 min bei 11.000 x g (4 ° C). Hinweis: Die folgenden Schritte wurden geändert von Anweisungen des Herstellers eine kommerzielle Glasfaser filterbasierte RNA Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Übertragen Sie 500 µL der oberen Phase auf einem frischen Rohr, fügen Sie 2 Bände (1 mL) eines Puffers Lyse/Bindung hinzu und mischen Sie es durch pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Filter und Sammlung Röhrchen (aus dem RNA-Isolierung-Kit) und pipette die Mischung aus Schritt 5.7 mit dem Filter-Rohr. Zentrifugieren Sie die Rohre für 15 s bei 8.000 x g und entsorgen der durchströmten.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 µL DNase Puffer, 10 µL der DNase I und 5 µL RNase-Inhibitor (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie die fertige Lösung mischen auf dem Filter der Filter-Röhre, und 20-30 Minuten bei 15-25 ° c inkubieren</li>
	<li>Der Wasch-Schritte nach Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 50 µL eines Puffers Elution, um die RNA zu eluieren.</li>
	<li>Speichern der eluierten RNS bei-80 ° C und einen Kunststoff Paraffin Film um ihn herum. Zum gleichen Zeitpunkt übertragen Sie wenige Mikroliter der Probe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch einen Qualitäts-Check durchführen.</li>
</ol>(6) RNA-Qualitäts-Check und Sequenzierung
<ol><li>Überprüfen Sie die RNA mit einem Microvolume Spektrophotometer. Hinweis: Extinktion Verhältnisse bei 260/280 sollte über 1,8 und Kennzahlen auf 260/230 sollte über mindestens 1,8, vorzugsweise über 2.0.</li>
	<li>Lauf die gereinigte RNA in automatisierte Elektrophorese Instrument mit der empfehlen-RNA-Analyse kit (siehe Tabelle der Materialien); die RNA-Integrität-Anzahl (RIN) muss mindestens über 7 um fortzufahren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Gesamtbetrag von 3 µg RNA pro Probe, um Bibliotheken mit einer RNA-Seq-Bibliothek-Vorbereitung zu generieren kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Empfehlungen des Herstellers. Hinweis: Die Bibliothek Vorbereitungen wurden auf einer Plattform von Hochdurchsatz-Sequenzierung sequenziert und gepaart Ende liest generiert wurden.</li>
</ol>(7) Datenanalyse mit Hilfe den Web-basierten Pipeline T-REx
<ol><li>Führen Sie eine Qualität Filterung mit dem FASTX-Toolkit Version 0.0.13 (Phred Qualitätsfaktoren von > 20). Schneiden Sie die rohen RNA-Seq liest aus dem Adapter-Sequenzen mit dem Trimmomatic-Werkzeug. Hinweis: Die nachfolgenden Analysen beruhten auf saubere Daten mit hoher Qualität.</li>
	<li>Laden Sie die B. Mycoides ATCC 6462 NCBI-Genom-Datenbank (NCBI Beitritt Nr.: CP009692.1) und verwenden Sie es als eine Referenz-Genom für die Zuordnung der sauberen liest mit Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Verwendung HTSeq v0.6.1 liest Zahlen zählen, jedes Gen zugeordnet und die Lesevorgänge pro Kilobase Abschrift pro million zugeordneten liest (RPKM) jedes Gens basierend auf der Länge der Anzahl der Gene und liest dieses Gen zugeordnet.</li>
	<li>Für die Analyse der Daten von der T-REx-Pipeline, verwenden Sie die RPKM-Tabelle als Eingabe sowie drei beschreibenden Dateien: (i) eine Datei Faktoren zu beschreiben, das Experiment in Faktoren, (Ii) eine Kontraste-Datei zu definieren, welche Faktoren für differenzielle Genexpression verglichen werden , und (Iii) eine Klassendatei um Gruppen von Genen von Interesse zu beschreiben. Hinweis: Die beschreibenden Dateien sind in.txt Format. Beispiele finden Sie auf der Webseite von T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Eine detaillierte Anleitung für die Datenanalyse mit T-REx finden Sie in einer früheren Publikation von de Jong Et al. 14.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Pflanze-Mikroben-Interaktionen haben vermutet, um durch ein fein abgestimmtes Gleichgewicht zwischen Bakterien und Pflanzen bestimmt werden. Solche Interaktionen sind sehr komplex und schwierig zu studieren in ein natürliches System, umfasst verschiedene Mikrobenarten, potenziell als Konsortien. Dieses Whitepaper beschreibt ein vereinfachtes Protokoll, um die bakterielle Reaktion auf Wurzelausscheidungen unter kontrollierten Bedingungen zu studieren. Das Transkriptom-Profil des standarddüngung, bei Kontakt mit Wurzelau...

Pflanzen können Exsudat bis zu 20 % des Kohlenstoffs in der Rhizosphäre1, d. h., die schmale Zone des Bodens in der Nähe der Wurzeln während der Photosynthese durch Wurzeln fixiert. Durch die höhere nährstoffverfügbarkeit ist die Rhizosphäre einen geeigneten Lebensraum für verschiedene Mikroorganismen, einschließlich der Förderung des Pflanzenwachstums Bakterien. Die Wurzelausscheidungen enthalten eine Reihe von anorganischen Verbindungen wie Ionen, anorganische Säuren, Sauerstoff und Wasser. Jedoch wird der Großteil der Wurzelausscheidungen von organischen Materialien, gebildet, in niedermolekulare Verbindungen und hochmolekularen Verbindungen unterteilt werden kann. Die niedermolekularen Verbindungen enthalten Aminosäuren, organische Säuren, Zucker, Phenolverbindungen, Fettsäuren und eine Reihe von sekundären Pflanzenstoffen. Die hochmolekularen Verbindungen bestehen aus Schleim und Proteine,2,3. Rhizosphäre Mikroorganismen können einige dieser Verbindungen als Energiequelle für Wachstum und Entwicklung. Die Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Wurzelbakterien Gemeinschaft, da die Pflanze produziert Verbindungen in die Exsudate durch Einwirkung auf die Expression bestimmter Gene das Verhalten der Rhizosphäre-assoziierte Bakterien beeinflussen können.
Verständnis der bakteriellen Antwort auf Wurzelausscheidungen ist ein wichtiger Schritt bei der Entschlüsselung wechselwirkungsmechanismen Pflanze-Mikroben. Da die bakterielle Reaktion auf Pflanze-Mikroben-Interaktionen das Produkt der differentiellen Genexpression, kann es durch die Transkriptom-Analyse untersucht werden. Mit dieser Methode, identifiziert frühere Studien mehrere wichtige Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. In Pseudomonas Aeruginosawurden Gene, die im Stoffwechsel, Chemotaxis und Typ II-Sekretion zur Beantwortung von Zuckerrüben Wurzel Exsudate4gezeigt. Ventilator Et Al. 5 studierte die transkriptomischen Profilierung der B. Amyloliquefaciens FZB42 als Reaktion auf Mais Wurzelausscheidungen. Ihre Ergebnisse zeigen, dass die Gene, die stark durch die Wurzelausscheidungen induziert, Stoffwechselwege in Bezug auf Nährstoff Auslastung, Chemotaxis, Motilität und nicht-ribosomale Synthese von antimikrobiellen Peptiden und Polyketides mehrere Gruppen beteiligt sind.
Die Genauigkeit dieser Studien stützt sich auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen. Obwohl mehrere Methoden der Sammlung von Wurzelausscheidungen für verschiedene Zwecke beschrieben haben, entweder verlangen ausgeklügelte Instrumente oder sind nicht in kontrollierten Bedingungen6,7,8durchgeführt. Darüber hinaus können Hemmung der Rhizosphäre Mikroorganismen Wurzel Exsudat Zusammensetzung beeinflussen, indem Pflanze Zellmembran Durchlässigkeit beeinträchtigen und schädigen die Wurzel Gewebe, insbesondere im Falle von Konsortien von Mikroorganismen9. Bei der Untersuchung der mikrobiellen auf Wurzelausscheidungen ist es wichtig, genau definierte Bedingungen zu verwenden, um Veränderung der Verbindungen durch andere Mikroorganismen10zu vermeiden. Darüber hinaus ist qualitativ hochwertige RNA erforderlich für RNA-Seq Transkriptom-Studien. Jedoch haben beim Umgang mit nicht-Modell-bakterielle Belastungen, die standard-Protokolle oder kommerziellen Kits in der Regel eine geringe Effizienz durch unbekannte Faktoren oder spezielle Wachstumseigenschaften.
Das hier beschriebene Protokoll wurde mit B. Mycoides, das ist ein grampositives, Spore bildet Bakterium Firmicute Phylum überprüft. Es ist allgegenwärtig in der Rhizosphäre der verschiedenen Pflanzenarten. Für diese Spezies, einschließlich Induktion des systematischen Widerstandes (ISR) in Zuckerrüben11, Hemmung der Dämpfung-off-Erregers Pythium Gurke12sowie Stickstoff wurden mehrere Pflanze Förderung Wachstumseigenschaften gemeldet. Fixierung in der Sonnenblume Rhizosphäre13. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Interaktion mit einer Wirtspflanze nicht gut untersucht.
Das Ziel der hier vorgestellten Experimente ist es, die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert B. Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Kurzum, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: zunächst sammeln Kartoffeln Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen. Ziehen Sie dann, qualitativ hochwertige RNA aus Bakterienzellen mit Wurzelausscheidungen behandelt. Der letzte Schritt ist die Analyse der Daten mithilfe der webbasierten T-REx Pipeline14. Dieses Protokoll wurde verwendet, um B. Mycoides Gene zu identifizieren, die zeigen eine Verschiebung im Ausdruck Niveaus beim Kontakt mit Wurzelausscheidungen und damit möglicherweise eine wichtige Rolle in Pflanze-Mikroben-Interaktionen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">&#160;CAS: 7681-52-9&#160;</td>
			<td style="width:339px;">10-15%&#160; active chlorine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">incubater</td>
			<td style="width:236px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Innova 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Genesys 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">liquid nitrogen</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">glass beads</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">G8893</td>
			<td>0.5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">2.0 ml tube with screw cap</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead mill homogenizer</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td style="width:152px;">607</td>
			<td>Mini_beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">centrifuge</td>
			<td style="width:236px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:152px;">5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 151-21-3&#160;</td>
			<td>10% solution prepared with DEPC treated MQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">TE buffer</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">chloroform-isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High pure RNA isolation kit</td>
			<td style="width:236px;">Roche</td>
			<td style="width:152px;">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:236px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">AM9780</td>
			<td>RNase-Zap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Automated electrophoresis instrument</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">2100</td>
			<td>Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNA quality analysis kit</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">RNA 6000 Nano kit&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase inhibitor</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">RiboLock</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Directional RNA library Prep kit</td>
			<td style="width:236px;">NEB</td>
			<td style="width:152px;">Ultra</td>
			<td style="width:339px;">For Illumina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant-microbe interaction: transcriptional response of bacillus mycoides to potato root exudates

Pflanze-assoziierte Bakterien spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung von Wachstum und Verhütung von Krankheiten bei Pflanzen. Die Anwendung der Pflanze wachstumsfördernde standarddüngung (PGPR) als biodüngemittel oder Biocontrol Mittel geworden eine effektive Alternative zu der Verwendung von herkömmlichen Düngemitteln und Ernte-Produktivität bei geringen Kosten zu erhöhen. Pflanze-Mikroben-Interaktionen abhängig Host Pflanze abgesondert Signale und eine Reaktion hereon durch ihre assoziierten Bakterien. Die molekularen Mechanismen der wie nützlichen Bakterien reagieren jedoch auf die damit verbundenen pflanzliche, dass Signale nicht vollständig verstanden sind. Beurteilung der transkriptomischen auf der Bakterien Wurzelausscheidungen ist ein leistungsfähiger Ansatz um die bakterielle Genexpression und Verordnung unter rhizospheric Bedingungen zu bestimmen. Solches Wissen ist notwendig, die zugrunde liegenden Mechanismen Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu verstehen. Dieses Whitepaper beschreibt ein detailliertes Protokoll um die transkriptomischen Antwort von B. Mycoides EC18, ein Stamm von der Kartoffel Endosphere, Kartoffel Wurzelausscheidungen isoliert zu studieren. Mit Hilfe der jüngsten Hochdurchsatz-Sequenzierung-Technologie kann dieses Protokoll in mehreren Wochen und produzieren massive Datasets durchgeführt werden. Zunächst sammeln wir die Wurzelausscheidungen unter sterilen Bedingungen, nach denen sie B. Mycoides Kulturen hinzugefügt werden. Die RNA aus diesen Kulturen ist isoliert mit einem Phenol/Chloroform-Methode kombiniert mit einem kommerziellen Kit und durch automatisierte Elektrophorese Instrument einer Qualitätskontrolle unterzogen. Nach der Sequenzierung, Datenanalyse erfolgt mit der Web-basierten T-REx-Pipeline und eine Gruppe von differentiell exprimierten Genen identifiziert. Diese Methode ist ein nützliches Werkzeug, um neue Entdeckungen auf die bakterielle Gene in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu ermöglichen.

Pflanze-assoziierten Mikroorganismen können Wachstum und die Gesundheit positiv beeinflussen. Allerdings sind die Mechanismen die komplexen Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und ihre mikrobiellen Symbionten nicht vollständig geklärt. Wurzelausscheidungen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Wurzelbakterien Aktivität und Verhalten, und es wird in der Regel postuliert, dass die mikrobielle Besiedlung der Wurzeln mit dem Reiz der Mikroben zu Wurzelausscheidungen initiiert...

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Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

12.5K Aufrufe.  University of Groningen. Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll die transkriptomischen Reaktion der Endosphere isoliert Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen zu studieren. Diese Methode erleichtert die Identifizierung von wichtigen bakteriellen Gene Pflanze-Mikroben-Interaktionen beteiligt und gilt grundsätzlich für andere Endophyten und Pflanzen, mit geringfügigen Anpassungen.

Serie: Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana Und Tomaten

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Forschung

Biologie

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

Imaging Mismatch Reparatur und zellulären Reaktionen auf DNA-Schäden in Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Mit der optokinetischen Reaktion auf visuelle Funktion des Zebrafisch-Studie

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Agroinfiltration und PVX Agroinfektion in Kartoffel und Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

Sammlung und Analyse von<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloemexsudaten Mit der EDTA-Methode erleichtert

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR Vector Konstruktion und Charakterisierung von DNA-Modifikationen durch Erzeugung von Tomaten Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Pflanze-Mikroben-Interaktion: Transcriptional Antwort des Bacillus Mycoides auf Kartoffel Wurzelausscheidungen

Zusammenfassung

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